头孢他啶与中药制剂联合应用对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性的研究
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摘要：目的 研究头孢他啶和双黄连注射液、热毒宁注射液、喜炎平注射液联合应用抗临床分离的铜绿假单胞菌的效果。方法 收集并分离临床来源的68株铜绿假单胞菌，采用微量棋盘稀释法，计算头孢他啶分别和3种中药制剂的FIC指数。结果 采用头孢他啶和热毒宁注射液联用，以相加（11.76%）和无关（58.82%）作用为主，以协同（10.29%）和拮抗（8.82%%）为次。采用头孢他啶和双黄连注射液联用，以无关（36.76%）和相加（20.59%）作用为主，以协同（11.76%）和拮抗（16.18%）为次。头孢他啶与喜炎平注射液联用抗铜绿假单胞菌无效。结论 在临床治疗过程中，可以佐以中药制剂以增强抗菌药物治疗的有效性。
关键词：铜绿假单胞菌；联合用药；微量棋盘稀释法
Study on Antibacterial Activity of Ceftazidime with Traditional Chinese Medicine Preparation Combined Application of Pseudomonas Aeruginosa in Vitro
LV Juan， XIE Fen，DING Yong-juan
（Affiliated Hospital of Jiangnan University， Wuxi N0’4 People's Hospital， Wuxi 214062，Jiangsu，China）
Abstract： Objective To study the effect of antibacterial action combined with ceftazidime and Shuanghuanglian injection， Reduning injection， Xiyanping injection on Pseudomonas Aeruginosa. Methods To collect and isolate the 68 strains of Pseudomonas Aeruginosa in clinical， the fractional inhibitory concentration index was calculated with microdilution checkerboard method， about ceftazidime and Shuanghuanglian injection， Reduning Injection， Xiyanping Injection. Results The effect of antibiotics combination of ceftazidime and Reduning Injection was 11.76% additive and 58.82% independent action， while 10.29% was synergistic effect and 8.82% was antagonistic effect. The effect of antibiotics combination of ceftazidime and Shuanghuanglian Injection was 20.59% additive and 36.76% independent action， while 11.76% was synergistic effect and 16.18% was antagonistic effect. It is ineffective for us to combine ceftazidime with Xiyanping injection. Conclusion In the clinical course of treatment， chinese medicine preparation can be used to enhance the effectiveness of antimicrobial therapy.
Key words：Pseudomonas aeruginosa；Combination；Microdilution checkerboard method
