雷斯青霉发酵特性影响

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引言

发酵过程中发酵液流变特性变化会对物质和能量的传递产生重要影响［1］。在甾体的生物催化过程中，甾体底物溶解度极低(10－5～10－6mol/L)，严重影响甾体生物催化的效率，在发酵液中加入亲水性有机溶剂是降低底物传质限制的较为有效手段［1］。目前，研究人员对不同霉菌发酵液流变特性参数与菌体形态相关参数的关系进行了研究，并建立相关模型［2，3］。但促溶剂对于霉菌发酵液流变特性和菌体形态影响方面研究较少。本文以雷斯青霉15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物转化为模型，研究添加促溶剂对发酵液的流变特性及菌球形态的影响，该研究对于今后发酵过程控制具有重要的指导意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料雷斯青霉(PenicilliumraistrickiiATCC10490)购自美国典型菌种保藏中心。

1.1.2仪器5L发酵罐(B.BraunBiotechInternational，3.5L工作体积);顺磁氧分析仪(Magnos4G，德国H＆B公司);ARES旋转流变仪(美国TA仪器公司);SmartSeape2000系统(上海复日公司);KYKY－AMRAY1000B扫描电子显微镜(中科院北京科学仪器研制中心)。

1.1.3培养基培养基(g/L):葡萄糖30，玉米浆10，NaNO32，KH2PO41，K2HPO42，MgSO40.5，FeSO40.02，KCl0.5，pH7.0～7.5，121℃灭菌20min。1.2方法1.2.1培养方法取雷斯青霉的斜面1支，加入10mL无菌水洗下孢子后，倒入装有玻璃珠的250mL三角瓶中振荡打散，得孢子悬液。接种在装有30mL培养基250μml三角瓶中，使孢子终浓度为107个/mL，转速180r/min、28℃、振荡培养约24h后，以5%接种量接种于5L发酵罐中(B.BraunBiotechInternational，3.5L工作体积)，28℃、180r/min振荡培养约36h后，按3g/L的投料量加入左旋乙基甾烯双酮底物和4%的1，2丙二醇。转化条件:温度28℃，摇床转速180r/min。

1.2.2菌球形态观察取转化36h的菌体，用磷酸缓冲液洗涤后，2.5%戊二醛和1%的锇酸双重固定，0.1mol/L磷酸缓(PBS)冲液漂洗，梯度乙醇溶液脱水，六甲基二硅胺烷法干燥，KYKY离子溅射仪喷金，KYKY－AMRAY1000B扫描电镜观察并拍照。

1.2.3流变特性研究在恒温(25℃)下，用ARES旋转流变仪(美国TA仪器公司)分别对不同发酵时间的发酵液进行取样测定，得到不同剪切应变率下的剪应力和表观黏度。霉菌发酵液大多数表现非牛顿流体特性［4］，其剪应力τ可以表示为:τ=K•γn(1)式(1)中，K为稠度系数:n为流动指数，二者是流变特性的重要指标。γ是剪切应变率，表观黏度值可以表示为:μ0=τγ=K•γn－1(2)

1.2.4体积氧传递系数的测定体积氧传递系数测定:利用顺磁氧分析仪(Magnos4G，德国H＆B公司)对尾气O2进行在线测定，按照文献［5，6］的静态法测定体积氧传递系数(KLa)，MettlerToledoDO传感器在线检测溶氧。

2结果与分析

2.1促溶剂对菌球形态的影响目前，关于添加促溶剂促进底物溶解进而提高产率的研究较多，但促溶剂对于菌体的形态的影响鲜有报道，环境条件的改变以及促溶剂的毒性对于菌体的生长可能产生非常大的影响。本实验对添加促溶剂的菌球形态进行了研究，结果如图1所示。由图1可以看出，添加促溶剂前的菌球表面菌丝较短，中间紧密结实，在发酵后期，中间菌丝因缺乏营养自溶腐烂，由黄白色变成了黑褐色，这种形态的菌体不利于菌丝生长，更影响了转化。添加促溶剂后，菌球的外部菌丝变长，内部核心区域结构较为疏松，菌球形态的变化也对发酵液体流变特性产生相应的影响，从而有利于菌体吸收营养，促进底物与菌体的接触，从而使产率得到提高。

