巧学基因工程基本操作
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抗虫棉的培育是我国具有自主知识产权的转基因技术，其技术流程图比较形象而具体地反映了转基因技术的全过程，同学们在学习过程中，如果将基因工程的四个操作步骤放在流程的具体过程中去理解，可变抽象的记忆为形象性的理解，同时可以提高同学们的分析能力及对生物学原理的理解能力。
如图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因（kanr）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。通过概念图，我们可以作如下四个方面的分析：
[抗虫基因][含kanr质粒][转基因抗
虫植株][再生
植株][重组
质粒][愈伤
组织][土壤农
杆菌][含重组质粒的
土壤农杆菌][离体棉花
叶片组织] [构建][导入][检测][分化][培养选择][诱导选择][侵染]
1.从抗虫基因的获取，理解目的基因的获取方法
例1 在抗虫棉培育过程中，需要将苏云金杆菌Bt毒基因导入棉花细胞中。下图是获取苏云金杆菌Bt基因的流程。据图回答：
杆菌[基因组
文库][含目的基
因的菌株][目的基
因Ⅰ][目的基
因Ⅱ][DNA][mRNA][cDNA][cDNA
文库][含目的基
因的菌株][构建] [筛选] [分离] [A][B][构建] [筛选] [C][分离] [提取][提取]
（1）图中基因组文库 （填“小于”“等于”或“大于”）cDNA文库。
（2）B过程需要的酶是 ；A、C过程中 （填“可以”或“不可以”）使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。
（3）目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中 和 为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是 。
解析 分析获取苏云金杆菌Bt基因的流程图可知，图中基因组文库大于cDNA文库。B过程需要的酶应该是逆转录酶；A、C过程虽然都能获得含目的基因的菌株，但C中无内含子对应的序列，所以不可以使用同一种探针进行筛选。目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。
答案 （1）大于 （2）逆转录酶 不可以 （3）DNA cDNA 耐高温
2.从重组质粒的构建，理解表达载体的构建过程及组成要素
例2 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。之后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子（抗虫基因首端），导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子（抗虫基因末端），导入棉花受精卵，结果长成的植株有了抗虫能力。那么作为重组的载体应具备的结构是（ ）
A.目的基因、启动子、标记基因
B.目的基因、终止子、标记基因
C.目的基因、启动子、终止子、标记基因
D.启动子、终止子、标记基因
解析 据题干可知，要使目的基因在棉花体内表达，必须有棉花基因表达的启动子，且要有使抗虫基因准确表达的终止子。而表达载体中含标记基因如卡那霉素抗性基因（kanr），只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长，则可以标记目的基因是否导入，所以需要目的基因、启动子、终止子、标记基因四种结构。
答案 C
点拔 基因表达载体的构建过程如下图，用同一种限制性内切酶切割目的基因及质粒，以获取[ 质粒][DNA分子][重组DNA分子（重组质粒）][一种限制酶处理][DNA连接酶][两个切口
获得目的基因][一个切口
两个黏性末端] 相同的粘性末端，然后将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子（重组质粒）。构建过程如右图所示。
3.从重组质粒通过农杆菌介导进入棉花细胞，理解将目的基因导入受体细胞的方法
例3 为将目的基因导入受体细胞常采用土壤农杆菌转化法，在土壤农杆菌中常含有一个Ti质粒。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是（ ）
A.Ti质粒含有对宿主细胞生存具有决定性作用的基因，是基因工程中重要的载体
B.用Ca2+处理细菌是重组Ti质粒导入土壤农杆菌中的重要方法
C.重组Ti质粒的土壤农杆菌成功感染植物细胞，可通过植物组织培养技术将该细胞培养成具有抗虫性状的植物
D.若能够在植物细胞中检测到抗虫基因，则说明将重组质粒成功地导入到了受体细胞
解析 Ti质粒的作用是带动目的基因整合到棉花细胞的染色体中，以保证目的基因在棉花的繁殖过程中能够稳定遗传，所以A项错误，用Ca2+处理农杆菌，使细菌细胞处于感受态，可吸收重组Ti质粒导入土壤农杆菌中，所以B项正确，棉花为双子叶植物，其产生的酚类物质可诱使含重组Ti质粒的土壤农杆菌感染植物细胞，然后通过植物组织培养技术即可获抗虫棉，C项正确，若植物细胞中检测到抗虫基因，则说明抗虫基因可随重组质粒进入受体细胞，则D项正确。
答案 A
点拔 苏云金杆菌Bt基因与Ti质粒构成的重组质粒及普通质粒都可被Ca2+处理过的感受态农杆菌摄入，所以要用卡那霉素抗性基因（kanr）为标记基因进行筛选，然后选出含抗性基因的农杆菌，使之感染棉花细胞，因只有部分细胞可能被感染，所以仍需要对感染过的棉花细胞进行抗性检测，进一步筛选出含抗性基因的棉花细胞，Ti质粒可诱使目的基因整合到棉花细胞的染色体中并随细胞分裂而稳定遗传，然后将含抗虫基因的棉花进行植物组织培养才可获得抗虫植株。重组质粒的导入还可以用花粉管通道法或基因枪法导入到棉花细胞中，而若将重组DNA导入动物细胞则应用显微注射法。
4.从再生植株的检测，理解目的基因的检测与鉴定的方法
例4 苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花植株后是否已表达，从个体水平进行的检测是（ ）
A.是否有抗药性
B.是否有相应的抗虫性状
C.是否能检测到标记基因
D.是否能分离到目的基因
解析 因题干强调的是个体水平，应从性状上检测，抗虫基因如果在棉花细胞内表达，则该棉花就应该有相应的抗虫性状。
答案 B
点拔 对于抗虫基因的检测与鉴定包括分子水平的检测和个体水平的检测二个方面，分子水平的检测主要从基因及其表达的三级水平上检测。个体水平的鉴定主要是对个体性状表现进行的检测，主要有：（1）抗虫或抗病的接种实验。（2）对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较。目的基因的检测与鉴定可归纳如下。
[目的基因
是否插入][mRNA][蛋白质][个体][DNA分
子杂交][分子
杂交][抗原-抗体杂交][抗虫、抗病
接种实验][是否抗虫：
是否抗病][是否出现
杂交带][是否出现
杂交带][是否出现
杂交带] [转录] [翻译] [检测] [检测] [检测] [鉴定] [现象] [现象] [现象] [现象] [个体水平检测][分子水平检测]