氨酚曲马多分散片微生物限度检查方法学验证
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摘 要：本文按着《中国药典》2010年版的检测方法，对我公司生产的氨酚曲马多分散片进行微生物方法学验证，以确定检测方法是否可行。
《中国药典））2010版二部[1]规定，当建立产品的微生物限度检朔ㄊ保应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。依据《中国药典》2010年版二部附录XIJ“微生物限度检查法”，对氨酚曲马多分散片的微生物限度检查法进行了方法学验证，验证结果如下：
1 试验材料
1.1 仪器：二级生物安全柜、压力蒸汽灭菌器、电热鼓风干燥箱、生化培养箱等。
1.2 供试样品：氨酚曲马多分散片，本公司生产，规格：盐酸曲马多37.5mg，对乙酰氨基酚325mg，批号：20140106。
1.3 标准菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003；大肠埃希菌CMCC（B）44102；枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501；白色念珠菌CMCC（F）98001；黑曲霉菌CMCC（F）98003。
1.4 试验用培养基：营养琼脂对照培养基，批号：135003-201103；玫瑰红钠琼脂对照培养基，批号：135005-201103；胆盐乳糖对照培养基，批号：135006-201104；营养肉汤对照培养基，批号：135004-201103；改良马丁对照培养基，批号：135002-201002；曙红亚甲蓝琼脂培养基，批号：051020；以上培养基均从中检院购进。
1.5 菌液制备
取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种于营养肉汤培养基中，30-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜斜面培养物至改良马丁培养基中，于23-28℃培养24小时，分别取上述培养液用0.9%的无菌氯化钠溶液稀释至10-6、10-7、10-5，10-5备用。取黑曲霉菌的新鲜斜面培养物，加5ml0.9%无菌氯化钠水溶液，将孢子洗下，吸取菌液1ml至无菌比色管中，加适量0.9%的氯化钠溶液，与标准比浊管比浊，取比浊后的菌悬液用0.9%的氯化钠溶液稀释至10-4，备用。
1.6 供试液制备
称取本品10g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，分散混匀使溶解，制成1：10供试液。
2 方法学验证试验[2]
2.1 细菌计数方法验证
2.1.1 试验组：取1：10供试液10ml，置无菌条件下离心（500转/分）5分钟，取上清液置无菌试管中，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补足10ml，再从中取1ml加适量稀释剂，依《中国药典》2010年版二部附录XIJ“微生物限度检查法”中薄膜过滤法过滤，冲洗量300ml并在最后一次冲洗液中加入1ml相应的阳性试验菌，取出滤膜，膜面朝上，贴于营养琼脂平板上，按规定培养，测定氨酚曲马多分散片的细菌数。
2.1.2 菌液组：取稀释好的各菌液1ml，加9ml稀释剂，低速离心――薄膜过滤（方法同试验组）测定所加的试验菌数。
2.1.3 供试品对照组：按试验组方法，测定供试品本底细菌数。
2.1.4 稀释剂对照组：取稀释剂替代供试液，按试验组的方法测定其菌数。
2.2 霉菌及酵母菌计数方法验证
2.2.1 试验组：取1：10供试液1ml加入阳性试验菌1ml，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置规定条件培养，每种试验菌平行制备二个平皿，测定其霉菌及酵母菌数。
2.2.2 菌液组：取稀释好的各菌液1ml，方法同试验组，分别加入平皿中，加入玫瑰红钠琼脂培养基，置规定条件培养，测定所加的试验菌数。
2.2.3 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数法测定供试品本底菌数。
2.2.4 稀释剂对照组：取稀释剂替代供试液，方法同试验组。
试验组菌回收率（%）= ■×100%
稀释剂对照组菌回收率（%）=■×100%
试验结果见表1。
2.3 控制菌检查方法的验证：常规法。
2.3.1 菌种
2.3.1.1 阳性菌：大肠埃希菌（44102）
2.3.1.2 阴性菌：金黄色葡萄球菌（26003）
2.3.2 试验方法
2.3.2.1 试验组：取1：10供试液10ml，加入100ml胆盐乳糖增菌液中，再加1ml阳性菌（即大肠埃希菌浓度同细菌数验证），摇匀，置35-37℃培养18-48小时依《中国药典》2010年版二部附录XIJ“微生物限度检查法”中控制菌检查法，检查其控制菌，即大肠埃希菌。
2.3.2.2 阴性对照组：方法同试验组，加入1ml阴性菌（即金黄色葡萄球菌浓度同细菌数验证）。
试验结果见表2。
3 结果判断
3.1 计数法验证
在三次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率均大于70%，试验组的菌回收率均大于70%，故可照该供试液制备方法和计数法测定氨酚曲马多分散片的细菌、霉菌及酵母菌数。
3.2 控制菌检查法验证
阴性对照组未检出阴性对照菌，试验组检出阳性试验菌，故可以照此供试液制备法和控制菌检查法进行氨酚曲马多分散片的控制菌检查。
4 检验结果
表1 细菌、霉菌及酵母菌数验证试验（20140106）
表2 控制菌验证试验结果（20140106）
5 结论
经以上微生物方法学验证，确定《中国药典》2010版二部的方法适合于氨酚曲马多分散片的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典二部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录107-116.
[2]中国药品生物制品检定所.中国药品中国药品检验标准操作规范
[M].北京：中国医药科技出版社，2010：351-369.
作者简介：孙巍（1981，11-），女，汉族，齐齐哈尔医学院，制药工程专业工程师，多多药业有限公司从事药品质量管控工作。