马齿苋总黄酮抗小鼠缺氧作用及其机制研究
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作者：董立巍，王万银，岳义田，李敏 【关键词】 ,马齿苋
［摘要］ 目的：筛选马齿苋抗缺氧作用有效成分，并对筛选出的有效成分进行作用机制的研究。方法：马齿苋抗缺氧作用有效成分筛选：将70只小鼠随机分为总黄酮组、总生物碱组、多糖组、酸性成分组、碱性成分组、人参总皂苷组（阳性对照）和生理盐水组（阴性对照），每组10只。各组小鼠予以相应药物灌胃1周后，进行常压缺氧暴露生存时间实验，筛选出马齿苋抗缺氧作用的有效成分。马齿苋总黄酮抗缺氧机制研究：将90只小鼠随机分为总黄酮组、人参总皂苷组和生理盐水组，各组再分成3个亚组，即缺氧暴露12、24和36 h组，每组10只。将小鼠置于氮氧混合气（10% O2＋90% N2）舱内分别缺氧暴露12、24和36h后，测定血红细胞计数、血红蛋白含量、血细胞压积、血浆红细胞生成素（erythropoietin, EPO）以及肾脏与大脑皮质EPOmRNA的表达水平。结果：与生理盐水组比较，马齿苋总黄酮组小鼠缺氧暴露生存时间明显延长；马齿苋总黄酮组小鼠不同缺氧时段肾脏和大脑皮质EPO mRNA的表达水平明显增加，血浆EPO、红细胞计数和血红蛋白含量亦明显升高。结论：总黄酮是马齿苋抗缺氧作用的有效成分，其延长小鼠缺氧生存时间的机制可能是促进EPO的表达以及红细胞和血红蛋白的生成。
［关键词］ 马齿苋; 黄酮; 缺氧; 血红蛋白类; 红细胞生成素
Effects of flavones extracted from Portulaca oleracea on ability of hypoxia tolerance in mice and its mechanism
ABSTRACT Objective: To identify antihypoxia ingredients extracted from Portulaca oleracea and to find out the possible mechanism of its antihypoxia actions. Methods: Seventy mice were randomly divided into seven groups which were untreated (normal saline), ginsenosidestreated, polysaccharidetreated, acidic componentstreated, basic componentstreated, alkaloidstreated and flavonestreated groups, and the ingredients of polysaccharide, acidic components, basic components, alkaloids and flavones were extracted from Portulaca olerace. The mice in each group were fed with corresponding ingredients for one week respectively. Then the survival time of mice in hypoxic conditions was observed. Another 90 mice were divided into 3 groups: untreated (normal saline), ginsenosidestreated and flavonestreated groups. The mice in each of these 3 groups were divided into 3 subgroups according to 12, 24 and 36hour exposure to hypoxia (10% oxygen and 90% nitrogen), respectively. After exposure to hypoxia, the red blood cell count (RBC), hemoglobin (Hb) concentration and hematocrit (HCT) in mice were determined. The plasma erythropoietin (EPO) levels of mice were detected by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) and the relative values of EPO mRNA in renal tissue and pallium of mice were determined by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR). Results: The survival time of mice in hypoxic conditions in flavonestreated group was significantly longer than that in the untreated group. The RBC, Hb concentration, HCT, plasma EPO level and the relative values of EPO mRNA in renal tissue and pallium of mice were significantly higher in the flavonestreated group than those in the untreated group. Conclusion: The antihypoxia ingredients extracted from Portulaca oleracea are flavones and the antihypoxia effects may be obtained by improving the expression level of EPO and accelerating the generations of erythrocyte and Hb.
