小鼠期卵泡发育动态影响

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小鼠因其繁殖率高、繁殖周期短等特点被常用于生物医学研究,尤其是胚胎生物学和胚胎工程研究(Brookeetal,2007;Dingetal,2007;Martín-Coelloetal,2008)。超数排卵技术作为在同一时间段获得足够数量卵母细胞或胚胎的主要手段之一,是开展胚胎生物学和胚胎工程研究的基础(Chenetal,1991;Heetal,1999,2005)。小鼠超排效果除受小鼠日龄和超排激素剂量影响之外(Cuietal,2012;Yang,2007),主要受超排注射促性腺激素时小鼠所处周期阶段的影响,但国内外对于小鼠超排的适合周期阶段所获得的研究结果并不一致，如Fuetal(2005)研究表明,前期ICR小鼠超排后,其见栓率、平均可用胚胎数均高于其他周期阶段的小鼠;Guoetal(2006)对昆白系小鼠的超排后,结论为在小鼠前期的初期和间情期后期超排效果较好且两者差异不显著;而Redianetal(1994)和Tarínetal(2002)在不同品系小鼠的超排中则证明,期超排小鼠效果最好,后期和间情期超排效果较差。由于处于周期不同阶段的小鼠,其卵泡发育情况及体内激素分泌存在差异(Palermo,2007),根据小鼠周期的卵泡发育规律和生殖内分泌变化,可将小鼠周期分为前期、期、后期和间情期(Redianetal,1994),其外部表现为阴门状态的周期性变化(Nagyetal,2002)。在小鼠超排研究中一般根据小鼠阴门状态的周期性变化对周期阶段进行判断,但由于小鼠的品系或个体差异,其周期各阶段长短、阴门状态变化存在差别,导致对其阴门状态的观察结果有所差异。上述研究结果的差别,除了所用促性腺激素来源和小鼠品系的不同,各研究者所采用的判断周期阶段的方法和标准的不同可能是导致结果差异的主要原因。因此,小鼠阶段的鉴定,是进行小鼠有效超排的关键之一。本研究以获得高效超排效果为主要目的,结合小鼠阴门状态和阴道脱落细胞涂片观察,判断其周期阶段,并以卵巢组织切片验证其周期阶段的准确性,进而在小鼠周期不同阶段进行小鼠超排,追踪超排后卵泡发育情况和胚胎回收结果,确定超排开始的适宜周期阶段,为进一步提高小鼠超排效果及调整超排时间、满足空间胚胎发育研究的早期胚胎需求提供基础资料。

1材料与方法

1.1实验动物昆明系小鼠,购自第四军医大学实验动物中心。饲养间保持13h/11h的明暗周期变化(7:00—20:00光照),自由采食、饮水。雌鼠体重～25g,雄鼠体重～35g时用于试验。

1.2试剂多聚甲醛、曙红Y及中性树胶购自国药集团化学试剂有限公司;二甲苯及氯化钠购自天津博迪化工股份有限公司;苏木色精购自上海青析化工科技有限公司;无水乙醇购自西安三浦化学试剂有限公司;鳞片状切片石蜡(熔点58～60℃,LEICA39601095);切片石蜡(熔点51～55℃)购自上海标本模型厂;孕马血清促性腺激素(pregnantmareserumgonadotropin,PMSG)及人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotrophin,hCG)购自宁波第二激素厂;胎牛血清(fetalbovineserum,FBS,GIBCO16000-044);胚胎操作液(添加5%FBS的改良杜氏磷酸盐缓冲液(modifiedDulbecco’sphosphatebuffersolution,mDPBS)),使用SIGMA试剂和超纯水自制。

