中药抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜研究进展
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摘要：金黄色葡萄球菌是临床感染最为常见的病原菌，抗生素滥用使细菌耐药性增强，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是主要突变株。生物膜的产生进一步降低了抗生素MRSA菌体的杀伤作用，使该疗法受到更多限制。新的抗MRSA感染药物亟待开发，中药作为天然药物受到更多关注，本文就近年来中药抗MRSA生物膜的研究进行综述，为新药研发提供参考。
关键词：中药；生物膜；金黄色葡萄球菌；综述
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.035
中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0132-05
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）自1961年首次从临床分离以来，其耐药性迅速在世界范围内传播，成为严重威胁人类生命健康的多重耐药性病原菌。Holland T L等[1]通过文献研究认为，万古霉素和达托霉素是目前治疗MRSA感染的一线抗生素，而万古霉素耐药MRSA的分离使最后一道防线被瓦解[2]。MRSA抗生素耐药机制复杂，主要包括自身基因的突变、外源基因的内化以及抗生素外排泵系统等；自然条件下，在细菌生物被膜这样一个有机体中通常含有多种细菌，这就使不同细菌间得以相互接触，使其成为耐药基因转移的一个途径。Wessam A等[3]通过对血管内MRSA感染的研究发现亚万古霉素抑菌浓度可以诱导MRSA生物被膜的形成，进而降低万古霉素对MRSA菌体的杀菌作用。简言之，生物被膜对抗生素具有极强的抗性，因此，对细菌生物被膜的清除应该摒弃传统的抗生素疗法[4]。中药药源广泛、不良反应少且耐药性低，具有独特优势，从
1 研究方法
1.1 生物膜体外模型制备
生物膜是一个微生物聚集群体，细胞首先固着到基质表面，或个体之间相互连接并固着，进而向胞外分泌多糖及蛋白等基质成分并嵌入其中，在生长、基因表达和蛋白产物方面呈现不同于单个细胞的表型，结构分析表明他们通常呈现柱子或蘑菇样结构[5]。生物膜体外模型的建立是研究生物膜的前提，生物膜的形成受到培养基成分、酸碱度、培养温度、培养时间及细菌接种浓度等多方面的影响。综合国内外文献中采用的方法，生物膜体外模型建立的方法主要有以下2种。
动态模型，是指在体外模拟医用导管或水管通路中生物膜的形成，使贴壁微生物连续处于流动的培养基中，避免因封闭培养时间过长导致的营养条件变化，更接近真实的生物膜形成过程。多种装置采用此种原理建立生物膜，Coenye T等[6]在其生物膜模型研究的文献中对多种动态生物膜体外模型进行了阐述，如罗宾斯装置（MRD）、CDC生物膜发生装置等，本文以典型代表管路法和加尔卡里生物膜装置（CBD）法为代表进行阐述。管路法是无菌条件下将一定浓度的菌液接种到载体中，载体通常是导尿管这样的生物活性材料，待细菌贴壁后，通过蠕动泵将新鲜培养液持续不断导入载体中，孔金艳等[7]在对内镜活检管路中生物被膜去除的研究中采用了此种方法，Mirani Z A等[8]在研究苯唑西林对MRSA生物膜的研究中也采用此种方法成功建立MRSA生物膜；CBD是一种建立细菌生物膜的商品化装置，用于检测细菌生物膜对特定药物的敏感性，该装置包括2部分，上部是生物膜形成装置，由含96个小柱的上盖和对应的96孔底板组成，下部是动力装置，可以不断摇动使上盖小柱上的生物膜处于96孔底板的动态培养液中[9]。
