Slit2和SrGAP2与难治性癫痫的相关研究
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摘要：Slits家族及Slit-Robo下游信号通路中RhoGAP分子SrGAPs家族在神经元轴突导向和突触生长中有着重要作用，且与难治性癫痫的发生密切相关。作为家族中的重要成员，slit2和srgap2在难治性癫痫中发挥重要的作用，对其研究也很广泛，本文就Slit2和SrGAP2与难治性癫痫的相关研究进行综述。
关键词：Slit2；SrGAP2；难治性癫痫；苔藓纤维出芽
癫痫（epilepsy）是由于大脑神经元反复发作的异常放电而引起的、以中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病，其中约70%～80%的患者经系统抗癫痫药治疗获得长期缓解，甚至治愈，但约20%～30%发作不能得到有效控制，称之难治性癫痫（refractory epilepsy，RE），现阶段，关于其发病机制的研究主要聚焦在神经元突触可塑性（synaptic plasticity）和苔藓纤维出芽（mossy fiber sprouting，MFS）两方面，它们均使神经网络发生了重组，是难治性癫痫的病理特征。Slit2和SrGAP2与MFS的发生紧密相关，本文就近几年的国内外相关研究展开综述。
1 Slit2概述
1.1 Slits家族及功能 Slit基因最早是Nüsslein-Volhard等1984年在筛选影响黑腹果蝇幼虫表皮型式发生的基因中发现的。在1988年由Tesser-Lavigne等在进行的体外培养试验时发现底板能产生一种有吸引作用的化学因子，这些因子促使连合神经元轴突向底板靶组织方向生长，而后又经Kidd、Brose等人的研究实验最终发现了Slits家族及其受体Roundabouts（Robos），它们同属于分泌型蛋白，相对分子质量约20万，包括N-端的短信号肽（ss）、富含亮氨酸的重复序列（leucine-rich repeat，LRR）、6-9个表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）样序列，一个ALPS （Agrin-Laminin-Perlecan-Slit）区域和C-端的富含半胱氨酸区域（cysteine knot），人鼠均有，同源性在60%以上。Slits家族有3种亚型：Slit1、Slit2和Slit3，这三种亚型在中枢、周围神经系统均有大量表达，此外，Slit3在一些发育的组织器官中也有表达[1]。
神经轴突导向因子Slits及Robos是一种进化上高度保守的分泌型糖蛋白，在神经轴突导向、神经细胞迁移、神经细胞形态分化等多种生命活动有重要的调节作用。Slits的功能主要通过LRR-2（leucine-rich repeat2）结构域与Robos结构域结合实现。
双侧对称的生物，中线是发育中神经系统的重要中介部位，是动物传递左右两侧信息以及协调运动和整合感觉输入的基础，大多数的轴突投射到对侧前要越过中线，然而这些轴突并不是毫无秩序、混乱或者反复穿越中线，中线穿越的过程离不开Slits的精细调控[2]。Slit基因敲除后，许多轴突连接不能离开中线，甚至有些轴突连接反复跨越中线[3]。在对小鼠视网膜轴突发育的研究实验、鸡和小鼠胚胎脑干纵向轴突发育实验以及人类胚胎干细胞多巴胺能神经轴突培养的体外实验均证实Slits对神经元轴突有排斥作用，Slits作为排斥性因子，保证了神经元轴突只跨越中线一次，准确无误到达既定位置，阻止轴突反复跨越中线形成异常的网格结构。
大量实验证实，哺乳动物的神经系统中，多数神经元需要经过迁移后到达发挥功能的部位发挥作用，迁移是神经系统发育的关键过程之一，若不能正常进行，则会导致多个疾病的发生，一部分癫痫的发生就是如此。在发育的神经系统中，早期神经嵴细胞的迁移，Slits家族是必须的神经导向因子，能够保证其正常分化及迁移，且进一步表明Slit因子是阻止神经细胞嵴迁移的起始，能够减弱其迁移速率[4]，在成熟大脑中，Slits参与损伤后的再生，Wang Y等人发现其调控神经胶质细胞和神经元轴突的延长和分支，介导其迁移[5]。
神经系统发育过程中，神经轴突和树突有的从一个共同神经突形成两个子分支，有的从一个主轴长出多数侧突，有的常在神经末梢存在成百上千个分支，众多的体外实验证实，Slit1促进小鼠皮层神经元轴突的延长和成年大鼠背根神经节神经元再生神经轴突的生长；异常的Slit2能够增加处于伸长期的鼠脑干中央三叉神经感觉神经元轴突的分支，以上说明：Slit能够促进神经树突的生长和分化。
除此之外，在调节肿瘤细胞转移、肿瘤血管生长、免疫细胞趋化、脉管系统生成、血管内皮细胞生长等方面的研究，Slit/Robo信号通路也是近年来的热点。