1.3小鼠阴门状态观察于超排当天16：00,固定雌鼠并翻提尾巴露出阴门,观察其阴门开张、阴门黏膜颜色及外阴肿胀情况,根据阴门状态观察结果将小鼠的周期阶段分为前期、期、后期和间情期,并对阴门状态进行近距拍照。参考Nagyetal(2002)所著《小鼠胚胎操作实验手册》及作者实验室以往的试验总结,根据阴门状态判定小鼠周期阶段的主要依据为：前期小鼠阴道口应未开张或微开张、稍湿润,有少量分泌物,分泌物清亮,阴门黏膜浅红色,阴门皱襞轻微红肿;期小鼠阴道口开张、较湿润,有少量浆液状或稍粘稠分泌物,阴门黏膜红色较深,皱襞明显肿胀;后期小鼠阴道口松弛或已关闭，其周边有少量浆液状或已凝固的白色分泌物,阴门黏膜颜色变为肉红色至白色,阴门皱襞肿胀逐渐消退;间情期小鼠阴道口紧闭、无分泌物,阴门黏膜呈苍白色,阴门皱襞肿胀完全消退。

1.4小鼠阴道脱落细胞涂片制作与观察采用阴门状态观察法挑选处于周期不同阶段的雌鼠,制作阴道脱落细胞涂片。雌鼠保定、暴露阴道口,将吸有少量生理盐水的滴管伸入阴道口轻轻冲洗阴道,反复冲吸几次后,回吸一滴并滴于载玻片上,制作涂片。进行H.E.染色(苏木精染色1min、伊红染色50s),随后冲片,干燥,镜检、显微摄影。通过阴道脱落细胞涂片观察,对小鼠周期阶段进行进一步鉴定。前期阴道脱落细胞以部分角化上皮细胞为主;期阴道脱落细胞以完全角化上皮细胞为主;后期以白细胞和中间层细胞为主;间情期为少量白细胞与中间层细胞(Bekyureketal,2002)。

1.5小鼠卵巢石蜡切片制作将已制作阴道脱落细胞涂片的小鼠处死,分离其双侧卵巢,剪去卵巢周围的结缔组织。将卵巢组织浸泡于4%多聚甲醛中24～48h,脱水、透明、包埋,制作连续石蜡切片(片厚7μm),H.E.染色,中性树胶封片,镜检、显微摄影。通过对小鼠卵巢石蜡切片的观察,对阴门状态观察法和阴道脱落细胞涂片法判定小鼠周期阶段的准确性进行进一步验证。

1.6小鼠的超排、配种、胚胎采集在上述试验的基础上,采用阴门观察法对处于前期、期、后期和间情期的小鼠进行超排处理,每个阶段30只。超排程序为,超排当天(0d)16：00每只雌鼠腹腔注射PMSG10IU,48h后(2d)腹腔注射hCG10IU,随即将超排雌鼠与单笼饲养的雄鼠按照1∶1比例合笼过夜配种。次日(3d)上午7：00观察记录雌鼠阴门栓形成情况。每组超排小鼠于注射PMSG24h和48h后(未注射hCG)分别处死3只,采集双侧卵巢制作石蜡切片、H.E.染色,通过切片观察卵巢上卵泡发育情况。注射PMSG94h和120h后,颈椎脱臼分别各处死超排小鼠12只,回收2细胞胚胎(输卵管)和8细胞及以上发育阶段胚胎(输卵管和子宫角)。无菌分离子宫角、输卵管和卵巢,置于盛有胚胎操作液的表面皿中进行清洗后更换表面皿。输卵管胚胎回收时,先用眼科剪剪断卵巢和输卵管之间的联系结构,再剪断子宫与输卵管联结处,将输卵管转移到盛有胚胎操作液的表面皿中,置于实体显微镜载物台上,在30倍镜下,用一支眼科异物针固定输卵管,另一支异物针撕开输卵管,直至将整个输卵管撕裂,胚胎会释放到胚胎操作液中,在实体显微镜下检出胚胎;子宫角胚胎回收时,将子宫体及子宫角置于盛有胚胎操作液的表面皿中,先用眼科剪纵向剪子宫角尖端,用吸有胚胎操作液的2mL一次性注射器从子宫体开口插入针头冲洗子宫腔,使胚胎随着液体流动而被冲出子宫,每侧用液体1.0～1.5mL,之后再重复冲洗一次,在实体显微镜下从冲出液中检出胚胎。检出胚胎用新鲜胚胎操作液清洗3次后,于倒置显微镜下观察胚胎的形态质量并分别计数。

