富士苹果多酚氧化酶特性及褐变抑制研究

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摘要：研究了富士苹果多酚氧化酶（PPO）的特性。结果表明，试验最大吸收波长为400 nm，在4 ℃的条件下贮存的富士苹果多酚氧化酶活性随着时间的延长逐渐降低。富士苹果多酚氧化酶的最适pH为6.5，最适温度为35 ℃，在80 ℃以上失活。不同抑制剂对富士苹果多酚氧化酶的抑制效果不同，抑制能力由高至低依次为抗坏血酸、柠檬酸、D-山梨醇、D-果糖、NaCl、EDTA-2Na。当抗坏血酸的浓度为1 mmol/L时，富士苹果多酚氧化酶的相对活性仅为5.10%。

关键词：富士苹果；多酚氧化酶（PPO）；特性；褐变抑制

中图分类号：TS255 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）06-1107-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.06.029

Abstract： The polyphenol oxidase（PPO） properties of Fuji apple was studied. The result showed that the maximum absorbe wavelength was 400 nm. The PPO activity was weak as the solution with enzyme was stored at 4 ℃ after being extracted. The optimum pH of Fuji apple PPO was 6.5. The optimum temperature of Fuji apple PPO was 35 ℃ and lost its activity above 80 ℃. The effect of different inhibitors on the Fuji apple PPO was different. The order of the inhibitant capacity from high level to low level was ascorbic acid， citric acid， D-sorbitol， D-fructose，NaCl，EDTA-2Na. The relative activity of PPO was 5.10% when the ascobic acid concertration was 1 mmol/L.

Key words： Fuji apple； polyphenol oxidase（PPO）； properties； browning inhibition

富士O果属于蔷薇科苹果属。2004年中国总产量达2 000多万t，接近世界总产量的50%[1]。苹果容易在加工中褐变而影响苹果的质量，不仅影响感官质量，而且影响风味和营养价值。苹果中的酚类化合物是苹果发生褐变的重要原因，酶促褐变主要是由于多酚氧化酶（PPO）氧化内源的酚类物质生成醌。彼此相邻的醌互相聚合，或者醌与蛋白质、氨基酸等生成络合物最终生成褐色素，并且色素分子的量越高，颜色越深。因此，对于苹果多酚氧化酶的特性研究就显得尤为重要。

1 材料与方法

1.1 材料

以无病害、无机械伤、大小一致、成熟度一致、商品性良好的市售新鲜富士苹果为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 富士苹果PPO粗酶液的提取 将新鲜苹果洗净放入4 ℃冰箱中预冷2 h，取出去皮去核后，将苹果切成碎块，称取果肉12 g，加入pH为5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液30 mL及适量石英砂，冰浴研磨至匀浆，将匀浆移至离心管，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液。

1.2.2 富士苹果PPO活性测定 将pH为6.0的柠檬酸-磷酸缓冲液2.0 mL与0.1 mol/L的邻苯二酚溶液1.5 mL混匀，在35 ℃条件下保温10 min，粗酶液以及热失活的粗酶液分别在35 ℃条件下保温10 min，在石英比色皿中迅速混匀，在400 nm下测定吸光度值，每隔15 s测定一次，共45 s，重复测定3次求平均值。以每毫升酶液在15 s内吸光度改变0.001为一个酶活力单位。

1.2.3 最大吸收波长的确定 将pH为6.0的柠檬酸-磷酸缓冲液2.0 mL，0.1 mol/L的邻苯二酚1.5 mL混匀，35 ℃保温10 min，粗酶液以及热失活的粗酶液分别在35 ℃保温10 min；在石英比色皿中迅速将上述溶液混合，在390～420 nm之间以2 nm为间隔梯度进行测量。

1.2.4 富士苹果PPO酶液的保存 取新制酶液30 mL放入4 ℃冰箱中，每天同一时刻进行酶活性测定，在反应体系中依次加入在35 ℃保温10 min的pH为6.5的柠檬酸-磷酸缓冲液2.0 mL与0.1 mol/L的邻苯二酚溶液1.5 mL的混合液，以及在冰箱中保存并且35 ℃保温10 min的0.2 mL酶液以相应的新鲜酶液为对照。在400 nm的条件下按照上述方法连续6 d测定富士苹果PPO活性。

1.2.5 pH对富士苹果PPO活性的影响 在反应体系中加入pH为3.0～8.5的以0.5为梯度的柠檬酸-磷酸缓冲液2 mL，0.1 mol/L的邻苯二酚溶液1.5 mL、0.2 mL酶液。在最适波长400 nm条件下按照上述方法测定富士苹果PPO的活性。

1.2.6 温度对富士苹果PPO活性的影响 在比色皿中，加入35 ℃保温10 min的pH为6.5的柠檬酸-磷酸缓冲液2 mL与0.1 mol/L的邻苯二酚1.5 mL混合液，以及相应温度下（0～75 ℃，以5 ℃为梯度）保温的酶液。在400 nm条件下按照上述方法测定富士苹果PPO的活性。