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是假单胞菌中最常见的条件致病菌，是我院培养分离出的前三个病原菌之一。PA感染难以治疗，甚而产生多重耐药、泛耐药菌株，有相当部分原因是因为铜绿假单胞菌的耐药机制十分复杂。当单一抗菌药物的使用无法有效的治疗铜绿假单胞菌感染时，临床通常选择不同作用机制的抗菌药物联合应用来治疗PA感染，以减少单一药物大剂量应用时的毒副作用，以及减少和延缓耐药菌株的产生。丁力等[1]评价了异帕米星分别与头孢他定、头孢吡肟、美洛培南联合用药对临床分离获得的PA的体外抑菌活性，发现上述药物联用后，明显起到增效作用，主要表现为协同和相加作用。另有研究[2]表明头孢他啶与环丙沙星的联合对多重耐药PA的敏感率为88.46%，哌拉西林他唑巴坦与环丙沙星联用对多重耐药PA的敏感率为84. 26%。
除了各种抗菌药物之间联合应用治疗铜绿假单胞菌感染外，同样有研究表明，中药能够增加抗菌药物的效应，提高菌株对抗菌药物的敏感性。任玲玲等[3]研究表明，中药复方制剂能降低大肠埃希菌多重耐药基因表达水平；而芦亚君等[4]研究中药复方制剂能使产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌部分或全部逆转对抗菌药物的耐药性的作用。中西药物的联合应用研究被逐渐提上议事日程。通过中西药物联合应用来达到提高抗菌药物使用疗效，缩短住院时间，降低耐药率的目的。铜绿假单胞菌是一种常见的医院内获得性感染的条件致病菌，我院通常选择静脉注射类抗菌药物治疗PA感染，头孢他啶在美国FDA 核准的临床微生物实验室在非苛养菌常规试验和报告中应考虑的抗微生物药物推荐分组中，是首先被推荐用于治疗铜绿假单胞菌的药物，故本研究选用头孢他啶与临床常用中药制剂双黄连注射液、热毒宁注射液、喜炎平注射液联用，观察对铜绿假单胞菌有无协同抗菌作用。
1 资料与方法
1.1一般资料 收集2010年9月～2011年8月我院临床分离的68株PA，全部菌株采用VITEK 32型全自动微生物分析仪，GNI鉴定卡进行鉴定。68例住院患者中，男50例，女18例；年龄38～96岁，平均（68±13）岁；60岁以上44例，占64.71%。
1.2培养基和抗菌药物 Mueller Hinton肉汤培养基（以下简称MH培养基）（江苏宜兴市永信生物有限公司，批号：20100518）；头孢他啶（广州白云山天心制药股份有限公司，批号：101130）；双黄连注射液（1mL相当于1g生药）（河南福森药业有限公司，批号：100734）；热毒宁注射液（1mL药液含栀子9～14mg和绿原酸5.6～8.4mg）（江苏康缘药业股份有限公司，批号：100807）；喜炎平注射液（江西青峰药业有限公司，批号：20110124）。
1.3实验仪器 SW-CJ-ICU洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；电热恒温培养箱（型号：HH-BII-360-S，上海跃进医疗器械厂）；手提式不锈钢蒸汽消毒锅（型号：YX20B）。
1.4 微量棋盘稀释法
1.4.1原理 将甲乙两药的各种稀释度加以组合，组成联合药敏板。同时两种药物每一稀释度都有一个加单一药物的单独药敏孔。根据单一药物对被检菌的MIC和联合药敏板中的抑菌情况，可精确测定两药在适当浓度比例下所产生的相互作用。
1.4.2 实验步骤
1.4.2.1确定单药的MIC。
1.4.2.2确定联合药敏的药物稀释度 ①每一稀释度浓度为联合药敏孔内所需单药终浓度的2倍；②用MH液体培养基将甲乙两药稀释6～8个稀释度。
1.4.2.3加甲、乙两药（分别从横、竖排加入） 每孔各50ul，横排和纵排的第1孔为无药对照，第1排为单药对照管。见图1。
1.4.2.4加待测菌液 ①各管加入被检菌液100ul；②菌液终浓度：105CFU/mL。
1.4.2.5将塑料96孔板放入37℃孵育过夜。
1.4.2.6结果判读：FIC：部分抑菌浓度指数。
FIC指数=甲药联合时MIC/甲药单独时MIC+乙药联合时MIC/乙药单独时MIC
FIC指数≤0.5为协同作用；0.5
2 结果
采用头孢他啶和热毒宁注射液联用，以相加（11.76%）和无关（58.82%）作用为主，以协同（10.29%）和拮抗（8.82%）为次。采用头孢他啶和喜炎平注射液联用，所有FIC均大于2，以拮抗（100%）作用为主，无协同、相关及无关作用。采用头孢他啶和双黄连注射液联用，以无关（36.76%）和相加（20.59%）作用为主，以协同（11.76%）和拮抗（16.18%）为次。具体见表1。