1.7统计分析数据处理及差异性分析均在SPSS11.0软件中进行。P<0.05为差异显著,P≥0.05为差异不显著。

2结果

2.1小鼠周期不同阶段阴门外观观察小鼠阴门状态,并根据阴门状态判断小鼠周期阶段,结果见图1。

2.2小鼠周期不同阶段阴道脱落细胞涂片观察结果小鼠周期不同阶段阴道脱落细胞涂片见图2。处于前期的小鼠阴道脱落细胞以部分角化上皮细胞为主,有少量完全角化上皮细胞,细胞密度较小。其中,部分角化上皮细胞为梭形或椭圆形,可见明显的深紫色固缩核或淡染的紫红色细胞核,细胞质呈浅紫色;完全角化上皮细胞又称无核角化上皮细胞,为无规则多边形,大而扁平,无细胞核,细胞质呈浅红色(图2A)。期小鼠阴道脱落细胞绝大部分为完全角化上皮细胞,数量较多,如同堆积的落叶(图2B)。后期小鼠的阴道脱落细胞以白细胞为主,间或少量中间层细胞和完全角化上皮细胞。白细胞形态小而圆,细胞核较大,为马蹄状或分叶状,深紫色;细胞质为浅紫红色。中间层细胞呈鳞状,可见深蓝色圆形细胞核,胞质为浅紫色(图2C)。间情期小鼠阴道脱落细胞数量较少,细胞种类以中间层细胞和白细胞为主,偶尔可见完全角化上皮细胞(图2D)。

2.3小鼠周期不同阶段卵巢组织切片小鼠周期不同阶段卵巢组织切片见图3。处于前期的小鼠,其卵巢皮质部分布较多发育中的有腔卵泡,卵泡腔体积较大,但卵泡未突出于卵巢表面(图3A)。处于期的小鼠,其卵巢皮质部边缘分布较多的有腔卵泡,卵泡腔体积较大且卵泡壁较薄,多数突出于卵巢表面(图3B)；处于后期的小鼠,其卵巢切面上主要为黄体分布,少见有腔卵泡(图3C)；处于间情期的小鼠,其卵巢切面上可见较多黄体,在黄体之间分布有不同发育阶段的腔前卵泡或小腔卵泡(图3D)。

2.4周期不同阶段小鼠超排后不同时间卵泡发育情况周期不同阶段小鼠超排后不同时间卵巢卵泡发育情况见图4。前期的小鼠在注射PMSG24h后,卵巢切面可见数量较多的发育中的有腔卵泡分布,但基本未突出于卵巢表面,少见黄体(图4A1);注射PMSG48h后,卵巢皮质部边缘可见较多的有腔卵泡,卵泡腔体积较大,大部分卵泡突出于卵巢表面,少见黄体(图4A2)。期小鼠注射PMSG24h后,其卵巢皮质部浅层可见多个卵泡,卵泡腔体积较大,部分卵泡向卵巢表面突出,少见黄体(图4B1);注射PMSG48h后,部分大的卵泡突出于卵巢表面,卵巢皮质部可见新形成的黄体(图4B2)。后期小鼠注射PMSG24h后,其卵巢切面上可见有少数腔前卵泡、小腔卵泡和多个黄体(图4C1);注射PMSG48h后,可见卵巢切面上有少数有腔卵泡和多个黄体(图4C2)。间情期小鼠注射PMSG24h后,卵巢皮质部可见多个腔前卵泡和发育中的有腔卵泡以及多个黄体(图4D1);注射PMSG48h后,卵巢皮质部浅层可见多个大的有腔卵泡,卵泡壁变薄,部分卵泡突出于卵巢表面,可见较少黄体(图4D2)。

2.5周期不同阶段小鼠超排配种后的胚胎回收结果周期不同阶段小鼠超排配种后,分别在注射PMSG94h和120h回收胚胎,并分别计数发育到2细胞(或以上阶段,以2细胞计)和8细胞(或以上阶段,以8细胞计)胚胎数量,结果见表1和表2。由表1和表2可以看出,周期不同阶段超排小鼠的见栓率、回收到胚胎的超排小鼠数和超排小鼠2细胞胚胎和8细胞胚胎平均数均存在组间差异。总体趋势为,前期显著优于后期与间情期(P<0.05),并高于期,但差异不显著(P>0.05)。