静态模型是一种封闭模型，是指在体外通过静置培养的方法，使细菌粘附到特定载体上进而形成生物膜的方法，建模过程中没有培养液的流进流出，因此培养环境时刻处于变化中，需要定时更换培养液。目前该种方法主要包括试管法、微孔板法、置片法等。试管法是1982年由Christensen G D等[10]设计的用于检测生物膜形成的方法，将一定浓度和体积的菌液加入无菌试管中，经过特定时间和条件的培养，在试管底部或培养基的表面形成生物膜，如Kaur D C等[11]对伤口感染中MRSA生物膜形成能力和抗生素敏感性的研究中采用了此种方法，该方法简便灵活快捷，至今仍在生物膜研究中发挥作用；微孔板法是生物膜体外研究中最为常用的方法，将一定浓度的菌液接种到微孔板中（通常为96孔培养板），经过特定时间的培养，在微孔板的底部和侧壁会形成生物膜，去除上清培养液中的浮游细菌，即可对留在孔底与侧壁的生物膜进行研究，如Murugan K等[12]对导尿管中细菌生物膜的研究中同时采用了试管法与微孔板法；置片法是在微孔板法的基础上，预先在微孔板中（通常为6、12、24孔培养板）加入无菌硅胶或载玻片等载体，使生物膜在一定面积的载体上生长，成熟生物膜可随内置玻片从微孔板中取出，研究方法更为多样，定量更为精确，如Pereira F D等[13]用质谱法分析绿脓杆菌生物膜结构时成功采用这种方法在盖玻片表面建立生物膜。
1.2 生物膜模型检测与评估
伴随新技术的发展，生物膜检测方法更加多样化，目前检测方法有活菌计数法、染色法、电镜观察法、激光共聚焦显微镜观察法、分子生物学手段检测生物膜基因等。活菌计数法是对生物膜进行定量分析的简便方法，以超声震荡等机械手段将生物膜从载体上剥离，通过平板计数法对生物膜内的活菌进行计数；染色法利用生物膜成分能与特殊染料结合的原理对其进行定量，最常用的是结晶紫染色法，待生物膜形成之后，去除培养基和浮游状态的细菌，风干后用1%结晶紫染色20 min，弃去染色液并用无菌生理盐水冲洗至无色，以95%乙醇脱色，用酶标仪测定吸光度；电镜观察法包括扫描电镜和透射电镜观察法，主要对生物膜的内部结构和表面特征进行表观观察，但是电镜样本的处理经过脱水破坏了生物膜原始的结构，因此这种方法在生物膜的研究中受到一定的限制；相比较而言，激光共聚焦显微镜样本无需特殊处理，结合荧光染色法进行直接观察，在生物膜研究中具有明显的优势；生物膜形成相关基因（如icaRABCD基因）的检测，包括PCR、RT-PCR等是分子生物学中常用的方法。实际研究中，通常采用多种方法结合对生物膜进行定性定量分析，如Neu T R等[14]观察细菌生物膜结构时采用了扫面电镜和共聚焦显微镜观察的方法；Soraya M O等[15]采用结晶紫染色法和基因检测法来测定人血中分离的葡萄球菌生物膜对抗生素的敏感性。
2 研究进展
2.1 单味中药提取物研究
地榆有凉血止血、清热解毒、消肿敛疮等功效，Chen X等[16]以奶牛乳腺炎中分离的MRSA作为供试菌株，研究了地榆乙醇提取物对该菌株的活性和生物膜形成能力的影响，通过激光共聚焦显微镜观察到，实验组与对照组相比，细菌生物膜结构松散且生物膜含量明显降低，揭示地榆乙醇提取物对MRSA生物膜具有明显的抑制作用。盐肤木，又称五倍子树，根、叶、花及果均可入药，有清热解毒、舒筋活络、散瘀止血、肠止泻之效，You Y O等[17]采用扫描电镜和沙皇染色法研究了盐肤木树叶乙醇提取物对MRSA生物膜的作用，结果显示高于0.05 mg/mL浓度即具有明显的清除作用，并进一步通过RT-PCR检测毒力相关基因mecA、agrA、sarA等，结果显示具有明显抑制毒力因子基因表达的作用，初步化学成分分析表明起作用的可能是酚类物质。