2008―2012奉化市成人麻疹临床分析与病毒基因特征研究

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摘要：目的：应用分子生物学方法检测奉化市2008-2010年成人感染麻疹病毒，分析麻疹病毒基因特性，了解成人麻疹的发病原因，为麻疹监测和防治提供依据。方法：收集100例成人麻疹患者的咽拭子和血清，应用逆转录-聚合酶链反应扩增麻疹野毒株的白（N）基因碳末端的456个核苷酸并进行核苷酸序列测定，与基因库中按照病毒各基因型参考株比较并分析毒株变异情况。结果：奉化市成人麻疹临床表现典型，分离到的麻疹病毒均为H1基因型，与H1型参考株的核苷酸同源性为97.1%-98.0%，与中国疫苗株沪191的核苷酸/氨基酸差异为8.0-9.0%/9.8-14.5%。

关健词：成人麻疹 流行病学 病毒基因 资料与方法

基金项目：宁波市科技局计划项目（200901C4010039），国家“十一五”专项（2009ZX10601）

一、 研究对象

2008年1月-2012年6月在奉化市人民医院感染科住院或门诊共诊治的18岁以上成人麻疹患者100例。均经麻疹病毒IgM抗体检测阳性而确诊。在知情同意的情况下，由临床医生调查病人一般情况及病史等，并填写麻疹病毒流行病学调查表，同时收集病人咽拭子、血液标本，于采集后24小时内置冰袋送至实验室。实验室及时对样本作进一步的处理后保存于-70℃冰柜。

二、 方法

2.1、病毒RNA提取

取出三个样品（麻疹病毒不同分离株，-80℃冻存，取至上海分子病毒实验室）和一个标准株作阳性对照。麻疹减毒活疫苗沪191（取至上海疾控中心），采用德国QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit，按试剂盒说明书提取麻疹RNA

2.2、引物

研究所得麻疹病毒白（Nucleoprotein，N）基因片段扩增引物根据文献涉及，序列如下：MN5，5’-GCCATGGGAGTAGGAGTGGAAC-3’（1113-1134）；MN6，5’-CTGGCGGCTGTGTGGACCTG-3’（1737-1754）。产物进行1.5%琼脂糖凝电泳，在N基因碳末端的660bp处有一明显阳性带。所有检测至少重复2次。

2.3、逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）

采用日本TaKaRa one step RNA PCR kit（AMV）试剂。取8ul麻疹病毒的RNA提取物作为模板，反应条件如下：50℃ 30min逆转录，94℃ 2min变性后，PCR循环如下：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，循环35周后，72℃延伸10min。扩增后产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.4、核苷酸序列测定及分析

扩增后产物送上海Invitrogen公司进行序列测定，测序结果的序列拼接、处理分析使用了DNA BSTAR软件，其余参比的代表株序列均来自基因库（GenBank）。

3结果

3.1、入组病例临床资料分析

2008年-2012年麻疹流行季节，奉化市人民医院共诊治麻疹抗体IgM阳性确诊的成人麻疹100例。病人年龄集中于18至58岁之间，年龄中位数为36岁。其中男性68例，女性32例。本市人口30例，外来流动人口70例。有30例曾有麻疹疫苗接种史，10例半月内有接种麻疹疫苗（40%），而60%（60/100）患者对是否种接过麻疹疫苗不详。全部病例均有发热，温度37.9℃-40.3℃不等，有88人（88.9%）为38.5℃以上高热。热型为稽留热，体温随皮疹消退而下降。热程在3-10天之间，其中无合并肺炎这热程在3-7天，合并有支气管肺炎者热程在6-10天，伴随有卡他症状者88例，占88.9%。出现眼结膜充血症状的有96例，占97.0%。出现口腔 Koplic斑的有94例。占94.9%。除了发热和斑丘疹外，伴随的其他症状还有恶心、呕吐7例，占7.1%，胸闷、心悸7例，占7.1%，腹痛、腹泻16例，占16.2%。

白细胞在2.5-13.6×109/L，≤ 4×109/L以下的有94例，占94.9%， 5例白细胞≥10×109/L，合并有肺炎。肝功能异常者有65例，占65.7%，为轻度异常，ALT≤（谷丙转氨酶）118U/L。心电图提示有ST段改变的有13例，占13.1%，有窦性心动过速的有8例，占8.1%。尿常规异常28例，其中尿蛋白阳性21例，潜血阳性17例，肾功能肌酐、尿素氮升高8例，为轻度异常。

3.2、基因亲圆形关系树

将所测得的3株麻疹野病毒N基因碳末端的456bp核苷酸序列与Genebank中麻疹病毒各基因型参考株进行比对，明确本研究中分离到的3株麻疹病毒基因型均为H型，与中国流行的基因型一致。有图3可见，3株麻疹病毒均属H1基因型中的H1a亚型，与其他参考株之间存在较大的差异。

3.3、序列分析及同源性

将3株麻疹病毒N基因碳末端456核苷酸序列与麻疹H1基因型参考株、麻疹减毒活疫苗（MV）株沪191（S191）进行核苷酸和氨基酸同时性分析，结果显示3株麻疹病毒与H1基因型按烤猪China93-7的核苷酸/氨基酸同源性为95.9-98.1%/92.1%-94.8%。与H1a参考株China93-2的核苷酸/氨基酸同源性为98.2-99.6%/95.4%-98.7%。3株麻疹病毒与中国MV株191的核苷酸/氨基酸差异为8.2-9.6%/9.7%-14.6%。其中3株麻疹病毒在氨基酸407处由甘氨酸G1y（G）变成组氨酸Ser（S），475处由苏氨酸The（T）变成异亮氨酸ILe（I），522处由天冬酰胺Asn（N）变成天冬氨酸Asp（D）。

