正交实验法优选九味阿胶膏提取工艺研究

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【摘要】目的优选九味阿胶膏的最佳提取工艺。方法以黄芪甲苷的含量为指标，ELSD-HPLC法测定指标成分含量，采用正交试验设计考察加水倍数（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）三个因素的影响，确定九味阿胶膏的最佳提取工艺。结果煎煮因素按影响大小依次是煎煮次数（c）>加水倍数（A）>加醇倍数（B），最佳提取工艺条件为：A282C3。结论该制备工艺合理可行。

【关键词】九味阿胶膏；正交试验法；ELSD-HPLC；黄芪甲苷

【中图分类号】R284.1 【文献标识码】B 【文章编号】2095-0616（2015）21-51-03

九味阿胶膏是安徽省中医药大学第二附属医院临床使用多年的经验膏方。该方由阿胶、黄芪、山楂、枸杞等九味中药材加工精制而成。具有补肝肾，养精血，益气健脾，养心安神，滋阴润肺，温经散寒之功效。临床上主要用于治疗气血两虚证。本文采用正交试验法，以黄芪甲苷的含量为指标，对九味阿胶膏的提取工艺进行考察，筛选最佳的提取工艺。

1仪器与试药

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津），Sedex75 ELSD检测器；梅特勒xp56型百万分之一电子天平（瑞士）；梅特勒AG285电子分析天平（瑞士），黄芪甲苷（110781-200512）、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），水（超纯水），其他试剂均为分析纯。黄芪等药材购自合肥市中药饮片厂义和堂药店。

2方法

2.1正交工艺设计

选择加水倍数（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）为考察因素，种因素取3个水平，因素水平设置，见表1。

2.2黄芪甲苷含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱：Shim Pack CLCODS柱（250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（32：68）；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；ELSD漂移管温度为83℃；氮气压力为2.0bar；理论板数按黄芪甲苷计算应不低于4000。

2.2.2对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品（110781-200512）10.077mg，加甲醇溶解并定容至25mL，摇匀，即得。

2.2.3供试品溶液的处理 按九味阿胶膏处方，称取黄芪17.7g，山楂15g及其他煎煮药材共111g，按L9（34）正交表（见表2），以水平因素表（见表1）规定的加水量、煎煮时间、煎煮次数煎煮，滤过，合并滤液，适当浓缩并定容至500mL量瓶，摇匀。精密量取正交试验1～9号溶液各25mL，置分液漏斗中，加水饱和的正丁醇溶液25mL，振摇提取4次，分取正丁醇液，合并4次提取液，加2%氢氧化钠溶液25mL，萃取2次，弃去氢氧化钠溶液，正丁醇液再加水25mL，萃取2次，弃去水液，正丁醇液水浴挥干，残渣以适量甲醇溶解，定量转移置5mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45μm滤膜滤过，即得正交试验的9份供试品溶液。

2.2.4对照品溶液线性关系考察分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液（0.4031mg/mL）2、4、8、12、16、20μL，依法测定峰面积，以黄芪甲苷进样质量的常用对数值为横坐标，黄芪甲苷峰面积的常用对数值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：IgA=1.38551gC+1.9782（r=0.9998，n=6）。结果表明：黄芪甲苷的质量在0.8062～8.062μg之间质量的常用对数值与峰面积的常用对数值呈良好的线性关系。

2.2.5精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液（0.4031mg/mL）20μL，连续进样6次，依法测定峰面积积分值，计算，RSD=0.65%，说明仪器的精密度良好。

2.2.6供试品溶液的测定依照上述色谱条件，精密吸取正交试验1～9号供试品溶液各20μL，依法测定。色谱图见图1～2。

3结果

3.1正交试验

根据上述色谱条件，依次测定9份供试品溶液中黄芪甲苷的峰面积，将峰面积积分值的常用对数代入标准曲线，计算黄芪甲苷的含量，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

由方差分析结果可知，各因素显著性差异依次为C>A>B，即煎煮次数>加水倍数>煎煮时间。方差分析显示因素A和因素C的影响具有显著性差异，其中A3>A2>A1，C3>C2>C1，因素B的影响无显著性差异。因此，最终确定的最佳提取工艺为A382C3，即加10倍量水，煎煮3次，每次1.5h。

3.2验证试验

依照处方，称取黄芪17.7g，山楂15g及其他煎煮药材共111g，按上述优选的工艺条件煎煮，平行试验3次，结果黄芪甲苷平均含量为16.0212mg，RSD=1.39%。表明工艺条件稳定可行。

4讨论

九味阿胶膏由九味中药材组成，阿胶为方中君药，但因阿胶是烊化后与清膏合并，不参与煎煮，故本文未选择君药的有效成作为考察指标。而黄芪为方中成药，其主要有效成分有多糖类、黄酮类、皂苷类和氨基酸等。2010版中国药典收载了黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定，但由于毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量较低，仅为黄芪甲苷含量的一半，且黄酮类成分容易扰，故本研究未采用毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为含量测定指标。ELSD-HPLC法测定中药复方中黄芪甲苷含量的论文报道较多，在参考文献的基础上，本研究选择黄芪甲苷作为含量测定的查考指标。在正交试验之前，还考察了药材吸水率实验，平均吸水率为1.1倍，故第一次煎煮的加水量多加1.1倍的水。

目前，大多数中医院使用的院内制剂工艺都比较简单，多为生药粉制备的丸剂或简单的水煎剂，本研究方法和结果可以给医院的制剂工艺优化提供参考和依据，也可以给含黄芪的复方制剂的含量测定提供参考。

根据黄芪甲苷含量的测定结果，煎煮时间对结果的影响未见显著性差异，故从节约成本的角度考虑，工业化生产时可选择只煎煮1h。最后的验证试验也很好的说明了，本文筛选的工艺条件是合理的，可重复的，适合工业化生产的。