1.2.7 底物浓度对富士苹果PPO活性的影响 在比色皿中依次加入在35 ℃保温10 min的pH为6.5的柠檬酸-磷酸缓冲液2 mL及以0.025 mol/L为梯度的0.025～0.250 mol/L的邻苯二酚1.5 mL混合均匀，以及35 ℃保温10 min的新鲜酶液0.2 mL。在400 nm条件下按照上述方法测定富士苹果PPO的活性。

1.2.8 抑制剂对富士苹果PPO活性的影响 在比色皿中依次加入在35 ℃保温10 min的pH为6.5的柠檬酸-磷酸缓冲液2.0 mL、0.1 mol/L的邻苯二酚1.5 mL、相应浓度的抑制剂0.1 mL的混合液，以及保温10 min的0.2 mL新制酶液。抑制剂种类及浓度如下：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、1.00 mol/L的柠檬酸、NaCl、D-山梨醇、D-果糖，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L的EDTA-2Na，0.5、1.0、1.5 mmol/L的抗坏血酸。在400 nm条件下按照上述方法测定富士苹果PPO的活性。

2 结果与分析

2.1 PPO反应液的最大吸收波长

由图1可知，PPO反应液在不同波长条件下的吸收情况呈现单峰曲线。波长为390～400 nm条件下，PPO活性呈现上升趋势；波长为400 nm时，吸收值最大；在400～420 nm条件下，PPO活性呈现下降趋势；在420 nm条件下的PPO活性为400 nm条件下的56.5%。因此，本试验以最大吸收波长400 nm作为工作波长。而付聿成等[2]研究认为金帅苹果PPO酶促反应产物在412 nm下有最大吸收峰，可能与试验材料不同有关。

2.2 酶液的保存

由图2可知，酶的活性随着保存时间的延长呈现逐渐下降的趋势。第1天时活力明显下降，为试验开始r酶活性的71.1%；第2天酶的活性下降的幅度较小，酶的活性变化不大，为第0天的59.8%；随后酶的活性逐步降低，当保存6 d时，活力仅为第0天的52.9%。

2.3 pH对富士苹果PPO活性的影响

富士苹果中的PPO对pH的变化十分敏感。由图3可知，当pH在3.0～6.5时，PPO的活性呈现上升趋势；当pH为6.5时，表现为最高活性（酶活性100%）；当pH在6.5～8.5时，酶活性呈现下降的趋势；当pH为3时，其活性只有最高活性的12%；当pH上升到8.5时，其活性只有最高活性的9%。这主要是因为苹果多酚氧化酶是一种含铜蛋白。当pH相对较低时，一方面蛋白质变性，酶失活，另一方面，铜从酶中解离出来，使酶失活[3]；当pH相对较高时，酶蛋白与铜在碱性条件下发生脱离，生成不溶性的Cu（OH）2沉淀，也可以使酶失活。因此加工过程中可以调整pH减少褐变的发生。

付聿成等[2]研究认为金帅苹果PPO的最适pH为5.0，在pH为5.0～6.8范围内有较高的稳定性，王琼波等[4]认为嘎拉苹果PPO的最适pH为6.0，田兰兰等[5]研究得出富士苹果PPO的最适pH为5.0，刘树兴等[6]的试验结果表明，脱水苹果片多酚氧化酶的最适pH为6.0，而粉红女士苹果PPO最适pH为4.5[7]，刘文山等[8]用冷冻丙酮制备苹果PPO氧化邻苯二酚的最适pH为6.0。以上研究结果可知，不同品种苹果PPO的最适pH不同。

2.4 温度对富士苹果PPO活性的影响

由图4可知，当温度在10 ℃以下时PPO活性较低。当温度在0 ℃时，酶活性仅有最高活性的3.3%；当温度在10～35 ℃时，酶活性呈现上升的趋势，在35 ℃达到最高值（酶活性100%）；在35～80 ℃的温度范围时，PPO活性呈下降趋势；当温度上升到75 ℃时，酶活性仅有最高活性的9.2%；当温度上升至80 ℃时，3 min以后多酚氧化酶失活。

不同苹果部位的PPO最适温度不同，酶失活所需的温度与时间也不同。付聿成等[2]研究认为金帅苹果PPO的最适温度为40 ℃。嘎拉苹果PPO最适反应温度是45 ℃[4]。富士苹果PPO最适温度30 ℃[5]。王琼波等[4]认为嘎拉苹果PPO在80、90、100 ℃分别处理280、240、200 s时完全失活，脱水苹果片多酚氧化酶最适温度为36 ℃，100 ℃热烫60 s可使其完全失活[6]。粉红女士苹果PPO最适温度为30 ℃，温度为90 ℃，处理3 min后粉红女士苹果PPO活性下降为原来的10.13%，酶活性基本被抑制[7]。冷冻丙酮制备苹果多酚氧化酶最适温度为25 ℃；PPO在20～25 ℃时对热较稳定，其后随着温度的升高酶活迅速降低；在100 ℃维持1 min酶全部失活[8]。

