橡胶树基因转化烟草研究

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本文作者：张全琪、 倪燕妹、朱家红、黄志 单位：广东农垦热带作物科学研究所、中国热带农业科学院热带生物技术研究所、农业部热带作物生物技术重点开放实验

室

植物为适应和抵御各种生物和非生物胁迫，在长期的进化过程中形成了一整套复杂而有效的适应性机制，其中，基因表达的转录调节在植物应答各种胁迫过程中起着十分重要的作用。转录因子是植物中最重要的一类调节因子。WRKY是近年来报道的一类植物特有的新型转录调控因子，因在其N端含有由WRKYGQK的7个氨基酸组成的高度保守序列而得名。自1994年Ishiguro和Nakamura从甘薯(Ipomoeabatatas)中首次克隆得到第一个WRKY转录因子SPF1后，人们相继在欧芹(Petroselinumsativum)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草和水稻(Oryzasativa)等多种植物中分离得到WRKY基因[1–4]。巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)是天然橡胶的主要来源，在世界经济中一直占有重要的地位，是一种非常重要的热带经济和能源作物[5]。然而，随着全球气候环境的日益恶化，干旱、低温等极端天气对橡胶种植业的影响逐渐显现出来。乙烯利作为天然橡胶生产过程中频繁使用的一类生长调节剂，在刺激橡胶树增产及应答各种生物和非生物胁迫信号过程中发挥重要作用。为了弄清乙烯利在刺激橡胶树增产及应答信号转导中的分子机制，我们构建了乙烯利诱导下的胶乳抑制性削减文库，并获得了一批差异表达的EST序列[6]，其中No.125EST序列编码的蛋白和其他植物中的WRKY蛋白具有较高的同源性。已有的研究发现，WRKY基因广泛参与植物的抗逆胁迫和衰老等生理生化过程，干旱、病原菌侵染、机械伤害和植物激素类物质的刺激(如乙烯利、茉莉酸、水杨酸)等均能诱导WRKY基因的表达[7–9]。这暗示着巴西橡胶树中相应基因的表达可能受到乙烯利的调控，并可能参与了乙烯利刺激橡胶树增产过程及应答某种生物或非生物胁迫的分子调节。本研究用RACE结合RT-PCR技术从巴西橡胶树中克隆到HbWRKY1基因，利用根癌农杆菌介导的叶盘法将HbWRKY1导入烟草，探讨HbWRKY1基因的表达特性及其与橡胶树抗逆性的关系，为进一步研究HbWRKY1基因功能及深入了解乙烯利刺激橡胶树增产的分子机制提供科学参考。

1材料和方法

1.1植物材料巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)无性系RRIM600种植在中国热带农业科学院实验农场，选取6年树龄的未开割树采集胶乳并迅速置于液氮中冷冻，–70℃下保存。胶乳总RNA的提取参照张治礼等[10]的方法进行。

1.2HbWRKY1基因的克隆应用抑制性消减杂交技术，我们成功构建了乙烯利刺激下巴西橡胶树胶乳与未处理胶乳差异表达的cDNA消减文库，根据在筛选削减文库时获得的No.125EST序列设计两个5′RACE特异性引物GSP1：5′-ATCCGCAACCTTAACCGGTTC-3′、GSP2：5′-TGGAGGCTGAGGAAATCGACG-3′，分别与通用引物UPM：5′-CTAATACGACTC-ACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGC-AGAGT-3′配对组成两对巢式引物进行5′端的克隆。设计3′RACE特异性引物GSP3：5′-TCTGATGAAGCGTCCACAATTCATGG-3′进行3′端的克隆。具体操作参照CLOTECH公司的SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit说明书进行。将扩增出的DNA连接到pGEM-T载体上进行序列测定。将所获得的序列和已有的EST序列进行拼接，为了保证分离出的片段来自同一个基因，分别在5′端起始密码子的上游和3′端终止密码子的下游设计特异引物F1:5′-ATGACATGCAATACCTGC-3′,F2:5′-CTAATTACTCTGGGCATTACC-3′进行全长cDNA的扩增，然后将扩增的DN段连接到pGEM-T载体上进行测序，将测序结果与拼接结果进行比较，利用网上数据库进行BLAST分析，用DNAMAN软件进行序列比对，将测序正确的WRKY-cDNA序列命名为HbWRKY1。

