复方一枝蒿片抗炎作用和对免疫功能影响的策略应对

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复方一枝蒿片为江苏黄河药业股份有限公司研制、生产的新型中草药成品,其主要成分为一枝蒿、板蓝根和大青叶,按照维医理论,其具有清除“乃孜来”,解毒利咽,用于“乃孜来”所致的感冒、发烧、咽喉肿痛的功效;在中医学中其具有解表祛风、凉血解毒的疗效。常用于邪毒所致的感冒发烧、咽喉肿痛、病毒性感冒见上述证候者。相对于复方一枝蒿颗粒,该产品能够克服颗粒剂用辅料用量大、服用需用开水冲服、口味不佳等缺点。为了进一步开发复方一枝蒿片,笔者对其进行了二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验,毛细血管通透性试验以及对T淋巴细胞增殖影响的实验研究,考察复方一枝蒿片对抗炎和免疫功能的影响,以期为复方一枝蒿片的临床应用进一步提供理论依据和药理学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 光栅分光光度计(722):上海第三分析仪器厂;台式高速冷冻离心机(5417R):艾本德中国有限公司(Eppendorf China Limited);电子分析天平(AG-204):瑞士Mettler Toledo公司;电热恒温培养箱(DNP-9082):上海精宏实验设备有限公司;酶标仪(550):BIO-RAD公司;倒置显微镜(CKX31):Olympus公司;洁净工作台(SW-CJ):上海屹明净化设备有限公司。

1.1.2 试药 抗病毒颗粒:四川光大制药有限公司;复方一枝蒿片:江苏黄河药业股份有限公司(实验前用灭菌蒸馏水溶解配成所需浓度);二甲苯:国药集团化学试剂有限公司;冰醋酸:国药集团化学试剂有限公司;伊文思蓝,西安化学试剂厂;ConA:Worthington公司;RPMI1640:美国英杰生命技术有限公司。

1.1.3 动物 Balb/c小鼠300只,雌雄兼半,6~7周龄,购自上海斯莱克动物公司。

1.2 方法

1.2.1 二甲苯致小鼠耳肿胀的研究 取6~7周龄Balb/c小鼠50只,雌雄兼半,随机分为空白对照组、模型组、复方一枝蒿片1.5、2.5、5.0 g/kg剂量组、抗病毒颗粒组,空白对照组及模型组灌胃(ig)等容积蒸馏水,其余各组灌胃(ig)受试药物,1次/d,连续5 d,末次给药1.5 h后,在小鼠右耳廓两面均匀涂抹20 μl二甲苯,左耳作对照[1]。30 min后脱颈处死小鼠,用直径6 mm打孔器分别在左右耳对称部位打下圆形耳片,精密称重,计算肿胀度和肿胀抑制率[2]。肿胀度=左右耳片质量之差,肿胀抑制率=(对照组肿胀度-绐药组肿胀度)/对照组肿胀度×100%。

1.2.2 小鼠腹腔毛细血管通透性的研究 取6~7周龄Balb/c小鼠50只,雌雄兼半,分组、剂量设置及给药时间同2.1,于末次给药后1.5 h,每鼠尾静脉注入0.5%的伊文思蓝生理盐水溶液10 ml/kg,并立即腹腔注射(ip )0.6%冰醋酸0.2 ml/只[2]。15 min后脱颈处死,用6 ml 生理盐水反复抽吸冲洗腹腔,吸出冲洗液3 ml,1000 r/min。离心10 min,取上清液于590 nm处测定吸光度(OD590),计算药物对炎性渗出的抑制率[3]。抑制率=(对照组OD590-给药组OD590)/对照组OD590×100%。

1.2.3 小鼠T和B淋巴细胞增殖作用的影响

1.2.3.1 小鼠脾细胞悬液制备 用乙醚麻醉Balb/c小鼠,昏迷后用大头钉将小鼠固定在无菌平板上,用无菌剪刀、镊子剪开小鼠的腹部皮肤,打开腹腔,取脾脏;200目铜网研磨小鼠脾脏,并同时用含RPMI1640(完全)培养基冲洗;1000 r/min常温下离心10 min,弃上清;细胞沉淀用2 ml的红细胞裂解液悬浮,吹打5 min使其充分地裂解,加入8 ml的GKN缓冲液(NaCl 8 g,KCl 0.4 g,Na2HPO4·2H2O 1.77 g,NaH2PO4·H2O 0.69 g,葡萄糖2 g,酚红0.01 g,溶于1000 ml双蒸水中)使反应终止;1000 r/min常温下离心10 min,弃上清;加入RPMI1640培养基10 ml,清洗2次;RPMI1640培养基10 ml悬浮,血球计数板计数,调整细胞密度为3×106 Cells/ml[4]。

