激光机器对光化学法模版的运用探索

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作者：卢宝全 尚小明 杨峰 韩德昌 李相春 洪军 单位：唐山工人医院神经内科 唐山工人医院心内科 河北联合大学附属医院神经外科 唐山工人医院核磁共振室

动物模型的制作将大鼠称重，按照0.3mL/100g剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，利用立体固定架前端的门齿环以及双侧的耳钉，对大鼠头部进行固定。之后沿头正中线切开皮肤，长度约1.5cm，分离暴露颅骨，以矢状缝左侧3mm，冠状缝后3mm为中心，磨钻打开直径约5mm的骨窗，保留硬脑膜。C组仅钻透颅骨的外板及板障，保留内板并打磨平整。除A组外，按照30mg/kg剂量于尾静脉注入3.3%的玫瑰红，持续时间约2～3min，随后用冷光源或手持激光器照射目标区域，照射距离为3mm，照射时间依分组而定。照射结束后局部用庆大霉素盐水冲洗，缝合头部伤口，待生命体征恢复平稳后放入笼中继续饲养。动物观测指标神经功能的行为学评分参考Bederson5级分级法［10］，于术后24h、48h对各组大鼠进行神经功能的行为学评分。头部核磁共振(MR)扫描检查于术后24h对大鼠头部进行MR扫描，检查前5min腹腔注射10%水合氯醛麻醉。单独或2～4只同时固定于自制的泡沫板上，使用关节线圈对大鼠头部进行扫描，扫描层面间距为2mm。脑梗死体积测定及病理学检查术后48h大鼠麻醉后迅速开胸，剪开右心耳，从左心室给予生理盐水100mL灌洗，断头取脑，－20℃冰箱冻保存20min。对于所取脑组织，用标尺在脑表面正中线以2mm等分，用病理切片机从视交叉前1mm左右冠状位切脑，其后间隔2mm连续做6个冠状切片。每组随即抽取2个标本用于HE染色，其余用于脑梗死体积测定。脑梗死体积测定将所需标本放入2%TTC液，37℃下孵育20min(10min后翻面)，正常脑组织染成红色，梗死灶染成白色。染色后置于4%多聚甲醛固定，24h后用Olympus数码相机摄相后输入电脑，应用Imagine-proplus6.0版测量各层面的梗死面积，将梗死灶面积乘以层厚2mm得出每个层面的梗死灶体积，相加各层面的梗死灶体积即得出整个脑组织的梗死灶体积。病理学检查将所需的脑组织切片置于4%多聚甲醛固定24h以上，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后将脑组织切片，厚度约4μm，37～38℃水浴展片，普通载物片捞片，置60℃烤箱中1h，苏木精－伊红染色，树胶封片。模型制作成功率模型制作成功的条件:①MR检查及TTC染色可见梗死灶形成，或得到光镜下病理观察验证;②模型制作后24h内出现过神经行学异常;③未出现血肿及其它严重并发症，48h内存活。同时满足以上条件者为模型制作成功，除以同组大鼠的数目即为模型制作成功率。统计学处理采用SPSS16.0forwindows统计软件进行统计学处理。采用Kruskal-Wallis非参数检验，当差异具有显著性时(P＜0.05)，采用Mann-Whitney非参数检验来分析组间的差异。正态分布数据用均数±标准差(x珋±s)表示，各组间的比较用单因素方差分析，两组间率的比较用χ2检验，必要时用Fisher确切概率法。P=0.05为显著性检验水准。

光照强度稳定性测定冷光源光照度为7.20±0.67×103勒克斯(Lux)，手持激光器的光照度为(1.29±0.11)×105Lux，后者是前者的18倍。光照度变异系数冷光源为9.3%，手持激光器为8.5%，并无显著性差异(P=0.53)。一般情况及神经行为学评分48h内36只大鼠无死亡出现。麻醉清醒后，大鼠精神萎靡，活动及摄氏减少，术后24h神经行为学评分多在2分以下，C组有两只大鼠评分达到3分，后证实为合并硬膜外血肿。术后24h神经行为学评分，各组间存在显著性差异(P=0.000)，进一步进行两两比较，显示A组与B组、A组与C组、D组与B组、D组与C组之间存在显著性差异(P＜0.05)。48h后神经行为缺损多有明显好转，各组间神经行为学评分无显著性差异(P=0.2)头部MR扫描情况术后24h头部MR扫描显示，A组未见脑梗死形成，B组、C组全部有脑梗死灶形成，D组仅部分大鼠形成梗死灶，但体积明显较B、C、小。另外C组有2例合并硬膜外血肿(图1)。TTC染色梗死体积测定TTC染色可见正常脑组织着深红色，梗死脑组织呈白色(彩插4图2)。A组未见梗死灶形成，B组、C组全部于左侧照射区形成部位恒定的梗死灶，局部脑组织苍白、肿胀明显，冠状面成“碗型”，尖端指向侧脑室，深达皮质全层，体积为B组16.7±3.23mm3，C组15.6±2.85mm3，二者间无显著性差异(P＞0.05)。D组仅部分形成梗死灶，且体积(5.2±1.96mm3)明显小于B组、C组(P＜0.01)。2.5脑组织病理学检查A组大鼠光镜下观察脑组织结构正常，细胞形态规整，细胞核完整。大脑皮质神经细胞层次清晰，神经元边界清，锥体细胞突起明显，胞核呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀、色淡，核仁清晰、染色较深，胞浆无水肿表现，内皮细胞及周围间隙形态结构正常。B组、C组大鼠脑标本镜下观察，HE染色可见病灶与周围组织分界清楚，梗死灶内脑组织软化，细胞碎裂，胞浆液化，核固缩或偏位，细胞溶解后形成的格子细胞等。神经元呈不同程度的缺血性改变，肿胀的神经元胞浆淡染，呈圆形或椭圆形，皱缩的神经元染色深，胞体小，呈三角形。许多神经元外形不易辨认，大部分细胞结构消失，胞浆空泡样变性。病灶中心微血管内血栓形成及淤血，坏死边缘区可见中性粒细胞浸润。D组的两只大鼠之中一只存在小的梗死灶，另一只未见异常。模型制作成功率比较B组、C组、D组模型制作成功率分别为100%、80%、50%，将B组、C组合并为手持激光器组，与冷光源组(D组)比较，经确切概率法验证，两种方法间有显著性差异(P=0.026)。