黄晓敏等[18]则研究了五倍子水提物对金黄色葡萄球菌生物膜的的影响，结果显示五倍子水提物对膜内细菌有一定的清除作用，2组实验研究均揭示五倍子在抗金黄色葡萄球菌生物膜感染中的作用。鹅掌楸叶和树皮可入药，味辛、性温，有祛风除湿、散寒止咳的作用，Tan X等[19]采用结晶紫染色法研究了鹅掌楸的己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇5种提取物对MRSA生物膜的影响，结果显示，二氯甲烷和己烷提取物对生物膜具有明显的清除作用，其中二氯甲烷提取物是通过影响其群体感应机制来影响生物膜形成的，为中药提取物影响生物膜机制的研究提供了思路。甘草用于解毒、抗变态反应，抗溃疡、消炎，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌有明显抑制作用，喻华英等[20]通过微孔板法获得奶牛乳腺炎中分离的MRSA生物膜，并通过结晶紫染色法检测了不同浓度的甘草提取物对生物膜的影响，结果显示在低浓度时能促进生物膜的生长，高浓度时能抑制生物膜生长，提示甘草提取物中某些成分具有抑制生物膜形成的作用。蒲公英具有清热解毒、消肿散结、抗病原微生物、提高免疫力、利胆保肝功效，霍佳楠等[21]通过扫描电镜观察和结晶紫染色法研究蒲公英水提物对金黄色葡萄球菌生物膜的影响，结果显示蒲公英水提物不仅能够抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，而且还对成熟的金黄色葡萄球菌生物膜具有消除作用，提示蒲公英水提物有预防金黄色葡萄球菌生物膜引起的慢性感染的作用。蜂胶具有抗菌消炎、促进组织再生、抗肿瘤、抗氧化和改善心血管功能，朱明等[22]以微孔板法建立金黄色葡萄球菌生物膜，检测新疆黑蜂胶醇提物对其影响，结果显示低浓度黑蜂胶提取物不仅对膜内菌具有清除作用，而且具有清除成熟生物膜的能力，高浓度提取物杀菌效果与抗生素无异，提示黑蜂胶在生物膜防治中具有明显的作用。
2.2 中成药研究
痰热清是用于治疗发热、咳嗽、咯痰不爽等上呼吸道感染的中成药注射液。Wang Y等[23]发现与青霉素比较，痰热清对金黄色葡萄球菌浮游菌的清除能力无明显优势，但以结晶紫染色法和激光共聚焦显微镜研究痰热清和青霉素作用前后其生物膜变化，发现痰热清无论在抑制生物膜形成还是清除膜内活菌的过程中都具有明显优势，首次报道了痰热清注射液的抗生物膜活性作用，为研究中成药抑菌提供了依据。清开灵颗粒具有清热解毒作用，含有金银花等多种清热成分，对上呼吸道感染有较好疗效。李将等[24]采用结晶紫染色法测定清开灵颗粒对金黄色葡萄球菌生物膜的破坏作用，生物膜抑制实验和破坏实验表明在3.9～62.4 mg/mL浓度范围内清开灵颗粒具有良好的作用，且呈浓度依赖性，除此之外，韩雪等[25]采用微生物活性检测试剂盒-水溶性四唑盐染色、扫描电镜及流式细胞仪动态观察等方法研究了清开灵注射液对金黄色葡萄球菌细菌生物膜的影响，清开灵注射液既能抑制金黄色葡萄球菌细菌生物膜的形成又可破坏其成熟细菌生物膜，以上2组研究均提示清开灵的抗生物膜作用。连花清瘟胶囊在治疗细菌性肺炎和急性上呼吸道感染中具有良好的效果。雷洪涛[26]等采用结晶紫染色法和微生物活性检测法观察连花清瘟胶囊和青霉素抗金黄色葡萄球菌生物膜的作用，用扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察药物作用后的形态并测量厚度，结果显示与对照组比较，连花清瘟胶囊组对金黄色葡萄球菌具有明显的清除作用，而青霉素组对生物膜的清除效果不明显。王艺竹等[27]亦对连花清瘟水提物作了类似研究，得出相同结论，提示在金黄色葡萄球菌生物膜抗感染中，中成药具有开发价值。
