小老鼠胚胎着床控制性基因影响

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目前辅助生殖技术(ART)日趋成熟,但仍摆脱不了高排卵率、低妊娠率的难题。其中,胚胎着床率低是影响妊娠结局的主要制约因素,可能与控制性超促排卵(COH)引起的子宫内膜容受性降低相关[1,2]。子宫内膜容受性指正常子宫内膜在极短的、特定的时期内允许胚胎着床的特性,这一时期称为“着床窗口期”(即人正常月经周期的20~24d,小鼠妊娠后4d)。研究证实[3,4],HOXA-10基因是子宫内膜容受性建立及基质细胞蜕膜化的重要调节因子,对胚胎着床起着关键性的调控作用,其表达峰值与着床窗口期的开放时间一致,目前已成为评价子宫内膜容受性的基因标志物之一。本研究采用临床常用的GnRH-a/hMG/hCG超促排卵长方案,建立小鼠COH模型,观察COH对小鼠着床期子宫内膜Hoxa-10表达及妊娠率、胚胎着床率的影响,探讨COH影响胚胎着床的机制,为临床IVF-ET过程中改善子宫内膜容受性、提高妊娠率提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物雌性成年健康未孕SPF级昆明小鼠[许可证号为:SCXK(军)2007-004],鼠龄为8~10周,体质量35~40g,自由饮水取食,连续观察2个动情周期均正常。

1.2主要试剂注射用醋酸丙氨瑞林(GnRH-a)购自安徽丰原药业股份有限公司马鞍山药厂;注射用尿促性腺激素(hMG)(乐宝得)(购自丽珠集团丽珠制药厂);注射用绒毛膜促性腺激素(hCG)为丽珠集团丽珠制药厂产Marker(DL2000)和SYBRGreen试剂盒(DRR086A)均购自TaKaRa公司;琼脂糖购自Spain公司;SP免疫组织化学试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司PCR引物用PrimerPremier5.0软件设计,由天一辉远公司合成,引物序列详见表1。品;氯化钠注射液为山东齐都药业有限公司产品;山羊抗鼠HOXA-10多克隆抗体为SantaCruz公司产品;生物素标记兔抗山羊IgG抗体购自北京中杉公司;RNAstore为百泰克RP1301产品;RNA提取试剂盒(D9086)、逆转录试剂盒(DRR014A)、DNA

1.3造模与分组参考有关文献[5,6],建立超促排卵动物模型。将纳入实验的小鼠按随机数字表法进行体质量分层分组:实验组于小鼠动情后期每日9∶00连续腹腔注射丙氨瑞林0.4μg/g,连续9d,用药4d后见阴道分泌物涂片周期变化减小,表明垂体抑制,至第9日9∶00同时腹腔注射hMG0.4IU/g,48h后注射hCG100IU/g;对照组均以等体积生理盐水代替。造模成功后按雌∶雄比例2∶1合笼,检查到阴道栓确定为妊娠第1日,计算妊娠率。于妊娠第4日小鼠尾静脉注射0.2ml体积分数0.5%伊文思蓝,约10min后颈椎脱臼处死。剖腹取卵巢和子宫,分离子宫,进行胚胎着床数及着床率的计算。生理盐水漂洗子宫后,将每只小鼠的子宫左右角分开,一半子宫固定于体积分数4%多聚甲醛溶液中以备切片,另一半置于RNAstore中,-80℃保存,以备检测mRNA。

1.4胚泡着床率的计算子宫伊文思蓝染为深蓝色部位即为小鼠胚泡着床位点,进行胚泡着床数的统计。参照Myers等计数法[7],进行胚泡着床数的统计,具体计算公式是:胚泡着床率＝胚泡数/黄体数×100%。卵巢用体积分数4%多聚甲醛溶液固定,从卵巢中线开始切取组织切片,每个动物切片5张,每张切片厚度4~6μm,间隔240μm,总共200张。由一名观察者用显微镜观察每张切片上的黄体,进行黄体计数。