2.2发酵液流变特性实验分别在发酵早期36h、中期72h以及后期100和120h进行取样，检测发酵液黏度随剪切应变率的变化，如图2所示:无论添加促溶剂与否，发酵过程中的发酵液均符合幂律公式(2)(图2a)。因此雷斯青霉发酵液属于典型的非牛顿流体(n＜1)，即发酵液的黏度随剪切应变率的增加而降低(图2b)。而在发酵不同时间，其稠度系数变化明显，从发酵开始至中期(72h)，发酵液的稠度系数(k)由1.01逐渐增加到3.26，之后又逐渐降低，流动指数变趋势与之相反，由36h的0.51减少到72h的0.39，之后又逐渐增加。在发酵末期(100h)，与未添加促溶剂的发酵液相比，添加促溶剂后发酵液的稠度系数降低17%，流动指数相应有所增加，增幅大约为8.7%，说明添加促溶剂后导致发酵液的表观黏度降低。2.3KLa和K的相关性发酵过程中氧的传递除受转速、通气等操作因素影响外，与发酵液的黏度也密切相关，图3是体积氧传递系数KLa和K在发酵过程中的相关变化情况(发酵20h后转速和通气量恒定)。由图3可知，36h前体积氧传递系数KLa随稠度系数增加而减小，之后随稠度系数减少而增大，72h左右KLa最大，此后随转化的继续进行，又呈降低趋势。

3讨论

发酵过程中的菌丝形态特征与菌体的生理活性及代谢产物的生产能力关系密切，因此菌丝的形态常被看作工业生产上一个非常关键的指标［6－8］。在甾体生物催化工业，促溶剂的添加主要用于提高底物的溶解度以增加传质，但添加量有限，因为有机溶剂对菌体具有毒性，影响菌体的生长及转化活力。在本实验中，4%1，丙二醇在发酵过程中对于菌体表现出较小的毒性，但如图1所示，添加促溶剂后，菌球结构变得比较疏松，推测促溶剂的添加可能导致发酵液流体特性发生变化，进而在一定程度上影响菌体的生长和菌球形态。有大量报道认为发酵液的表观黏度与菌体的生物量密切相关［9］。在本实验中，添加底物后，在发酵中期72h生物量达到最大，因此表观黏度最高，后期由于底物对菌体的毒性，造成大量的菌球表面菌丝长度大量减少，表观黏度降低。此外，由图2还可以看出，发酵液的表观黏度随着促溶剂的添加随之降低。因此，添加促溶剂后不仅能够增加底物的溶解度，还能够降低发酵液的黏度，从而有利于促进底物的溶解及传递，从而提高产物生成的速率和效率。在发酵过程中，由于微生物分解并利用培养液中的基质，大量繁殖菌体，积累代谢产物等等都引起培养液的性质的改变，对氧传递系数KLα带来很大的影响。其中发酵液黏度的改变表现出与氧传递系数KLa负相关的趋势［10］。如图3，在36h前，菌体处于快速生长时期，在培养基中自由扩散或粘连在一起形成聚集体。随着菌体生物量的增加，发酵液的黏度加大，导致氧传递系数降低。在发酵中期72h，雷斯青霉菌丝聚集体在剪切力作用下形成菌球，导致发酵液黏度减小，氧传递系数升高。在发酵后期，由于发酵液中培养基的减少及底物产物对于菌体的毒害作用，雷斯青霉菌球形态发生变化，终期导致菌体的自溶，从而使发酵液黏度开始上升，氧传递系数变小。此外，如图3所示，添加促溶剂后，发酵液的黏度变小，流动性增加，氧传递系数也随之增加，有利于发酵过程物质和能量的传递，从而对菌球体形态以及提高产率产生有利的影响。根据KLa值和K的相关性，根据所测KLa值，我们可以对发酵液流变特性进行预测，并借此推测菌体生长与产物生成的情况，有利于改变实验操作，通过发酵液流变特性的改变，达到提高产率的目的。4结论本文研究了添加促溶剂对雷斯青霉发酵过程中菌体形态和发酵液流变特性的影响，结果表明，添加促溶剂后，发酵液的表观黏度降低，表明添加促溶剂不仅能够增加底物的溶解度，还能够增加底物在发酵液中的分散及传递，从而提高产物生成的速率和效率。