多糖生物膜在骨组织工程中应用的实验研究

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作者：倪建光，刘丹平，韩宝芹

【摘要】

目的 在骨组织工程的载体外包裹多糖生物膜(psbm)，减少种子细胞在复合载体时的外溢逃出，验证其在组织工程中应用的可行性。方法 用全骨髓法获得骨髓基质干细胞，体外扩增后，取第三代细胞种植于支架材料载体多孔纳米磷灰石－硅灰石生物活性玻璃陶瓷/壳聚糖复合支架材料（a-w-mgc/cs）上，分2 组，实验组载体外用多糖生物膜物理包裹，对照组不包裹多糖生物膜，观察载体外培养皿上的细胞生长数量；mtt检测细胞活力；电镜观察载体上细胞粘附生长情况。结果 实验组培养板上载体外漏细胞较少，对照外漏细胞较多：mtt检测两组细胞活力差别无显著性（p＞0.05）；电镜观察实验组载体上细胞粘附生长较对照组稍优。结论 多糖生物膜在骨组织工程中具有应用前景。

【关键词】 多糖生物膜 骨髓基质干细胞（bmscs） 支架材料 组织工程

abstract: objective to pack bone tissue engineering carrier with polysaccharide biomembrane to decrease seed-cells? leaking, and to authenticate the feasibility of applying polysaccharide biomembrane in bone tissue engineering. methods bone marrow stromal cells were derived through whole-bone-marrow method, and, after amplification in vitro, the cells of the third generation were implanted in a-w-mgc/cs. then the cells were divided into two groups-an experimental group with carrier packed with psbm and a control group with carrier un-packed. the number of cell growing in culture dish out of the carrier was observed，the state of cell vigor was detected with mtt, and the state of cell adhesion was observed with electron microscope. results the number of leaking cell in the experimental group was less than that in the control group. the result of mtt detection showed that difference of cell vigor between two groups was un-significant (p＜0.05). the growing state of cell in the experimental group was better than that in the control group under electron microscope. conclusions polysaccharide biomembrane has an applied prospect in bone tissue engineering.

key words：polysaccharide biomembrane; bone marrow stromal stem cell; bracket material; tissue engineering

骨组织工程的核心是在体外培养细胞，然后将细胞种植到具有一定结构的三维支架上，再将这种细胞生物材料复合体植入骨缺损部位，通过生物过程使细胞长入多孔支架中，即经过细胞间相互粘附、增殖、分化，分泌细胞外基质最终形成具有一定结构和功能的组织或器官，从而达到骨修复的目的。细胞和支架材料的相互作用又起到关键的作用，减少细胞复合材料又未贴附在支架材料这段时间的外漏，可以有效的减少种子细胞的损失，增加细胞与支架材料之间的作用时间，更利于细胞粘附。由中国海洋大学生命学院研制的多糖生物膜（polysaccharide biomembrane,psbm）是一种安全无毒，具有很好生物相容性的细胞培养移植载体。多糖生物膜是由壳聚糖衍生物（羧甲基壳聚糖）、透明质酸及明胶按特定比例混合制成的膜型制剂。其分子量约为2 000da，透水率为10μl/（min·cm2）。为了提高载体内外液体中大分子物质的流通，我们用显微穿刺的方法在多糖生物膜上增加孔隙（直径约为20μm、孔间距为100～150 μm）。耿燕、王晓莉［1，2］等将其应用于眼科的研究。本实验研究将多糖生物膜应用于骨组织工程的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2～3 月龄清洁级日本大耳白兔1 只，体重1.5 kg，由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.2 实验材料

多孔纳米磷灰石－硅灰石生物活性璃玻陶瓷/壳聚糖复合支架材料（a-w-mgc/cs）（由四川大学无机非金属材料系周大利教授课题组提供），多糖生物膜（中国海洋大学生命学院提供），高糖dmem（gibco），胎牛血清(北京华美)，hepes（北京华美）,0.25％胰酶，mtt，二甲基亚砜，96孔一次性培养板，co2培养箱，倒置相差显微镜，jsm-5900lv扫描电镜。