KEY WORDS Portulaca oleracea; flavone; anoxia; hemoglobins; erythropoietin
马齿苋（Portulaca oleracea）属一年生肉质草本植物，全草含甲基肾上腺素、香豆精、黄酮、强心苷等多种生物活性物质，是一种药食同源的野生植物［1］。在发现马齿苋可显著延长老年小鼠低氧存活时间的基础上［2］，我们对马齿苋总黄酮、生物碱及多糖等粗提成分进行了抗缺氧作用观察，对筛选出的抗缺氧作用有效成分总黄酮的抗缺氧机制进行了初步研究，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 马齿苋抗缺氧作用有效成分筛选
1.1.1 实验动物 雄性ICR小鼠70只，体质量20～24 g，购自中英合资上海西普尔必凯实验动物有限公司，按体质量随机分为马齿苋总黄酮组、总生物碱组、多糖组、酸性成分组、碱性成分组、人参总皂苷组（阳性对照）和生理盐水组（阴性对照），每组10只。
1.1.2 实验药物 马齿苋（干）购自上海雷允上中药店，经本校药学院生药学教研室鉴定为马齿苋科马齿苋属植物马齿苋，参照文献方法［3～5］提取总黄酮、总生物碱、多糖、酸性成分和碱性成分。各提取物成分以适量乙醇溶解后，加水加热使乙醇挥发，最后以水定容，配制成生药浓度均为1 g/ml的水溶液备用。人参总皂苷由黑龙江省东宁制药厂提供，药品纯度91.67%，配制成药物浓度为10 mg/ml的水溶液备用［6］。
1.1.3 实验方法 马齿苋各成分组均用配制好的相应药物水溶液，按40 g/kg的剂量予以灌胃；人参总皂苷组用配制好的人参总皂苷水溶液，按0.4 g/kg的剂量予以灌胃；生理盐水组给予等量生理盐水灌胃。1次/d，连续7 d。小鼠于末次灌胃1 h后，放入置有10 g碱石灰的200 ml广口瓶内，1只/瓶，用凡士林封口，自瓶盖封严即刻开始计时，直至呼吸停止，记录小鼠的生存时间［7］。
1.2 马齿苋总黄酮抗缺氧机制研究
1.2.1 实验动物 雄性ICR小鼠90只，体质量20～24 g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，按体质量随机分为马齿苋总黄酮组、人参总皂苷组和生理盐水组，各组再分成3个亚组，即缺氧暴露12、24、36 h组，每组10只。
1.2.2 实验药物 马齿苋总黄酮组、人参总皂苷组和生理盐水组各组用药同马齿苋抗缺氧作用有效成分筛选实验。
1.2.3 实验方法
1.2.3.1 给药方法 同马齿苋抗缺氧作用有效成分筛选实验。小鼠于末次灌胃1 h后分别予以缺氧暴露（直径120 cm×45 cm的医用氧舱内充以含10% O2和90% N2的混合气体，流量为3～5 L/min）12、24、36 h。待小鼠出舱后立即断头处死，取血、脑及肾脏等组织，置于－80℃冰箱内备用。
1.2.3.2 检测指标 用F800Toa全自动血细胞分类计数仪测定红细胞计数（red blood cell count, RBC）、血红蛋白（hemoglobin, Hb）含量和血细胞比容（hematocrit, HCT）。参照Priyadarshi等［8］方法，用普通酶联免疫吸附试验检测小鼠血浆红细胞生成素（erythropoietin, EPO）的含量，采用羊抗小鼠抗体（R&D Systems, Inc. AF 959）检测EPO，以吸光度值表示EPO的相对含量。用TRIzol Reagent分别抽提脑、肾脏的总RNA。聚合酶链反应试剂盒为TaKaRa生物工程公司生产的RNA PCR Kit Ver. 3.0，聚合酶链反应体系为50 μl，以逆转录反应产物为模板，分别加入上、下游引物，聚合酶链反应缓冲液10 μl，Ex Taq 酶0.25 μl，蒸馏水补足反应体积。95 ℃×5 min灭活逆转录酶后，94 ℃×30 s，退火温度βactin 55 ℃、EPO 60 ℃，30 s，共30个循环。用2%琼脂糖凝胶电泳检测聚合酶链反应产物并进行密度扫描，采用SmartView 2001生物电泳图像分析软件进行灰度扫描分析，目的基因mRNA表达水平经βactin校正。EPO及βactin cDNA引物根据文献进行设计［9,10］，由上海生工生物技术工程有限公司合成。引物序列：（1）EPO上游引物：5’ TCCTTGCTACTGATTCCTCTGGG 3’；下游引物：5’ GTATCCACTGTGAGTGTTCG 3’。（2）βactin上游引物：5’ CTAGGCACCAAGGTGGTAT 3’；下游引物：5’ CAAACATGATCTGGGTCATC 3’。目的基因产物长度：EPO为449 bp；βactin为261 bp。
1.3 统计学方法 所有实验数据均采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，计量资料均数用x±s表示，进行单样本的方差分析。
2 结果
2.1 各组小鼠生长及缺氧暴露前体质量的比较 各组小鼠饲养期间健康情况良好，未发生死亡及其他异常体征。各组小鼠缺氧暴露前体质量比较无统计学差异。见表1。
2.2 各组小鼠常压密闭缺氧暴露生存时间的比较 与生理盐水组比较，总黄酮组与人参总皂苷组小鼠缺氧暴露生存时间明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01)；酸性成分组、碱性成分组、生物碱组和多糖组小鼠缺氧暴露生存时间与生理盐水组比较无统计学差异。总黄酮组小鼠缺氧暴露生存时间较酸性成分组和碱性成分组比较，均有明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05)。总黄酮组小鼠缺氧暴露生存时间较人参总皂苷组有一定的延长，但两者比较无统计学意义。见表1。
2.3 马齿苋总黄酮对不同缺氧时段小鼠血RBC、Hb及HCT的影响 小鼠分别缺氧暴露12、24、36 h后，马齿苋总黄酮组与生理盐水组比较，血红细胞数、血红蛋白含量及红细胞比容均有明显增高，其中以缺氧暴露24 h组的增高幅度最为明显（P＜0.01）。马齿苋总黄酮组与人参总皂苷组比较，则差异无统计学意义。见表2。
