谷胱甘肽对氯化汞致果蝇肠损伤的影响

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摘要：以模式生物果蝇为模型，研究了谷胱甘肽（1 mmol/L）对氯化汞（400 μmol/L）致果蝇肠损伤的影响。结果表明，谷胱甘肽对氯化汞所致果蝇肠道损伤有一定的保护作用。1 mmol/L 谷胱甘肽显著抑制 400 μmol/L氯化汞所致果蝇肠道上皮活性氧的产生、细胞凋亡以及肠道干细胞的分裂。

关键词：氯化汞；果蝇；谷胱甘肽

中图分类号：Q969.44 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2849-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.034

氯化汞（HgCl2）是一种常见的重金属污染物。HgCl2可致包括神经系统、肾脏、肠道在内的多种组织和器官损伤。目前研究认为活性氧（ROS）的产生以及氧化损伤是汞中毒造成组织损伤的主要机制之一[1]。谷胱甘肽（GSH）是生物体内存在的一种含有巯基的化合物，具有抗氧化、清除自由基、解毒等功能。

相比于其他的模式生物而言，果蝇具有繁育周期短、易于饲养、遗传手段丰富等众多优势。这些优点使得果蝇成为研究遗传学和发育生物学最为理想的模型[2]。序列分析显示果蝇是与人类关系最为密切的无脊椎模式生物[3，4]。超过70%的人类基因在果蝇上都可以找到其同源物[5]。因此，近年来果蝇成为研究毒理学的优秀模型[6]。Chen等[7]研究证实模式生物果蝇以其独特的生物学优势可以用于汞中毒的机制研究。研究表明，氯化汞（HgCl2）可致果蝇肠道上皮ROS产生异常并造成肠上皮氧化损伤[7]。本研究以模式生物果蝇为模型探讨外源性抗氧化剂GSH对HgCl2所致果蝇肠道损伤中的影响，以期为研究HgCl2中毒的作用机制和防治措施提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

试验用果蝇品系为w1118。将上述果蝇品系用标准玉米培养基饲养，在25 ℃、相对湿度60%的恒温培养箱中培养。

试验用一抗为Rabbit anti phospho histone H3（PH3）（Millipore），二抗为Goat anti rabbit IgG-Alexa Fluor 488（Invitrogen）。果蝇肠道上皮细胞内活性氧检测采用2，7二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCF-DA）活性氧检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），细胞凋亡检测采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Millipore）。利用Nikon A1R-si激光共聚焦显微镜进行图像采集。

1.2 方法

1.2.1 饲养试验 收集150只3日龄成年果蝇，在空的培养管中饥饿2 h，然后随机分为对照组，HgCl2处理组，GSH和HgCl2共处理组，每组50只果蝇，雌雄各半。将上述各组果蝇分别转移到铺有3 cm× 2 cm滤纸的培养管中。对应上述各组滤纸分别添加50 μL的5%蔗糖水、400 μmol/L HgCl2、1 mmol/L GSH和400 μmol/L HgCl2混合液。HgCl2和GSH用5%的蔗糖溶解。滤纸每天更换2次，饲喂3 d后解剖果蝇肠道用于后续试验。

1.2.2 免疫荧光染色 解剖肠道，用4%甲醛溶液固定30 min，吸弃甲醛，用PBS洗涤2次，然后加入500 μL 0.1% PBST溶液，通透10 min，PBS洗涤3次。一抗孵育4 ℃过夜，PBS洗涤3次，每次10 min。添加荧光二抗，室温避光2 h。吸弃二抗，PBS洗涤3次。DAPI孵育10 min。吸弃DAPI，PBS洗涤3次，每次10 min。

1.2.3 活性氧和细胞凋亡检测 解剖果蝇肠道，然后按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Millipore）说明书进行细胞凋亡检测；按照DCF-DA活性氧检测试剂盒说明书进行细胞活性氧检测。

1.2.4 统计分析 统计每只果蝇中肠平均PH3阳性细胞数以及每条中肠的同一指定区域内（100 μm×100 μm）TUNEL阳性的细胞数目。使用Image J软件计算果蝇平均每条中肠的同一指定区域内（150 cm×150 cm）DCF-DA荧光信号强度。用SPSS 20.0软件进行数据处理，采用单因素方差分析（ANOVA）进行组间差异的显著性检验。检验水准α=0.05。

2 结果与分析

2.1 GSH对果蝇肠道细胞凋亡的影响

由图1可知，HgCl2饲喂3 d后凋亡的果蝇肠道上皮细胞数量显著高于蔗糖处理组，而饲喂HgCl2和GSH共处理组的果蝇肠道上皮细胞凋亡数显著低于HgCl2处理组（P

2.2 GSH对果蝇肠道活性氧产生的影响

ROS的产生是生物应对各种刺激的一种重要保护机制。果蝇肠道内ROS的产生可以抵抗病原菌的侵袭。但是肠道内ROS过度产生会造成肠道组织损伤甚至引起果蝇死亡[8]。由图2可知，HgCl2处理可显著提高果蝇肠道上皮细胞内ROS的产生。HgCl2和GSH共处理组的果蝇肠道上皮细胞ROS产生显著低于HgCl2处理组（P

2.3 GSH对果蝇肠道干细胞细胞分裂的影响

果蝇肠道干细胞是存在于肠内的一类能够分裂和分化的细胞。肠道干细胞的分裂对于维持果蝇肠道正常的形态以及功能至关重要。磷酸化组蛋白H3（PH3）是用于鉴定处于分裂期细胞的特异性标记物。由图3可知，HgCl2处理组果蝇肠道细胞分裂显著快于对照组。HgCl2和GSH共处理组的果蝇肠道上皮细胞分裂显著低于HgCl2处理组（P

3 讨论

汞是毒性很强的重金属，它在机体内不仅能与GSH等抗氧化物结合，降低体内消除消除自由基的能力，而且会造成机体内自由基异常产生并引起组织器官的氧化损伤[9]。本研究以果蝇肠道为模型研究外源性GSH对HgCl2所致的果蝇肠道氧化损伤中的作用，发现GSH可以显著抑制HgCl2所致的肠道上皮细胞的凋亡以及ROS的产生，这些结果表明外源性GSH对HgCl2所致的果蝇肠道氧化损伤具有一定程度的保护作用。

同哺乳动物一样，果蝇肠道在应对体内外各种生物、物理、化学刺激时会加快干细胞分裂以应对组织损伤[10，11]。因此，在一定程度上肠道干细胞分裂状况可以作为肠道损伤的重要参考指标[7]。本试验结果显示，HgCl2和GSH共处理的果蝇肠道细胞分裂情况显著低于HgCl2处理组，该结果进一步表明还原型GSH显著降低了HgCl2所致的肠道损伤。

目前，汞中毒的作用机制尚不清楚，但已有研究表明，ROS的产生是汞中毒的重要机制之一。汞可以造成细胞内ROS异常生成同时抑制机体的抗氧化系统并最终造成组织器官的氧化损伤[12]。GSH是机体内存在的一种重要的水溶性抗氧化物质，是机体抗氧化系统的重要组成部分。本试验中外源性GSH在HgCl2所致的果蝇肠道氧化损伤中显示的保护作用很可能是因为外源性GSH与汞直接结合形成稳定的复合物，从而抑制了汞的毒性并对GSH代谢酶的活性起到了保护作用。

参考文献：

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