目前局灶性脑梗死模型制作时需要结扎动脉或机械性阻塞远端血流，创伤大，且技术操作具有一定难度，一些学者开始探索相对简单的局灶性脑缺血模型。方法之一是在颅内注射血管收缩物质如内皮素，以造成局部缺血［11］。这种方法已在大鼠得到重复验证，但在小鼠上制作时，则需结合其他药物注入或血管结扎才能形成梗死灶［12］。另外，此方法虽然简便，但形成的缺血灶部位不确切，而且死亡率并不低。光化学法制作脑梗死模型由Watson等［13］于1985年首次报道后，已得到广泛应用［14，15］。其原理是由注入动物体内特殊的光敏物质即光敏剂，在特定波长的光源照射下，诱发光化学反应，产生并释放活性氧自由基，导致血管内皮细胞损害，引发血小板聚集粘附，形成血管内血栓，闭塞血管，导致局部组织缺血缺氧，最终发生不可逆组织损伤。光化学法脑梗死动物模型的制作，光敏剂和照射光源是两个主要条件。玫瑰红B是迄今已知最强的光敏剂，其最大吸收波长为549nm。照射光源国内多应用冷光源，配合滤光片，光导纤维输出单色光，照射时间8～30min不等［9，16，17］。为提高照射效果，我们将冷光源照射时间设定为40min，模型制作成功率仍低于手持激光器组，且脑梗死体积多小于预期。其原因可能为玫瑰红B虽为强光敏剂，但所需光照强度大，自制的冷光源输出的光照度低，仅为手持激光器的1/18，虽增加时间仍难以满足需要。而手持激光器不仅光照度高，我们所进行的稳定性测定，也证明了短时间内稳定性强，不会很快出现光照强度衰减的现象，相信随着大容量充电电池的应用，其光照强度可以在较长时间内保持，更加适合于实验研究。另外，该研究中不注射光敏剂的A组，手持激光器照射5min并未引起局部组织肿胀、坏死，也说明了其安全性，但更长时间的照射是否安全需要进一步验证。在光化学法局灶性脑梗死模型制作过程中，一般需要开骨窗，即去掉颅骨，暴露硬脑膜。但有报道不破坏颅骨或者仅仅去掉颅骨的外板和板障，保留内板，适宜光源照射后同样可以制成局灶性脑梗死模型［18，19］，我们对此也进行了验证，发现确实可以在照射方向形成局灶性梗死灶，但少数大鼠合并出现硬膜外血肿，考虑其原因可能为:颅骨内板与硬脑膜之间存在大量的桥静脉，光化学反应后同样可以形成血栓，阻塞血流，淤血致一定程度引起静脉破裂出血，从而造成硬膜外血肿。因此建议模型制作时去掉颅骨为宜。由于该模型为皮层脑梗死，损害部位仅为皮质感觉运动区，皮质下纹状体、海马和丘脑未受损，加之大鼠强大的回复能力，大鼠神经行为学异常轻微，尤其48h后与无损伤组差异已不显著，提示在该模型中不宜将神经行为学评分作为干预因素效果的较长时间观测指标。即使在经典线栓法制备的局灶性脑梗死模型(大脑中动脉栓塞)中，王志强等［20］研究认为大鼠的肢体运动功能与脑梗死体积并无相关性，48h内肢体运动功能正常的大鼠并不一定不形成梗死灶，同时造模术后没有梗死灶的大鼠，也不一定完全没有神经功能缺损症状。因此，模型制作成功与否需结合术后大鼠的神经功能缺损评分、TTC染色后的脑梗死体积、脑组织病理切片的镜下观察等方面进行综合界定。为便于活体判断，我们又加入了MR扫描检查，但由于显示清晰度原因，未作定量分析(梗死面积或体积计算)，仅作为定性判断。相比较其它模型制作方法，光化学法具有梗死部位提前预知、梗死体积恒定、模型制作成功率高等优势，但目前局灶性脑梗死模型的制作仍以机械性阻断MCA血流为主，原因之一是照射光源不易获得，国外多应用氦氖激光，价格昂贵，国内多应用冷光源，虽价格相对低廉，一般实验室仍难以拥有。近几年，手持激光器已广泛普及，其成本更为低廉。经我们实验观察，在光化学法脑梗死模型制作时，完全能代替冷光源，且较冷光源更为方便、实用，适合我国开展相关实验研究。