2.4 马齿苋总黄酮对不同缺氧时段小鼠血浆EPO含量的影响 小鼠分别缺氧暴露12、24、36 h后，马齿苋总黄酮组与生理盐水组比较，血浆EPO含量明显提高，其中尤以缺氧暴露36 h组的增高幅度最为明显（P＜0.01）。人参总皂苷组小鼠血浆EPO含量较生理盐水组，虽也有一定程度的升高，但升高幅度不如马齿苋总黄酮组。见表2。
表1 各组小鼠缺氧暴露前体质量及缺氧暴露生存时间的比较（略）
Tab 1 Comparisons of body weights of mice before exposure to hypoxia and survival time in hypoxic condition in different groups
*P<0.05, **P<0.01, vs untreated group; P<0.05 vs acidic componentstreated group; P<0.05 vs basic componentstreated group
表2 马齿苋总黄酮对不同缺氧时段小鼠血RBC、Hb、HCT及血浆EPO含量的影响（略）
Tab 2 Effects of flavones extracted from Portulaca oleracea on RBC, Hb concentration, HCT and plasma EPO level in mice exposed to hypoxia for different hours
*P<0.05, **P<0.01, vs untreated group exposed to hypoxia for the same hours
2.5 马齿苋总黄酮对缺氧小鼠肾脏及大脑皮层EPO mRNA表达的影响
2.5.1 马齿苋总黄酮对缺氧小鼠肾脏EPO mRNA表达的影响 缺氧暴露12、24、36 h后，马齿苋总黄酮组小鼠肾脏EPO mRNA的表达水平与生理盐水组比较，均有明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而马齿苋总黄酮组和人参总皂苷组比较，差异无统计学意义。见图1、表3。
2.5.2 马齿苋总黄酮对缺氧小鼠大脑皮层EPO mRNA表达的影响 缺氧暴露12、24、36 h后，马齿苋总黄酮组小鼠大脑皮层EPO mRNA的表达水平与生理盐水组比较，均有明显升高，其中尤以缺氧暴露36 h组大脑皮层EPO mRNA的表达水平增高最为明显，差异有统计学意义（P＜0.01）；马齿苋总黄酮组和人参总皂苷组比较，差异无统计学意义。见图2、表3。
图1 马齿苋总黄酮对小鼠肾脏EPO mRNA表达的影响（略）
Fig 1 Effects of flavones extracted from Portulaca oleracea on expression level of EPO mRNA in renal tissues of mice exposed to hypoxia for different hours
1: Flavonestreated group; 2: Ginsenosidestreated group; 3: Untreated group
图2 马齿苋总黄酮对小鼠大脑皮层EPO mRNA表达的影响（略）
Fig 2 Effects of flavones extracted from Portulaca oleracea on expression level of EPO mRNA in pallium of mice exposed to hypoxia for different hours
1: Flavonestreated group; 2: Ginsenosidestreated group; 3: Untreated group
表3 马齿苋总黄酮对不同缺氧时段小鼠肾脏及大脑皮层EPO mRNA表达水平的影响（略）
Tab 3 Effects of flavones extracted from Portulaca oleracea on relative values of EPO mRNA in renal tissues and pallium of mice exposed to hypoxia for different hours
*P<0.05, **P<0.01, vs untreated group exposed to hypoxia for the same hours
3 讨论
本实验结果表明，马齿苋多种粗提成分中只有马齿苋总黄酮可明显延长小鼠在密闭缺氧环境中的生存时间，说明总黄酮可能是马齿苋发挥抗缺氧作用的有效成分；马齿苋总黄酮组小鼠在密闭缺氧环境中的生存时间较人参总皂苷组更长。人参总皂苷的抗缺氧作用已得到许多实验的证实［11］。人参皂苷是贵重中药人参的提取物，而马齿苋是药食两用植物，地理分布广泛，来源极其丰富。若能进一步阐明马齿苋总黄酮提高机体缺氧耐受能力的作用机制，将有助于抗缺氧新药的开发。
EPO增多导致红细胞生成及血红蛋白含量增多，是缺氧所引起的血液系统代偿反应之一。以往研究认为，EPO是一种血细胞因子，其主要作用是促进造血祖细胞的增殖与分化［12］。近年来的研究表明，EPO具有神经营养活性，对缺血缺氧机体的中枢神经系统有保护作用。星形胶质细胞是脑部生成EPO的主要细胞。最近的研究发现：大脑皮层神经元也有EPO的表达［13］。本实验发现，马齿苋总黄酮能明显促进缺氧小鼠肾脏EPO mRNA的表达，进而提高缺氧小鼠血浆EPO的含量、红细胞计数及血红蛋白量。马齿苋总黄酮可上调EPO mRNA的表达，进一步促进缺氧机体红细胞和血红蛋白的生成，这可能是马齿苋总黄酮能明显延长小鼠在密闭缺氧环境中生存时间的机制之一。本实验还发现马齿苋总黄酮可促进缺氧小鼠大脑皮层EPO mRNA的表达，是否马齿苋总黄酮对缺氧机体大脑神经元亦有保护作用，值得进一步研究。
［参考文献］
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