1.3HbWRKY1的生物信息学分析蛋白质特性分析

利用ProtParam软件()对推导的HbWRKY1氨基酸序列进行理化特性分析，同时利用NCBICD-Searchservice工具和Expasy软件(/prosite/)对HbWRKY1的结构域分析。系统进化树分析

将巴西橡胶树HbWRKY1与其他植物的WRKY转录因子进行氨基酸水平的聚类分析。系统进化树包括18个WRKY蛋白，分别为巴西橡胶树的GU372969；拟南芥的AF331713、AF224698、AF418309、AF509499、AF426253、AF224700和AF421157；水稻的DQ298180、BK005035、DQ298181、DQ298182、DQ298183、DQ298184、DQ298185、DQ298186和AF193802以及欧芹(Petroselinumsativum)的U48831。张全琪等：巴西橡胶树HbWRKY1基因的克隆及转化烟草的初步研究亚细胞定位及功能分类

用Psort软件()分析HbWRKY1转录因子的亚细胞定位。用Protfun在线工具(www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)预测HbWRKY1蛋白的功能分类。

1.4根癌农杆菌介导HbWRKY1转化烟草植物表达载体的构建

根据HbWRKY1基因的编码区序列设计引物EWRKYa:5′-ATCCATGGGCTATGGAAGGGAAAGAAGAGGT-3′(含酶切位点NcoI)和EWRKYb:5′-CGACTAGT-TCTACTCCTCGTTTAGCATATGGGA-3′(含酶切位点SpeI)，将扩增的HbWRKY1基因ORF片段经NcoI、SpeI双酶切后连入载体pCAMBIA1304，构建植物表达载体pCAMBIA1304-HbWRKY1，取适量pCAMBIA1304-HbWRKY1质粒导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受态细胞,获得工程农杆菌GV3101(pCAMBIA1304-HbWRKY1)。转HbWRKY1基因烟草的获得

农杆菌GV3101(pCAMBIA1304-HbWRKY1)在附加利福平50μgmL-1、卡那霉素50μgmL-1的YEB液体培养基中常规活化，培养至OD600约为0.6~0.8。将烟草(Nicotianatabacum)无菌苗叶片的边缘和叶脉剪去，切成0.4cm×0.6cm大小，在准备好的农杆菌菌液中浸泡5min。用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入表面铺一层滤纸的MS固体培养基上，于28℃下暗培养，以转化空载体作为对照。3d后将叶片转到附加20mgL-1潮霉素、300mgL-1头孢霉素的MS分化培养基上，进行光照培养，每3周继代培养1次。约1~2月后，将约2cm高的幼苗转到1/2MS生根培养基上生根。待根系发育良好后，移栽到土壤中。转基因烟草PCR检测

采用SDS法[11–12]提取转基因烟草的基因组DNA，按照pCAMBIA1304载体上连接目的基因位点两侧的序列合成PR-F和PR-R引物，并以pCAMBIA1304-HbWRKY1质粒DNA为阳性对照，以野生型烟草植株为阴性对照，进行PCR扩增，检测转基因烟草中的HbWRKY1基因。干旱胁迫实验

将经PCR检测筛选出的阳性转基因植株移栽至装有旱地耕作层干土的盆中，缓苗10d左右植株进入正常生长期后即可进行干旱胁迫实验，胁迫实验开始前1d每盆植株浇透水，使土壤含水量达到田间持水量水平，次日开始胁迫实验后停止供水使其自然下降,当达到预定的胁迫强度下限后,每天称重浇水使其土壤含水量维持在胁迫水平，于植株干旱胁迫15d后复水，观察处理植株恢复情况。