2.5 邻苯二酚的浓度对富士苹果PPO活性的影响

由图5可知，在酶浓度不变的情况下，当底物浓度相对较低时，相对活性随着底物浓度的增大而加快；而后随底物浓度的增大，相对活性的增加量逐渐缩减；最后相对活性达到最大值，相对活性不再随底物浓度的变化而变化。当邻苯二酚的浓度增加到0.125 mol/L之后，增加底物浓度，吸光度不再变化达到最大值。在底物浓度达到0.25 mol/L时酶活力仍保持一定的反应速度，并没有随底物浓度的增加而对酶活力产生抑制作用。田兰兰等[5]研究认为富士苹果PPO对4种底物催化活性不同，由高到低的顺序依次为邻苯二酚、DL-半胱氨酸、苯甲酸、山梨酸；富士苹果PPO最佳底物浓度为0.6 mol/L。宋莲军[7]研究粉红女士苹果PPO的特性时也以邻苯二酚为底物。

2.6 抑制剂对富士苹果PPO活性的影响

由图6可知，苹果PPO活性抑制剂的抑制作用随抑制剂浓度的增大而增强。6种抑制剂对PPO活力的抑制效果大体上依次为抗坏血酸、EDTA-2Na、柠檬酸、D-山梨醇、D-果糖、NaCl。抗坏血酸有最明显的抑制作用，随着浓度的增加，PPO相对活性降低。当抗坏血酸浓度为1 mmol/L时，PPO相对活性仅为5.1%；当其浓度继续增大至1.5 mmol/L时，PPO的相对活性降为0。可能抗坏血酸是一种维生素，它可将酶促反应的中间产物醌还原，从而抑制了褐变。由此可以看出，抗坏血酸对PPO的活性既有较好的抑制作用，同时又是食品中应有的营养成分，是生产中防止食品发生褐变的理想抑制剂。

不同抑制┒云还PPO活性的研究也较多。王琼波等[4]研究表明NaCl和蔗糖对嘎拉苹果PPO活性没有影响，抗坏血酸、柠檬酸、柠檬汁和橘子汁对嘎拉苹果PPO有很好的抑制作用，维生素C、柠檬酸、橘子汁以及维生素C和柠檬酸的交互作用对PPO的抑制作用极显著，它们对PPO的抑制顺序是维生素C>柠檬酸>维生素C×柠檬酸>橘子汁。田兰兰等[5]发现当维生素C浓度达到150 mmol/L时，90%的富士苹果PPO酶活性被抑制。Jang等[9]认为抗坏血酸处理可显著抑制鲜切苹果果肉褐变率及PPO的活性，抑制率分别高达46%和98%。也有研究显示，抗坏血酸和黄酮类物质能明显地抑制冷冻丙酮制备苹果多酚氧化酶酶促褐变[8]。吴士云等[10]的研究也发现苹果片多酚氧化酶酶活力在1.0%～1.5%的抗坏血酸溶液中显著降低。Jang等[11]发现超声波与VC联合处理可以钝化贮藏中苹果的多酚氧化酶活性。上述研究结果均提示抗坏血酸在苹果酶促褐变中的强抑制作用，将抗坏血酸与其他技术相结合也能起到降低苹果多酚氧化酶活性的作用。本研究发现柠檬酸也能较好地抑制苹果多酚氧化酶的活性，而且柠檬酸是植物中的天然成分，实际应用较安全，不失为一个新选择。

3 结论

当波长为400 nm时，多酚氧化酶活性测定体系的吸光度值最大。酶的活性随着存放时间的延长逐渐降低，新鲜粗酶液最多可在4 ℃条件下保存3 d。多酚氧化酶最适pH为6.5，并且在此条件下活性比较稳定。当pH在5.5～7.0时，酶活性较高；其他pH下的酶活性均表现出不同程度的抑制作用，因此可以通过调整产品的pH控制褐变程度。多酚氧化酶对热很敏感，其最适宜的温度为35 ℃，80 ℃条件下处理3 min，多酚氧化酶完全失活。邻苯二酚的浓度增加到0.125 mol/L之后，增加底物浓度，吸光度不再变化。在底物浓度达到0.25 mol/L时酶活力仍保持一定的反应速度，并没有随底物浓度的增加而对酶活力产生抑制作用。抑制剂对苹果多酚氧化酶的活性均有一定的抑制能力，且抑制剂浓度越大抑制能力越强，实际生产中可采用抗坏血酸或柠檬酸作为富士苹果制品褐变的有效抑制剂。

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