大肠杆菌中人过氧化氢酶基因的克隆与表达
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇大肠杆菌中人过氧化氢酶基因的克隆与表达范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
（石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050035）
摘 要：在大肠杆菌中利用基因重组技术获得高效表达的人过氧化氢酶(catalase，CAT)，即利用pMAL-c2x构建了从人cDNA文库中获得的CAT编码基因融合表达载体，并进行了表达。使融合表达获得可溶性蛋白，为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。
关键词：大肠杆菌；人过氧化氢酶基因；融合表达；表达
中图分类号：R378.2+1文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）03-0005-02
1 过氧化氢酶的功能与来源
在生物体的新陈代谢中，细胞有氧呼吸所消耗的O2约10%被还原成H2O2，而其很容易被细胞中各种还原剂还原成OH-和极毒的自由基•OH，它能氧化与它接触的几乎所有细胞组分，引起衰老、癌变及其它病症。
但生物体有自己的保护机制，体内存在的过氧化氢酶(catalase，CAT)能有效地催化细胞中产生的高浓度H2O2(2H2O2O2+2H2O)，使H2O2不至于与细胞有氧代谢中产生的超氧阴离子自由基O-2•进一步生成羟自由基•OH，从而防止自由基对细胞的损伤[1]。
此外，CAT还具有一些其它的生理功能。它除了可调节体内H2O2水平外，还可充当Hb和其它含巯基蛋白质的保护剂。主要与细胞内线粒体及过氧体结合，同D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联，从而迅速分解细胞代谢中产生的毒性物H2O2，起到解毒与保护巯基酶、膜蛋白等作用[2]。
商品化的过氧化氢酶主要来源于牛肝、微球菌和黑曲霉[3]，多应用于工业生产[4]。而对医药和保健来说，人源的CAT应用价值更高。本研究利用基因重组技术将人CAT基因分别构建了融合和非融合表达载体，在大肠杆菌中实现了有生物活性的表达，为其开发利用奠定了基础。
2.1 材料
人cDNA文库（购自PROMEGA公司）；
菌种E.coli TB1、JM109，质粒pMAL-c2x、pBV221，抗MBP抗血清，Amylose Resin（购自NEB公司）；
TaqDNA聚合酶，限制性内切酶XbaⅠ、PstⅠ、NcoⅠ，DNA回收试剂盒，DL3000 DNA Marker，pMD19-T Vector（购自TaKaRa公司）；
Factor Ⅹa（购自BioLabs公司）；
二抗（羊抗兔），（购自北京百灵克生物公司）。
2.2 方法
2.2.1 CAT基因的获得
根据Genbank上登录的人CAT基因NM-001752，利用primer5软件在基因全长范围设计最佳引物对，正向为：5’-CGCACGCTATGGCTGACAG-3’，反向为：5’-TGATGAGCGGGTTACACGG-3’，以人cDNA文库为模板进行PCR。扩增后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，克隆至pMD19-T Vector，由北京华大基因研究中心测序。2.2.2 CAT表达载体的构建
根据阅读框架设计两对带酶切位点的引物，并以上述经测序验证的阳性质粒为模板进行PCR扩增。其中引物对1，正向为：5’-GCTCTAGAATGGCTGACAGCCG-3’，反向为：5’-AACTGCAGTCACAGATTTGCCTTC-3’，并分别带有XbaⅠ酶切位点、PstⅠ酶切位点。用限制性内切酶XbaⅠ、PstⅠ双切质粒pMAL-c2X及引物对1的PCR扩增产物，分别回收目的片段与线性化载体片段后，用T4DNA连接酶连接过夜，构建融合表达载体pMAL-c2x-CAT并转化至E.coli TB1。
2.2.3 CAT基因的诱导表达
将37℃振荡过夜的重组菌按1％量转接到含抗生素的LB液体培养基中，20℃培养6h，加入IPTG至终浓度1mmol/L诱导12h。超声破菌后，上清液用Amylose Resin进行亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blotting（一抗：抗MBP抗血清，二抗：羊抗兔）检测MBP-CAT表达情况。