3 讨论
细菌的耐药性问题目前已成为全球关注的焦点，以往临床上大多数感染应用单一抗菌药物即可控制，但是随着细菌耐药率的逐年递增，单一抗菌药物并不能对许多严重的感染进行良好的控制。2011年卫生部在全国范围内开展了抗菌药物临床应用专项整治活动，提出3级医院抗菌药物品种原则上不超过50种。细菌的耐药性产生的速度，远远大于抗菌药物的研制速度，医院目录内的抗菌药物不仅要满足临床治疗的要求，能够保证治疗各类病原微生物感染的用药，而且要尽可能被合理使用，有效控制细菌耐药。本人之前研究[5]表明，铜绿假单胞菌对头孢他啶对的耐药率超过了30%，针对铜绿假单胞菌采用联合用药，明确铜绿假单胞菌对中西药联用的效果显得尤为重要。
目前有热毒宁注射液联合头孢呋辛[6]、美洛西林舒巴坦钠[7]等治疗治疗化脓性扁桃体炎，联合克林霉素[8]治疗小儿急性支气管炎等的疗效观察报道，但这些病症的病原微生物检验多为链球菌、葡萄球菌。有研究[7]表明，热毒宁注射液联合美洛西林舒巴坦钠用于治疗急性化脓性扁桃体炎总有效率100%，两药联用具有优势，特别是对美洛西林舒巴坦钠耐药者，联合使用热毒宁注射液后仍有好转疗效，值得推广应用。但该研究的184例观察病例中，检出铜绿假单胞菌的仅有2例，且该研究没有明确这2例属于治疗组。文献[9]指出热毒宁联合头孢呋辛钠治疗儿童社区获得性肺炎可缩短疗程，提高有效率，可能与社区获得性肺炎常见的病原体复杂[10]，多为细菌、非典型感染、肺炎支原体合并细菌或病毒等感染有关。以上研究表明，热毒宁注射液虽然常用于治疗呼吸道感染，但呼吸道感染的原因是细菌、支原体合并病毒感染者，使用热毒宁注射液较有效。由表1可知，热毒宁注射液与头孢他啶联用，以无关作用（58.82%）为主，协同和相加作用为次，表明热毒宁注射液具有协同抗PA的作用，但仍以头孢他啶自身抗PA作用为主。这与临床多以热毒宁注射液抗病毒治疗[11-13]为主相一致。
喜炎平注射液主要成份是穿心莲内酯总酯磺化物，主要治疗支气管炎、扁桃体炎、细菌性痢疾等疾病。穿心莲内酯系自爵床科植物穿心莲中提取得到的二萜内酯类化合物，具有良好的抗感染作用，但作用机制尚不明确。郭威等[14]通过含有LacZ报告基因质粒的感因菌株检测了穿心莲内酯对铜绿假单胞菌C14-HSL分子的抑制作用，并未发现穿心莲内酯对MexAB-OprM外排泵mRNA水平表达的抑制作用机制。有研究表明[15]，穿心莲内酯可以通过减弱对胞外水解酶和弹性蛋白酶的活性，抑制铜绿假单胞菌毒力因子产生从而实现抗感染作用；也有文献[16]认为，穿心莲内酯与阿奇霉素有协同抗菌作用；但穿心莲提取物对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差[17]。本研究认为头孢他啶与喜炎平注射液联用无抗铜绿假单胞菌作用，与上部分内容喜炎平注射液在体外无抗铜绿假单胞菌作用一致，可能本研究使用的是喜炎平注射液，成分为穿心莲内酯总酯磺化物，与穿心莲内酯有一定区别有关。
双黄连制剂的研究较多，有文献[18]报道双黄连对产ESBLs大肠埃希菌有一定的抑制作用；双黄连与头孢噻肟合用[19]，比单用头孢噻肟对铜绿假单胞菌的敏感度提高2～8倍。有研究[20-21]认为，对于多重耐药感染PA进行联合用药经验治疗时，可优先考虑头孢他啶联合环丙沙星，其次哌拉西林他唑巴坦钠联合环丙沙星，其抗菌机制可能与联合用药后抗菌药物之间的耐药机制并不完全重叠，联合用药后破坏了铜绿假单胞菌的耐药机制有关。本研究中的双黄连注射液为中药金银花、黄芩、连翘的提取物制剂，类似小型复方，与文献中的双黄连粉针有一定区别，协同、相加、无关、拮抗等作用的分布也较为平均，可能与其多成分多靶点作用机理有关。双黄连注射液与头孢他啶联用，协同和相加抗PA的有效率超过了30%，两药联用抗PA的机制有待于进一步研究。
在实验过程中，有一些菌株无法判定头孢他啶与中药制剂联用的FIC值，是因为中药制剂在单用时的最大浓度亦没有抑菌作用，即无法得知中药制剂在单用时的MIC值，进而无法判读头孢他啶与其联用的FIC值。
头孢他啶是β-内酰胺类抗生素，细菌产生的β-内酰胺酶是细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机制。头孢他啶和双黄连注射液联用具有协同和相加抗PA的作用，作者将继续研究双黄连注射液是否能抑制铜绿假单胞菌产生β-内酰胺酶，从而增加敏感性，降低耐药率。
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