1.2.3.2 T淋巴细胞增殖实验 按照3×106 Cells/ml细胞密度将细胞悬液加在96孔板中培养,每孔150 μl,除细胞对照组外各实验组分别加入ConA(40 mg/L)50 μl和50 μl不同浓度的复方一枝蒿片药液(质量浓度梯度分别为:20 000、10 000、5000、2500、1250、625、312 mg/L)、抗病毒颗粒药液(质量浓度梯度同复方一枝蒿片药液浓度梯度),细胞对照组加RPMI1640培养液100 μl,ConA对照加RPMI1640培养液50 μl,每组4个复孔,轻轻地混匀后,置于5% CO2、37 ℃孵箱中培养24 h;每孔加MTT(5 mg/ml母液)溶液10 μl,轻轻地混匀,继续培养4 h[5]。

在倒置显微镜下定期地观察96孔板细胞,当有清晰可见的紫色沉淀产生时,每一孔中加入150 ?l的DMSO(dimethyl sulfoxide),随后轻轻地摇动96孔板,并将96孔板在室温下(黑暗)放置15 min;用多孔酶标测定仪于波长570 nm处测定吸光值OD570。计算各浓度药液对T淋巴细胞增殖的抑制率。T淋巴细胞增殖抑制率=(ODConA对照组-OD给药组)/ODConA对照组×100%。

1.3 统计学处理

使用SPSS 17.0软件进行数据分析,数据用(x±s)表示,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

与模型组比较,复方一枝蒿片2.5、5.0 g/kg剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀均有明显的抑制作用(P<0.01),抗病毒颗粒组对二甲苯致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用(P<0.05),见表1。

2.2 小鼠腹腔毛细血管通透性研究

与模型组比较,复方一枝蒿片1.5、2.5、5.0 g/kg剂量组及抗病毒颗粒组均可显着抑制冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的增高作用(P<0.01或P<0.05),复方一枝蒿片的抑制作用随着浓度的增高而增长,表明复方一枝蒿片的抑制作用具有浓度依赖性。见表2。

2.3 对小鼠T淋巴细胞增殖作用的研究

ConA诱导的对照组吸光度较细胞对照组有显着提高(P<0.01);ConA诱导后各给药组较ConA对照组,阳性对照组抗病毒颗粒在312~20 000 mg/L吸光度有显着降低(P<0.01);供试品复方一枝蒿片在312~20 000 mg/L吸光度显着降低(P<0.05),且随着浓度的增大对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的抑制作用逐渐增强。见表3。

3 讨论

复方一枝蒿片在维医和中医临床中主要用于防治感冒,且具有良好的效果。其组方中一枝蒿总黄酮其有抗甲型流感病毒作用和抗菌、抗炎、调节机体免疫功能作用[6];大青叶水提物具有广谱抗菌、抗 炎、免疫增强作用,其有效单体可有效的抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖[7];板蓝根腺苷成分具有抗流感病毒、抗炎作用,酸性和碱性部位可调节免疫功能[8-9]。

本课题组在前期研究工作中显示复方一枝蒿片剂能够明显抑制和杀灭金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌,对乙型溶血性链球菌有一定的抑制和杀灭作用,高剂量的复方一枝蒿片能使变形杆菌感染小鼠的死亡率显着下降,表明复方一枝蒿片对感染的小鼠具有明显的保护作用,在此基础上本文又对复方一枝蒿片的抗炎、免疫功能的影响进行实验研究,研究结果显示,复方一枝蒿片具有抗二甲苯所致急性炎症作用和抗冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的炎性渗出作用;可抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖,这些试验为复方一枝蒿片的临床用于感冒的防治提供了理论依据。

参考文献

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[2]刘循,刘燕,姚华,等.复方一枝蒿颗粒对小鼠抗炎和免疫功能的影响[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(13):185-189.

[3]于瑞和,刘丹娅.抗感利咽喷雾剂镇咳、抗炎、免疫增强作用的实验研究[J].中国中医药科技,2011,18(5):396.

[4]傅海英,孙玉华,胡正海,等.复方一枝蒿颗粒的抗炎、抗菌作用和对免疫功能的影响[J].中药药理与临床,2007,23(2):64.

[5]王敏,刘旭平,张建勤,等.黄芩苷对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响[J].江西医学院学报,2007,47(5):17.

[6]雍建平,阿吉艾克拜尔·艾萨.一枝蒿酮酸酰胺衍生物的合成和抗A3,B型流感病毒和单纯Ⅰ,Ⅱ型疱疹病毒活性研究[J].有机化学,2008,10(28):180.

[7]刘钊,杨占秋,肖红.中药大青叶有效单体抗流感病毒作用[J].中南民族大学学报,2009,28(3):4.

[8]王建明,潘晓云.板蓝根制剂中腺苷含量与抗炎作用相关性研究[J].时珍国医国药,2011,22(5):1269.

[9]晋玉章,宋光明,赵艳威,等.板蓝根免疫调节作用活性部位的筛选[J].武警医学院学报,2011,20(7):538.