1.5小鼠子宫内膜HOXA-10蛋白表达的检测将固定于多聚甲醛溶液中的小鼠子宫常规石蜡包埋,切片厚度4~6μm,采用免疫组织化学S-P法进行染色:操作按照试剂盒说明书要求进行,切片常规脱蜡,梯度酒精中浸泡,体积分数0.3%H2O2-甲醇室温孵育30min,去除内源性过氧化物酶,热修复抗原,滴加HOXA-10单克隆抗体(l∶300)37℃孵育2h,0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照,滴加山羊抗鼠IgG抗体——HRP多聚体37℃孵育30min,DAB-H2O2室温下显色,光学显微镜下控制DAB显色反应时间,显色后脱水、透明、封片。光学显微镜下观察,无染色为阴性,淡黄色为弱阳性,黄色为阳性,深棕色为强阳性,对结果进行判读。每组40只小鼠,取其中5只小鼠,每只小鼠取2张切片,总共10张切片,每张切片观察3个视野。

1.6小鼠子宫内膜Hoxa-10mRNA表达的检测

1.6.1半定量RT-PCR严格按试剂盒说明操作提取子宫内膜组织总RNA,测定OD260及OD280以估算总RNA的浓度及纯度,并用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA完整性。合格后取各组总RNA各1μg分别逆转录合成cDNA,进行PCR反应。反应体系25μl:10×PCRBufferII2.5μl,dNTPMixture1μl,Primer-F0.25μl,Primer-R0.25μl,TaKaRaEXTaqHS0.25μl,cDNA2μl,RNaseFreedH2O18.75μl,扩增Hoxa-10及β-actin基因,扩增条件:94℃预变性1min;94℃变性30s,59℃退火30s,72℃延伸15s,30个循环;最后72℃延伸10min。取各组PCR产物行15g/L琼脂糖凝胶电泳,用MolecularAnalyst图像分析软件对电泳条带进行灰度分析,以各标本目的基因电泳条带灰度值与β-actin内参照条带灰度值比值表示目的基因的相对表达强度。

1.6.2Real-timePCR基因表达采用相对定量,以反转录反应:42℃5min,95℃10s;PCR反应:95℃5s,60℃30s,40个循环。温度变化速度为20℃/s,在每个循环的延伸末检测荧光信号。融解曲线分析:95℃0s,60℃15s,95℃0s,温度变化速度为0.1℃/s,同时连续监测双链DNA逐渐变性过程中荧光信号的变化情况,绘制PCR产物的融解曲线,以了解样品扩增的特异性,保证测定结果的准确可靠。

1.7统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行分析处理。数据以均数±标准差(x-±s)表示;两组间比较采用t检验,检验水准取双侧α=0.05。察可见:实验组腺体少且腺腔直径小,血管少,腺腔中无分泌物,内膜腺体与间质发育不同步,间质致密,间质细胞多呈梭形,间质内血管充盈不明显,腺体发育延迟于间质。HOXA-10蛋白的表达以胞核黄染或出现黄至棕黑色颗粒为阳性,结果显示,HOXA-10蛋白在腺上皮、腔上皮和间质细胞胞质中均有表达,且子宫内膜组织增生、间质细胞分裂增殖越明显,HOXA-10蛋白表达也越明显。实验组HOXA-10蛋白总体表达水平明显低于对照组(P<0.05),详见表3,图2。3讨论COH是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中必不可少的环节,随着COH方案的不断完善,临床受精率已达75%~90%,但临床妊娠率却徘徊在20%~30%水平。

2结果

2.1小鼠阴栓率、妊娠率及着床期小鼠胚胎着床率情况实验组小鼠阴栓率及妊娠率均明显低于对照组(P<0.01),对照组观察到阴栓的小鼠均成功妊娠,实验组观察到阴栓小鼠妊娠率仅为72.2%;妊娠率=妊娠小鼠数/总雌鼠数。实验组着床期胚胎着床数虽高于对照组(P<0.01),但着床率却明显低于对照组(P<0.05),见表2。