4讨论

自20世纪70年代全球实施扩大免疫规划（EPI）以来，麻疹的发病率、死亡率已大幅度下降，但近几年来发生的麻疹病例，超过70%的患者是成人，在临床上易造成误诊漏诊[1]。

本组资料有如下临床特点：（1）发病年龄集中在20-39岁（70.8%），40-49岁占18.2%。（2）体温高，38.5℃以上高热，呼吸道卡它症状及眼部症状明显，腹痛、腹泻占16.2%，（3）皮疹明显，发疹顺序和典型麻疹一样，口腔Koplic斑明显，有94例出现Koplic斑；（4）多合并有肝脏损伤，为轻度损伤，血清ALT升高，（5）心脏损害较少， 心电图ST段改变（13.1%）或室性心动过速（8.1%）。（6）实验室检查白细胞不高，占9.4%，有合并症者白细胞升高。

A.V.Atrasheuskaya等[2]报道minsk2001-2003年14个麻疹病例中，病人的年龄集中于15至29岁之间。14个病人中有11个病例有明确的麻疹疫苗免疫史，其中9个病人接受过两剂麻疹疫苗免疫，只有21%（3/14）的患者有典型的麻疹病史即出现Koplic斑及支气管炎等。与Minsk麻疹病例比较，本组资料成人麻疹病人发生典型麻疹症状的比例超过了70%，而免疫不详的患者达到60%，缺乏有效疫苗免疫可能与本组资料成人麻疹患者临床症状相对严重有关。另外，国内有文献报道[3]，1999-2003年开封市监测到62个儿童麻疹患者，只有23%病人有Koplic斑，3%患者发生肺部感染，通过流行病学调查发现，该62个患者中只有12人接种过一针次麻疹疫苗，2人接种二针次以上，分别占19.25%、3.23%，此研究人群中，没有接种过麻疹疫苗的儿童感染麻疹病毒后，临床症状并不严重。以上分析提示年龄也可能与我国成人感染麻疹病毒后临床症状比较严重有关。

本组成人麻疹发病率明显升高，与下列因素有关：（1）人口流动大，部分未免疫地区外来人口进入，外来人口比例达52.0%（52/100）。这些没有接受计划免疫的人群，对麻疹普通易感，易感者在短时间内暴露于大量麻疹病毒的包围之中，加之居住环境卫生条件差，生活压力大造成心理压抑，均导致此类人群成为麻疹的高发人群。（2）人群抗体水平不足，计划免疫的实施对疫苗接种者大多得到保护，但是仍有一部分人群在接种后还是易感者，如本文资料成人感染麻疹病例中有麻疹疫苗接种史者达40%（40/100）。可能是由于目前广泛使用的麻疹疫苗破坏了F蛋白的抗原，毒力较野毒株大大减弱，中欧能够和抗体在随后的十几年中开始逐渐下降，部分转为阴性[4]，接触野生株可能会再次感染。一项研究[5]，显示成人麻疹保护性抗体阳性率仅为46.10%-68.08%，仅达中低水平。（3）有不同的基因型，且近年新的基因型在世界范围内不断被发现[6]，成人麻疹既发生在未免疫和初免疫失败人群，继发性免疫失败人群外，由于麻疹从分子生物学角度分析，会不会出现流行株或疫苗株本身突变产生抗原表位的变化造成免疫失败的现象，即免疫后又感染麻疹的现象是值得密切关注的。本文选取2008年1月-2012年6月奉化市发病的成人麻疹中分离到的流行株进行序列分析，并与我国目前使用的麻疹疫苗株沪191进行比较。3株流行株序列分析，证实均为H1基因型，属于H1a亚型，表明H1a亚型为奉化市的优势流行基因亚型，这与中国近年来的分子流行病学监测数据一致[7]。通过对N基因碳末端456bp核苷酸序列进行分析，奉化市分离到的3株麻疹病毒与中国MV株S191在氨基酸上的变异最大已达到14.6%，超过了国内其他一些报道[8]，有文献报道，人类免疫血清中和MV S191株的抗体集合平均滴度明显高于中和H1野毒株，人类免疫血清和麻疹病人恢复期血清中和野毒株的能力均低于中和MV株[9]，证明现用麻疹疫苗的免疫保护有所减弱，可能影响到麻疹疫苗的免疫持久性[10]，本研究也从分子生物学水平间接证明了现新MV血清学保护性下降的量变结果。

本研究报告的成人麻疹大部分具有典型的临床表现，但比儿童患者症状要轻，只有一部分患者出现并发症，根据本研究资料分析，对成人麻疹应采取：（1）进一步加强预防接种工作，专家们大多建议，调整麻疹疫苗的接种程序[11]，所有儿童应给予第2次麻疹疫苗接种，青年特别是高位人群都需要接种麻疹疫苗。（2）控制传染源，急性期麻疹患者是主要传染源，亚临床型病毒携带者也可能是传染源[12]，应努力阻断传染源传播。（3）进一步研究麻疹病毒基因变异，了解变异特点，为新型麻疹疫苗的研究和开发提供依据。

参考文献：

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[4]Itoh M ，okumo Y，Hotta parative analysis of titers of antibody against measles virus in sera of vaccinated and naturally infected Japanese individuals of different age groups [S] .Jclin microbial ，2002，40（5）：1733-1738.

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