3讨论

小鼠的周期一般为4～5d(Tarínetal,2002),不同阶段卵泡的不同发育状态会直接影响超排效果。所以,准确判断小鼠周期阶段,并在适宜阶段进行超数排卵,对获得有效超排结果具有重要意义。小鼠阶段的鉴定方法,目前常用的有阴门及其周围组织变化观察法和阴道脱落细胞涂片观察法(Goldmanetal,2007;Tsiligiannietal,2004)。相对于小鼠阴门外观变化的观察,阴道脱落细胞是反应卵巢卵泡发育活动的较早且较准确的迹象,以上两种方法相结合可有效判断小鼠周期阶段(Koppetal,2006)。本研究首先采取阴门观察法初步判断小鼠的周期阶段,同时采集阴道脱落细胞制作涂片并镜检作进一步判断,最后采集卵巢制作组织切片,观察卵泡及黄体的发育与消退情况,对小鼠阴门状态观察法和阴道脱落细胞涂片法所判定的周期阶段准确性进行进一步验证。结果表明,阴门皱襞较为肿胀,黏膜浅红,阴道口微张且有清亮分泌物等为前期状态(图1A),其阴道脱落细胞以部分角化上皮细胞为主,含少量完全角化上皮细胞(图2A);卵巢组织切片可见大部分卵巢切面分布有较多发育中的有腔卵泡,卵泡腔体积较大,但卵泡未突出于卵巢表面(图3A)。阴门皱襞明显肿胀,黏膜呈鲜红色,阴道口开张,有少量浆液状或粘稠分泌物等为期状态(图1B),其阴道脱落细胞绝大部分为完全角化上皮细胞(图2B);卵巢切面分布较多的有腔卵泡,卵泡腔体积较大且卵泡壁较薄,多数突出于卵巢表面(图3B)。

阴道口松弛或已关闭,阴门黏膜颜色较浅且肿胀逐渐消退,周边有少量浆液状或已凝固的白色分泌物等状态为后期(图1C),其阴道脱落细胞以白细胞为主,间有少量中间层细胞和完全角化上皮细胞(图2C);卵巢切面主要为黄体分布(图3C)。阴门皱襞不肿胀,黏膜苍白色,阴道口紧闭无分泌物等状态为间情期(图1D),阴道脱落细胞数量较少,以中间层细胞和白细胞为主(图2D);卵巢切面可见较多黄体,且黄体之间分布有不同发育阶段的腔前卵泡或小腔卵泡(图3D)。由以上结果可见,当小鼠卵泡和黄体发育及消退呈周期性变化时,卵泡颗粒细胞分泌的雌激素和黄体细胞分泌的孕激素也随之呈周期性的改变,引起以阴门黏膜肿胀消长、黏膜颜色及阴道分泌物的改变为主要特征的阴门及其周围组织的周期性变化。而阴道黏膜上皮细胞在激素作用下,呈周期性的增殖、成熟及脱落,使阴道脱落细胞(如部分角化上皮细胞、完全角化上皮细胞、中间层细胞等)的类型和数量表现周期性变化(Catchpoleetal,2003)。同时,周期中发生的周期性阴道分泌物的增加与减少以及阴门的开张与闭合导致阴道酸性环境的改变,使阴道细胞类群中白细胞的数量表现周期性的增减变化(Zhangetal,2006)。在上述研究的基础上,对阴门观察法配合阴道脱落细胞涂片判断周期阶段的小鼠,分别于前期、期、后期和间情期进行超排处理。在注射PMSG后24h和48h(未注射hCG),分别采集超排小鼠卵巢制作组织切片,追踪超排后卵泡发育情况;对完成超排注射程序并配种的小鼠,分别于注射PMSG94h和120h处死、回收胚胎,并分别计数发育到2细胞(或以上阶段)和8细胞(或以上阶段)胚胎数量,比较周期不同阶段超排小鼠的超排、受精及胚胎发育情况(注：实验室尚未发表的超排小鼠胚胎发育时程研究证明,在注射PMSG94h和120h后,2细胞(或以上阶段)和8细胞(或以上阶段)胚胎比例达到峰值,故本研究选择这两个时段分别评价受精卵发育到2细胞和8细胞阶段的数量)。结果表明,前期小鼠在注射PMSG24h后,卵巢切面发育中的有腔卵泡数量较多,但尚未突出于卵巢表面(图4A1);注射PMSG48h后,卵巢切面边缘可见较多有腔卵泡,卵泡腔体积较大,且大部分卵泡突出于卵巢表面(图4A2)。说明由于前期小鼠卵巢上有腔卵泡数量较多,在主要起促进有腔卵泡生长发育的促性腺激素(PMSG)作用下,多个有腔卵泡进一步生长发育成熟(Fortune,2003),并可能会在促进卵泡进一步成熟并排卵的促性腺激素(hCG)作用下最后发育成熟并排卵,获得较好的超排效果。