2.2小鼠着床期子宫内膜Hoxa-10mRNA及蛋白的表达半定量RT-PCR和Real-timePCR检测均提示:与对照组比较,实验组着床期子宫内膜Hoxa-10mRNA表达水平均下降,差异有显著性(P<0.01)(图1)。子宫内膜免疫组织化学结果的光学显微镜下观2-?Ct来表示,?Ct＝待测基因Ct值-内参照基因Ct值。荧光染料:SYBR?GreenI,反应体系为25μl:2×OneStepSYBR?RT-PCRBuffer412.5μl,PrimeScript1StepEnzymeMix21μl,Primer-F1μl,Primer-R1μl,TotalRNA2μl,RNaseFreedH2O7.5μl。促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)是近年来广泛应用的辅助促排卵药物,它能预防内源性LH过早波动,避免过早黄素化,提高卵细胞质量,促使多卵泡发育,增加取卵成功率[7,8]。GnRH-a的发明及应用是人类辅助生殖史上的里程碑,虽然将GnRH-a用于ART,但临床妊娠率未见升高。Srisuparp、Thomas等认为[9,10],GnRH-a虽然能在晚卵泡期预防过早LH峰的出现,却可能给子宫内膜对胚胎的容受性造成不良影响。

GnRH-a超排方案降低了子宫内膜对胚胎的容受性,导致辅助生殖高排卵率、低妊娠率的结局。对IVF-ET者进行回顾性研究[10],A组患者将她的一半卵子赠送给受者(B组),供者和受者同时进行胚胎移植,结果受卵者种植率为39%,而赠卵者种植率仅为22.5%,两者冷冻周期的种植率却无明显差异,说明COH使子宫内膜容受性降低。影响子宫内膜容受性的因素众多,包括内膜厚度、容积、形态、血供、同源框基因(homeoboxgene,HOX)的表达、局部的激素分泌、细胞因子、生长因子的分泌等[11]。其中,HOX是一类调控胚胎发育和细胞分化的家族基因。HOXA-10在生殖过程中的作用近年来逐渐受到瞩目,它参与调节胚胎的发育与分化、子宫内膜的增殖和分化、子宫内膜蜕膜化等,对内膜的发育进程进行着精密的时空调节,与子宫内膜容受性及胚胎着床密切相关。许多学者已经把HOXA-10作为衡量子宫内膜容受性的分子标志,子宫环境中HOXA-10基因表达缺陷,可使胚胎不能正常发育,子宫内膜不能进入接受状态,导致胚胎死亡和植入失败[12]。近年来有研究表明[13]:HOXA-10表达下降会引起着床和蜕膜化障碍。一些与不孕相关疾病如输卵管积水、子宫内膜异位症和PCOS患者子宫内膜中HOXA-10基因表达下降,而在不明原因不孕妇女的子宫内膜中HOXA-10mRNA的表达量也明显降低[14],HOXA-10的异常表达证实[15-19],与多种妇科疾病(不孕、流产、异位妊娠、内膜异位及肿瘤等)相关。因此,掌握HOXA-10在COH后子宫内膜的表达规律,将对如何改善子宫内膜容受性、提高妊娠率提供理论依据。

研究表明[20],GnRH-a作为周期降调节药物,超促排卵治疗后,可干扰内源性甾体激素生理平衡及受体的正常表达,导致子宫内膜在形态学、受体及相关因子的表达上发生变化,但GnRH-a降调节促排卵后子宫内膜HOXA-10的表达报道较少。本研究结果表明,GnRH-a长方案超排卵后,小鼠阴栓率及妊娠率均有明显降低,子宫内膜Hoxa-10mRNA及蛋白表达较对照组均明显降低。提示GnRH-a长方案超促排卵会影响子宫内膜中Hoxa-10的表达,导致妊娠率降低。结合相关文献及本研究结果,推测GnRH-a长方案COH引起子宫内膜容受性下降的原因:超促排卵过程中外源性超生理水平激素的应用干扰了内源性激素的生理平衡,使正常体内环境发生改变,内源性激素及受体的异常表达影响了子宫内膜相关基因HOXA-10的表达[21],子宫内膜形态学发生改变,胞饮突提前出现[22],内膜发育与胚胎发育不能同步,子宫内膜容受性难以维持在最佳状态,着床窗口期提前关闭,影响了胚胎着床,导致妊娠率及着床率降低。

总之,GnRH-a长方案COH为人类解决促排卵问题的同时也带来了子宫内膜容受性降低和临床妊娠率低的难题,本文从着床期相关基因HOXA-10的表达情况来探索COH引起子宫内膜容受性下降的原因,为进一步寻求方法以改善子宫内膜容受性、提高临床妊娠率提供理论依据。