1.2 Slit2与难治性癫痫 正常人中，Slit2主要在神经元中表达，而在癫痫患者中，其在星形胶质细胞和神经元中均表达，并且比其在正常组织中明显高表达。Fang[3]等实验发现，在难治性癫痫动物模型中1d～2w，Slit2的表达持续减低，认为这不是癫痫发生的原因，而是对神经元痫性放电的一种适应性变化，也提示下调Slit2后可能会促进MFS，干扰神经的正常连接，在难治性癫痫的发病机制中有所参与。Fothergill[6]等证实Slit2可抑制轴突的形成。
上述表明，Slit2失调会抑制正常连接的形成且会促进异常连接，还可能参与星形胶质细胞增生及胶质疤痕的形成，胶质瘢痕正是药物难进入大脑除血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB）之外的又一屏障，Slit2的上调可能抑制MFS的形成以及减少胶质瘢痕的形成，这可能成为抗癫痫药物作用的一个新靶点。
2 SrGAP2概述
2.1 SrGAPs家族及功能 SrGAPs（Slit-Robo GTPase-activating proteins）是Wong等在2001年利用酵母双杂交系统实验时发现的一种Slit-Robo下游信号RhoGAP分子并命名为SrGAPs家族。SrGAPs家族包括SrGAP1、SrGAP2、SrGAP3和ARHGAP4，目前多研究与人类相关的前三个因子，它们在结构上具有很高的同源性。Aspenstrom P指出SrGAPs分子具有多个结构域，其一级结构具有较高一致性，包括1个F-BAR（FCH-Bin/Amphiphysin/Rvs）结构域，其由1个FCH（Fer/Fes CIP4 homology）结构域和相邻2个CC（Coiled-coil）结构域组成，1个RhoGAP（Rho GTPase-activating protein）结构域和1个SH3（Src homology 3）结构域。
SrGAPs家族不仅在结构上高同源，且在功能上也颇多相似，研究表明：F-BAR介导细胞膜形态的改变，RhoGAP特异性水解RhoGTPase，SH3介导蛋白与蛋白间相互作用，这三个结构域共同协调调控SrGAP分子的功能。SrGAP分子的功能主要依赖F-BAR所诱导丝状伪足（filopodia）的活性，三种F-BAR在功能上有区别的，例如，在COS7细胞中，三种F-BAR可以诱导丝状伪足的形成[7]，但是它们在皮层神经元中功能却不尽相同，SrGAP1可阻止丝状伪足的形成，在分子水平上，COS7细胞中三种分子可以形成异源二聚体协同诱导丝状伪足[8]。另外在细胞模上SrGAP2的F-BAR有很强的诱导丝状伪足能力。SrGAP1在线虫胚胎形成过程中通过F-BAR介导细胞间的粘附作用[9]；SrGAP2的F-BAR可以促进树突棘的成熟及影响棘密度[10]、能诱导神经元突起的生长和迁移；SrGAP3在促进树突棘发育的起始时需要依赖F-BAR。总之，SrGAPs家族在神经元轴突导向、神经元迁移、突起生长和树突形成起着重要作用。
2.2 SrGAP2与难治性癫痫 SrGAP2是Guerrier等学者在2009年实验中发现的，并提出其在神经元迁移、突触生长方面有重要作用，SrGAP2定位细胞外周的轴突，通过F-BAR能够显著诱导丝状伪足的形成，进一步影响到突起的分支及神经元迁移；还通过SH3参与到F-BAR介导的丝状伪足的形成过程；体外对SrGAP的探究显示倾向于通过RhoGAP水解Rac1抑制神经元突起的生长、影响细胞的迁移；体外培养SrGAP2过表达可以诱导与突触分支关系密切丝状伪足的形成；体外培养同时证实敲除SrGAP2后，轴突及树突的分支数明显下降。以上实验提示SrGAP2能够促进丝状伪足的生成，而伪足的形成与MFS类似。
通过对难治性癫痫患者和正常人颞叶脑组织的标本检测SrGAP2的表达情况，认为SrGAP2可能通过促进轴突生长和出芽参与MFS，进一步加重异常神经网络的建立，导致癫痫反复的自发性发作，最终形成难治性癫痫[11]。刘锦等人发现：SrGAP2在难治性癫痫动物组中的表达含量逐渐升高，且在2w左右达高峰并维持，到2个月左右降至接近对照组水平，提示其可能在难治性癫痫的发生发展中起重要作用。另一项临床研究中，一位患者染色体转位造成的SrGAP2基因断裂可能与早期婴儿型癫痫性脑病的发生及精神运动有关[12]，SrGAP2基因敲除的小鼠也表现出了癫痫病症状[10]，但是造成这些症状的具体机制尚待更进一步的研究。
上述同样表明，SrGAP2在难治性癫痫发生中有所参与，调节SrGAP2的表达可能在治疗疾病中有所帮助。
3 小结
癫痫的脑组织神经元由于长期反复的痫性放电发生神经胶质细胞增生、神经元丧失及凋亡、突触功能增强、MFS等病理改变，其中，MFS、Slit2和SrGAP2在此发挥了重要的作用，但对它们在人体中的实验仍需进一步研究，干预MFS可使难治性癫痫的治疗更加容易。在以后的研究中，Slit2和SrGAP2将成为新的治疗靶点，也将为癫痫的研究及防治提供新方向。
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