2细胞胚胎和8细胞胚胎回收结果也验证了卵泡发育的组织学追踪结果。对于期小鼠,在注射PMSG24h后,卵巢组织切面可见多个成熟卵泡(图4B1),并在注射PMSG48h后,已有部分成熟卵泡排卵、形成黄体,而另有部分卵泡陆续发育到三级卵泡和成熟卵泡阶段(图4B2)。在这种情况下,虽然也可能会获得较好的超排效果,但由于出现超排程序中尚未注射排卵激素时即已发生部分卵泡的排卵,而造成排卵不整齐,受精后胚胎发育阶段不整齐，甚至使过早排卵的卵母细胞失去受精能力,而使正常发育的胚胎数量减少。该阶段小鼠胚胎回收结果表明,2细胞胚胎和8细胞胚胎回收数量均低于前期超排小鼠,但差异不显著(P>0.05)。后期进行超排的小鼠,在注射PMSG24h后,其卵巢切面仅见少数腔前卵泡、小腔卵泡和多个黄体(图4C1);注射PMSG48h后,则有少数有腔卵泡和多个黄体(图4C2)。这说明在这一时期开始超排,能够接受外源性促性腺激素刺激效应的有腔卵泡数量较少,不足以引起有效的超排结果。该阶段小鼠胚胎回收结果也说明了卵泡发育的追踪结果,其2细胞和8细胞回收数均显著低于前期超排小鼠(P<0.05),同时2细胞回收数显著低于期超排小鼠。间情期小鼠超排注射PMSG24h后,卵巢切面可见多个腔前卵泡和发育中的有腔卵泡,以及多个黄体(图4D1);注射PMSG48h后,卵巢皮质部浅层可见多个大的有腔卵泡,卵泡壁变薄,部分卵泡突出于卵巢表面,可见较少黄体(图4D2)。这说明在这一阶段开始超排的小鼠,由于卵巢上仍然存在黄体,并开始出现数量较多的腔前卵泡和小的有腔卵泡,外源性促性腺激素可诱导有腔卵泡进一步生长发育并成熟,从而起到一定的超排效果。胚胎回收结果表明,其超排结果显著低于前期小鼠(P<0.05),虽与期小鼠差异不显著,但正常胚胎回收数明显偏低。该结果说明,小鼠周期阴门状态和阴道脱落细胞类型的变化能够在一定程度上反映卵巢上卵泡发育和黄体形成与消退的动态变化,即通过阴门状态观察和阴道脱落细胞涂片观察,能够在一定程度上判断卵巢上卵泡发育和黄体形成与消退的动态变化,可以作为判断小鼠周期阶段的依据。超排后24h和48h的卵泡发育追踪结果和之后的胚胎回收结果说明,处于周期不同阶段的小鼠超排后,其卵泡生长发育、成熟规律以及胚胎回收结果存在明显差异,其中前期小鼠超排后卵泡发育规律、正常发育成熟的卵泡数量及胚胎回收数量较为理想,是适宜超排的周期阶段。