1.3 实验方法

1.3.1 bmscs的分离培养

取1.5～2 月龄的日本大耳白兔，雌雄不限，速眠新ii(0.2 ml/kg)肌注麻醉，无菌条件下于胫骨上端抽取约4 ml骨髓，在超净工作台上将骨髓加入无菌培养瓶中，再加入4 ml含10%胎牛血清的dmem培养液(以下称生长培养基)充分吹打，按每瓶2 ml加入到30 cm2的培养瓶中，补充2 ml的生长培养液，放入37 ℃、5%co2恒温细胞培养箱中培养。5天后首次换液，以后每3 天换液1 次，在倒置显微镜下观察细胞生长情况。待贴壁细胞接近80%融合后，结束原代培养。吸去生长培养基，用无血清dmem洗1 次，加入0.25%胰蛋白酶1.5 ml/瓶消化3～5分钟，并在倒置显微镜下观察消化效果。当有部分细胞脱壁、大部分细胞间隙变大时加入生长培养基3.0 ml/瓶终止消化。细胞沉淀用生长培养基吹打成单细胞悬液并按1∶3比例分装传代，以后每3 d换液1 次。

1.3.2 bmscs复合a-w-mgc/cs及包裹多糖生物膜

将制作好的a-w-mgc/cs（12 mm×5 mm×5 mm），孔径在100～500 μm，孔隙率为80%～90%，经环氧乙烷消毒后放置1 个月，用前pbs冲洗3 遍，用不含胎牛血清的dmem培养液浸泡置于37 ℃、5%co2恒温细胞培养箱中7 天，去掉培养液，在培养箱中自然晾干待用。将多糖生物膜修剪成5 cm×3 cm大小（见图1），浸泡于0.05 m的磷酸盐缓冲液24 小时（中间换液1 次），121℃高压湿热灭菌。手工将多糖生物膜从底面及侧壁包裹晾干的a-w-mgc/cs复合支架材料可吸收线系好备用（见图2）。取第三代bmscs消化离心制成1×106的细胞悬液种植于实验组包裹有经穿刺过的多糖生物膜的a-w-mgc/cs上，另一组细胞直接种植a-w-mgc/cs上，每组6 块，放入24 孔培养板上，在37 ℃，5％co2饱和湿度的孵箱中孵育。2 h后翻面，4 h后加入20％fbs的基础培养液，每孔1.5 ml，培养7 d，隔天更换培养液。

1.4 检测项目

1.4.1 mtt值测定增值曲线的绘制

取第三代生长细胞种植于96孔培养板上，分2 组，实验组为浸泡有多糖生物膜的生长培养液，对照组为正常生长培养液。每板种植21 个孔，每孔接种2×103个细胞，200 μl培养液，每48 小时换液。每日取3 孔细胞，观察细胞生长情况，加入20 μlmtt，4 h后尽量吸弃孔内培养液，加入150 μl二甲基亚砜，振荡10 min，以490 nm为测量波长，以空白孔为对照，用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度值【d（490）】，根据mtt值绘制细胞增殖曲线。

1.4.2 倒置显微镜观察培养板上细胞外漏情况

24 小时后取24 孔培养板，在倒置显微镜下观察支架材料外，培养板底外漏的细胞贴壁生长情况并细胞计数，细胞实际种植数=细胞种植总数-培养板底部外漏细胞数。种植率=细胞实际种植数／细胞种植总数×100%。

1.4.3 电镜观察支架材料上细胞贴附生长情况

将联合培养7 d的细胞与支架复合体标本分别取出后，pbs洗3 次后， 2.5%戊二醛常温下固定，60%～100%的乙醇梯度脱水，乙酸异戊酯置换。临界点干燥，表面喷金，jsm-5900lv扫描电镜分析。

1.4.4 统计学处理

采用spss14.0软件对数据进行分析，数据用±s表示，采用t检验进行组间比较，p＜0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mtt实验结果

根据每日不同d（490）均值为数据，绘制细胞增殖曲线(见图3)。结果显示：浸泡有多糖生物膜的实验组与对照组比较差异无统计学意义。（p＞0.05）说明细胞在浸泡有多糖生物膜的生长培养基的生长增殖不受影响。