3 结果
3.1 CAT基因的扩增
通过PCR扩增可以从人cDNA文库直接获得CAT基因，但由于CAT基因较长（约1.7kb），采用一般的PCR反应条件较难获得。本研究在没有改变普通Tag酶的情况下，适当延长了延伸时间，结果获得了较理想的结果。如图1A所示，当延伸时间为1min时，没有扩增产物，但延伸时间改为2min和3min后，扩增产物随延伸时间的增加而增加。将获得的扩增产物克隆到T载体后，测序结果经BLAST分析表明，获得的目的片段为人过氧化氢酶基因。以此测序重组子为模板进行的二次PCR反应，获得仅含编码序列的片段。由于此反应的模板单一，延伸1min与3min扩增效果相同(图1B)。
图1 嵌套式PCR扩增CAT基因的琼脂糖凝胶电泳
A.以人cDNA文库为模板，改变不同延伸时间获得的PCR扩增产物
1:延伸时间为1min;2:延伸时间为2min;3:延伸时间为3min;M:DL3000 DNA Marker。
B.以第一次扩增产物为模板， 改变不同延伸时间获得的PCR扩增产物。
M:DL3000 DNA Marker;1:延伸时间为1min;2:延伸时间为2min;3:延伸时间为3min。
3.2 CAT基因在大肠杆菌中的表达
将CAT编码基因片段克隆入pMAL-c2x载体，构成pMAL-c2x-CAT重组质粒。其中CAT基因的上游为MBP基因，它与CAT基因以融合形式表达。因MBP分子量为42kD，其与59kD的CAT融合，表达蛋白应为100kD左右。如图2所示，将pMAL-c2x-CAT重组质粒转化E.coli TB1，分别用37℃、28℃、20℃三种温度进行诱导，破菌处理后SDS-PAGE检测，显示表达区带出现在略高于97400的标准蛋白位置上，并且均为可溶性蛋白。相比之下以20℃诱导温度为获得最佳表达量。Western bloting检测(与抗MBP抗体反应)，结果显示该条区带确实是融合蛋白MBP-CAT（图3）。
图2 SDS-PAGE检测MBP-CAT在大肠杆菌中的表达
M:低分子量标准蛋白;1～4，5～8，9～12分别为37℃，28℃，20℃三个温度梯度下的未诱导样品、IPTG诱导样品、超声破菌后的上清、超声破菌后的沉淀。
图3 Western blotting检测MBP-CAT在大肠杆菌中的表达
M:低分子量标准蛋白; 1: pMAL-c2x- CAT重组子超声破菌的上清转膜后考马斯亮蓝染色;2:pMAL-c2x-CAT重组子超声破菌的上清与抗MBP抗血清反应;3:pMAL-c2x阴性对照菌的上清与抗MBP抗血清反应。
4 讨论
本研究利用嵌套引物和增加延伸时间，顺利获得目的基因。由于目的片段较长（1.7kb），当使用普通Taq酶时，仅采用一般的PCR反应条件不太容易直接获得目的片段，所以本实验适当延长嵌套式PCR第一次扩增反应的延伸时间，保证目的片段得到充分延伸。实验证明，在常规延伸时间（1min）条件下不能获得目的片段，但当将延伸时间加长（2min、3min）即可获得目的片段，而且随时间的延长获得的扩增产物更多。在进行嵌套式PCR反应的第2次扩增中，由于模板单一，所以常规延伸时间（1min）就能保证目的片段的充分延伸。
在表达过程中，本研究选择了融合表达（pMAL-c2x），分别选择37℃、28℃、20℃作为不同诱导温度对pMAL-c2x-CAT重组菌进行诱导表达。实验发现，尽管不同温度的表达产物都为可溶性蛋白，但随着温度的降低，目的蛋白的表达量逐步增加，说明低温诱导有利于蛋白的表达，但由于CAT片段较长，表达过程中会出现部分降解。
本研究分别构建了人CAT基因的融合表达载体，在大肠杆菌中实现了表达，为以后重组人过氧化氢酶的进一步开发利用奠定了基础。
参考文献：
［1］ 彭志英，蒋黎.紫外速率直接法测定过氧化氢酶活性［J］.华西医学，1995（10）：4-8.
［2］ 王坤.实用诊断酶学［M］.重庆：科学技术文献出版社重庆分社，1989：273.
［3］ 王凡强，王正祥，邵蔚蓝，等.重组大肠杆菌热稳定性过氧化氢酶的纯化及性质研究［J］.微生物学报，2002，42(3):348-353.
［4］ Dhaese，Patrick. Catalase，an enzyme with growing industrial potential［J］.Chim.Oggi，1996，14（1）;19-20.