亚硝基谷胱甘肽对鸡球虫脱囊的影响

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摘要：为了解胆酸盐浓度、作用时间两种因素对亚硝基谷胱甘肽――GSNO处理鸡柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）孢子化卵囊脱囊的影响，试验采用L9（34）正交试验方法，通过镜检子孢子脱囊率来确定鸡球虫卵囊经GSNO处理后体外脱囊的最佳条件。结果表明，在胆酸盐浓度为0.75%，作用时间为2 h时，GSNO处理孢子化卵囊的脱囊率最高。

关键词：亚硝基谷胱甘肽；柔嫩艾美耳球虫；脱囊

中图分类号：S831；S852.72+3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）09-2173-03

鸡球虫病是现代规模养禽业中最常见、最难净化且危害严重的寄生虫病之一，由于球虫病在鸡各个生长阶段的发病率和致死率都比较高，因而给养鸡业带来了很大的冲击，全球每年因球虫病造成的经济损失高达数10亿美元[1]，同时，抗球虫药的广泛使用所引起的药物残留已成为影响人类健康的巨大隐患，因此能否有效控制鸡球虫病显得意义重大。

Allen于1998年首次发现感染E.tenella的雏鸡体内NO水平明显高于未感染的对照组[2]，傅小平等[3]研究也得出相同结论，这提示NO可能参与了球虫感染的过程，并在抗球虫感染中发挥着重要作用。由于NO的理化性质极不稳定，很难直接利用NO或NO的溶液对其特性进行研究，而利用NO供体来模拟NO活性是研究NO的一种重要手段[4]。有研究表明[5]，S-亚硝基硫醇类NO供体（GSNO）可以不可逆地抑制柔嫩艾美耳球虫未成熟卵囊的孢子生殖，其抑制率高达100%。动物试验也表明，GSNO处理可以明显降低孢子化E.tenella卵囊对雏鸡的致病力[6]。本研究采用体外脱囊正交试验方法，通过镜检子孢子脱囊率来评价GSNO处理孢子化卵囊体外脱囊的最佳条件，从而进一步探讨GSNO对鸡球虫卵囊的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 试验虫株

柔嫩艾美耳球虫卵囊，扬州大学兽医学院寄生虫学实验室保存株，经雏鸡传代获取新鲜的未孢子化卵囊，4 ℃冰箱保存备用[8]。

1.2 主要试剂

还原型谷胱甘肽、胰酶（上海金穗生物科技有限公司），亚硝酸钠（无锡市晶科化工有限公司），牛胆酸盐（Ward blenkinsop Co LTD）。

GSNO：亚硝基硫醇类（RSNO）NO供体，依照Stefan F[7]介绍的方法制备。

1.3 方法

1.3.1 孢子化卵囊的准备 将分离的未孢子化卵囊加入2.5%重铬酸钾溶液于28 ℃恒温培养箱进行孢子生殖，待95%左右的卵囊出现斯氏体[9]后，收集孢子化卵囊，用灭菌水洗涤并离心[10]，重复3次以除去重铬酸钾溶液。

1.3.2 卵囊的前处理 取新鲜的孢子化卵囊，将其分成3组，用0、8、16 mmol/L的GSNO在4 ℃冰箱处理8 h，离心3次弃去GSNO，不同GSNO处理再分成3组，用研磨器研磨上述9组不同处理的卵囊，直至90%左右的孢子囊从卵囊壁游离出来，离心3次调整各组孢子囊浓度为60×105个/mL。

1.3.3 体外脱囊试验 为确定胆酸盐浓度和消化液作用时间对GSNO处理孢子化卵囊脱囊试验的影响，采用L9（34）正交试验设计方案，各因素每个水平设置6个重复，以计算的子孢子脱囊率为指标来考察子孢子脱囊的最佳条件，因素与水平见表1。在上述9组孢子囊中分别加入不同处理的消化液，按下表内容进行操作，40 ℃消化不同时间后在显微镜下记录子孢子数，计算子孢子脱囊率。子孢子脱囊率的公式为：子孢子脱囊率=子孢子数/（子孢子数+孢子囊数×2）×100%[11]。

1.4 统计学处理

试验结果均采用SPSS软件进行方差分析，比较各处理间的差异显著性。

2 结果与分析

从表2可知，各因素水平的优劣顺序是：B1>B3>B2，C3>C2>C1。0.75%的胆酸盐浓度使球虫子孢子更易从孢子囊中脱出，消化液与孢子化卵囊作用时间越长，子孢子脱囊越完全。

由表3结合F值表可知，F0.05（2，42）=3.22，F0.01（2，42）=5.15。FB（3.431）>F0.05，表明B因素的各水平差异显著（PF0.05，表明C因素的各水平差异显著（P

方差分析表明，胆酸盐浓度（B）、作用时间（C）对GSNO处理孢子化卵囊的主次顺序为：C>B，即：消化液处理卵囊时间越长，子孢子脱囊率越高。由于各因素间没有交互作用，各因素效应可相加，故B与C最佳水平的组合也是最佳的，对于GSNO处理孢子化卵囊的脱囊率最高的组合为B1C3，即胆酸盐浓度0.75%，消化液作用时间为2 h时，子孢子脱囊最彻底。

3 讨论

柔嫩艾美耳球虫的卵囊壁是一个坚固的化学结构，并且能够耐受机械性损伤，卵囊对于化学制品、消化酶、洗涤液以及低渗溶液的破坏具有相当的抵抗力，常规的消毒剂很难破坏球虫的卵囊壁结构。对于成熟的孢子化的卵囊，必须采用特殊的机械方法才能在某种程度上破坏卵囊壁，本试验研究表明，采用研磨器机械破碎的方法对于卵囊壁的破裂能够取得较好的效果。

体外脱囊试验进一步评价了GSNO对于孢子化卵囊的体外消毒效果，邢涛等[12]研究表明经GSNO处理的孢子化卵囊的脱囊减少率均值为20.8%；李金贵等[6]报道GSNO可以不可逆地抑制未成熟卵囊的孢子生殖，其抑制率高达100%，这提示球虫的卵囊壁在卵囊成熟前后可能发生了形态或生理上的变化，可能对GSNO处理具有一定的保护作用。

本试验研究结果表明，胆酸盐浓度为0.75%，作用时间为2 h时，GSNO处理孢子化卵囊的子孢子脱囊率最高。胆酸盐浓度与其他文献的报道相一致，而脱囊液作用时间则比其他文献报道的时间长[13]，这表明消化液处理时间越长子孢子脱囊越完全。

在本试验中，对于16 mmol/L GSNO处理的成熟孢子化卵囊，其子孢子脱囊率的均值为43.72%，而未经任何处理的卵囊其脱囊率高达96.69%[11]，该结果表明GSNO能在一定程度上抑制鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的脱囊，这提示GSNO在预防和控制鸡球虫病方面有广阔的应用前景。

参考文献：

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