2.2 倒置显微镜观察培养板上细胞外漏结果并计数细胞数

24小时后倒置显微镜下观察放有支架材料的24孔培养板的底面并细胞计数（见表1），如图4，图5所示，可见实验组外漏细胞较少，而对照则较多。

表1 24孔培养板的底面细胞计数（略）

注：p＜0.05,实验组和对照组差异有统计学意义

实验组细胞实际种植数为8.8×105，种植率为88%；对照组细胞实际种植数为5.3×105，种植率为53%。

2.3 电镜观察支架材料上细胞贴附生长情况

如图6，图7所示，可见细胞在支架材料上贴附生长良好，实验组细胞呈不则球形，分布均匀，密度较大；对照组细胞分布不均匀，密度较少。

3 讨论

骨组织工程骨的体外构建要求最大限度的保证使用的种子细胞参与成骨,减少种子细胞的流失。在实验中我们发现在细胞与载体复合时，细胞在载体内的滞留与粘附是至关重要的两个方面。细胞与支架材料表面的接触、黏附及相互作用是组织工程学的第一步。细胞必须与材料黏附［3］,才能进行迁移、分化和增殖。这种黏附作用在材料方面与材料的组成,亲/疏水性,表面能拓扑结构及其表面的生物特异性活集团等因素有关。为了提高细胞与支架材料间的黏附能力,对支架材料进行必要的改性是非常必要的。近年来，对各种支架材料表面的亲和力，粘附作用的研究较多，大多数解决的都是细胞在载体上粘附的问题［4-6］。而细胞在载体上的滞留时间，不仅影响到种子细胞的流失和数量，更间接影响细胞与支架材料的粘附，因此增加细胞在载体上的滞留时间，可以有效的解决这个问题。

细胞在细胞接种至载体表面时，由于重力作用，细胞在载体中下沉从孔隙中溜出而不能有效的贴附。另外支架材料的侧壁有较多的空隙，细胞可以从这些空隙中溜出。因此我们用多糖生物膜采用物理包裹的方法，将支架材料从底面及侧壁包裹好，可以有效减少细胞的损失。

多糖生物膜有三个特性：其一是具有可通透性，即它具有半透膜性质（透）水率10 μl/min·cm2、分子量在2 000 da的物质可自由通过）；其二，此膜对细胞有良好的粘着力，非常适合细胞的贴壁生长；其三，此膜可吸收。为了提高载体内外液体中大分子物质的流通，我们用显微穿刺的方法在膜上增加孔隙（直径约为20 μm、孔间距为100～150 μm）。实验中，我们用mtt法，检测多糖生物膜对bmscs的增殖及活性的影响，发现此膜有很好的生物相容性，不影响细胞的生长增殖，无细胞毒性。mtt比色法［7，8］，是一种检测细胞存活和生长的方法，可间接反映活细胞数量,也是接触法检测材料细胞毒性的最常用的一种方法。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

实验中，支架材料所在的培养板底外漏细胞的减少，实验组细胞实际种植数较没有包裹多糖生物膜的对照组高出35%，有效的减少种子细胞的损失；电镜照片载体上细胞粘附情况，均反映了经过多糖生物膜包裹的支架材料上，细胞较长时间的滞留，可以增加细胞与支架材料的粘附，及其在上面生长增殖，并验证了多糖生物膜在骨组织工程领域的作用。（此文图1-7见附页3-4）

【参考文献】

［1］ 耿燕，杨朝忠. 多糖生物膜细胞载体特性的实验研究［j］.眼科研究，2003， 21（5）：501-504.

［2］ 王晓莉，李树宁. 多糖生物膜眼内生物相容性［j］.眼科新进展，2002，22（2）:99-102.

［3］ 段智霞，郑启新. bmscs在plga-【asp-peg】基质材料表面粘附及殖的研究［j］.中国生物工程杂志，2006，26（12）：86-91.

［4］ sakiyama,elbert se, hubbell ja.et al. functional biomaterials；design of novel biomaterials［j］. annu revmater res, 2001, 31:183-201.

［5］ 郭军，马丽，刘邦得，等，壳聚糖应用进展研究［j］. 东北电力大学学报， 2005， 26（1）：60-64.

［6］ 王红梅， 陈庆华， 潘兴华，等 .羟基磷灰石磷酸三钙甲壳素复合多孔支架材料的制备及生物相容性研究［j］. 组织工程与重建外科杂志,2006， 2（1）：21-24.

［7］ 徐爱风，方玉，侯本祥，等. 天然生物膜的细胞毒性的实验研究［j］.北京口腔医学，2004，12(1)：30-31.

［8］ 薄华本，邵红伟，等.细胞活性检测方法优化［j］.中国实用医药， 2008， 3（21）：23-25.