2.3 中药活性成分研究
穿心莲有效成分-穿心莲内酯具有解热抗炎抗病毒、保肝利胆、免疫调节抗肿瘤等多种药理作用。周薇等[28]采用结晶紫染色法和扫描电镜观察法，设立穿心莲内酯干预组、庆大霉素干预组、联合干预组研究作用前后金黄色葡萄球菌生物膜变化，穿心莲内酯对金黄色葡萄球菌生物膜无直接杀菌作用，但对生物膜具有良好抑制作用，与庆大霉素联合应用，具有协同抗生物膜作用。桂皮醛是中药肉桂的中药成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种作用，是较好的局部治疗药物。贾蓓蓓等[29]采用皮下羧甲基纤维素钠（CMC）-囊袋法制备MRSA在大鼠体内的生物膜模型，以生理盐水设立对照组，桂皮醛给药后以菌落计数法检测结果，显示桂皮醛对大鼠体内MRSA生物膜具有明显清除作用。桑螵蛸具有补肾固精、缩尿止带的功效，临床上多与其他中药配伍作为利尿剂使用。王文东等[30]以微孔板法建立金黄色葡萄球菌生物膜体外模型，采用光学显微镜观察法研究桑螵蛸挥发油对其作用，桑螵蛸挥发油提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的形成有明显抑制效应。鱼腥草素钠是鱼腥草挥发精油中主要成分鱼腥草素（癸酸乙醛）和亚硫酸氢钠的加成物，对革兰阳性菌有较好的抗菌活性。史祺云等[31]以激光共聚焦显微镜法研究了鱼腥草素钠对金黄色葡萄球菌生物膜的清除能力，结果显示其对浮游菌具有明显的清除能力，而对成熟生物膜作用较小，在生物膜形成早期具有一定的抑制作用。黄莹莹等[32]研究发现黄芩素对金黄色葡萄球菌生物膜有破坏作用，联合左氧氟沙星作用于金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌疗效。研究表明，亚致死浓度的牛至精油可以削弱金黄色葡萄球菌的生物被膜形成，并进一步证实香芹酚能够显著降低聚苯乙烯表面的生物量和细菌黏附数[33-34]。
2.4 其他研究
除上述对中药单体、中药活性成份及中成药在金黄色葡萄球菌生物膜清除中的研究外，相关研究还包括中药复方以及中药作为佐剂与抗生素联合应用的研究。黄晓敏等[35]在扫描电镜下观察到溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜具有清除作用；申凤鸽等[36]采用激光共聚焦显微镜研究了骆驼蓬灵单独及与洗必泰联合对抗金黄色葡萄球菌悬浮菌和生物膜，在生物膜试验中具有协同抗生物膜和相加活性，为克服金黄色葡萄球菌耐药提供了一个可供选择的方法；张春雷等[37]采用微量棋盘稀释法进行联合抑菌试验，以观察五味消毒饮联合红霉素抗MRSA生物膜的做用，结果显示五味消毒饮单独对MRSA生物膜没有明显的抑菌作用，但其水煎液与红霉素有较强的协同作用，并对MRSA生物膜有抑制作用。
3 结语
目前，中药用于MRSA生物膜抑制的研究大都局限于现象的观察，机理研究较为少见。已研究的中药多数为清热药，而利水、解表等，其他类型中药研究较为少见，并且尚无对常见中药进行大量筛选的研究。选取大量中药进行筛选，研究其活性成分及抑菌机理是今后金黄色葡萄球菌生物膜中抑制剂的研究方向之一。
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（收稿日期：2016-03-16）
（修回日期：2016-04-18；编辑：向宇雁）