2结果和分析

2.1巴西橡胶树WRKY基因的克隆通过对巴西橡胶树已有的No.125EST序列进行分析，结果表明，该序列与其他植物中的WRKY一致性较高，表明该EST序列可能为巴西橡胶树胶乳WRKY基因片段。在此基础上设计5′RACE和3′RACE引物对其5′和3′端进行扩增，结果获得了约480bp的5′端片段和300bp的3′端片段。经回收、克隆和测序后证实，5′端片段有479bp，3′端片段有296bp。利用DNAMAN软件，将3′、5′端序列与同HbEST125序列进行拼接，得到了一条长度为1234bp的cDNA序列。根据拼接好的序列设计引物EWRKY1和EWRKY2对HbWRKY1编码区进行扩增，得到一条约900bp的特异带，与预期结果一致。回收目的条带，插入pMD18-T克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，获得阳性重组质粒，经BamHI、XhoI双酶切鉴定，与扩增特异条带大小一致。测序结果表明该编码区序列长912bp，与拼接结果序列完全一致，证明了克隆的3个片段确实来自于同一个基因。用ORFfinder软件分析表明，该基因cDNA全长为1234bp，包含1个912bp的完整开放阅读框序列(ORF)，编码1个含有303个氨基酸残基的多肽；以及178bp的5′非编码区和145bp的3′非编码区；用巴西橡胶树基因组DNA为模板进行扩增，结果表明该基因含有两个内含子(图1)。在NCBI网站进行序列比对，该cDNA序列与其他植物的WRKY基因具有较高的相似性，与蓖麻(Ricinuscommunis)、杨树[(Populustomentosa×P.bolleana)×P.tomentosa]和大豆(Glycinemax)WRKY基因(EEF47235、GQ377433和ABC26920)的核苷酸序列相似性分别达81%、78%和75%，氨基酸序列相似性分别达79%、73%和59%。这表明，我们分离的cDNA序列为橡胶树WRKY基因，将其命名为HbWRKY1，这是首次公开报道从热带产胶植物巴西橡胶树中克隆获得WRKY基因，GenBank登录号为GU372969。

2.2HbWRKY1的生物信息学分析利用ProtParam软件对推导的HbWRKY1氨基酸序列进行理化特性分析,结果表明，HbWRKY1的分子量为33.87kD，理论等电点为5.87。其中极性氨基酸(W,Y,S,C,M,N,E,T,D,Q,K,R,H)占61.7%,极性氨基酸的带电氨基酸(D,E,H,K,R)占25.8%；酸性氨基酸(D,E)占12.6%，碱性氨基酸(H,K,R)占13.2%；疏水性氨基酸(A,F,I,L,M,P,V,W,Y)占39%。蛋白质不稳定指数估算值为59.33,属于不稳定蛋白质。利用NCBICD-Searchservice工具和Expasy软件对HbWRKY1的结构域进行分析表明，HbWRKY1含有1个WRKY结构域和1个FLYWCH锌指结构域(图2)。应用DNAMAN5.2软件将HbWRKY1与其他植物已知的WRKY蛋白进行多序列比较，结果表明，HbWRKY1与拟南芥(NP_182248)、大豆(ABC26920)、蓖麻(EEF47235)和马铃薯(Solanumtuberosum,ABU49723)的WRKY蛋白具有较高的同源性，都具有一个典型的WRKY结构域和一个FLYWCH锌指结构域(图3)。将巴西橡胶树HbWRKY1与其他植物的WRKY转录因子进行氨基酸水平的聚类分析(图4)，结果表明，巴西橡胶树HbWRKY1与属于WRKY家族中第II类的AtWRKY6、AtWRKY18、OsWRKY62、OsWRKY76、OsWRKY32的亲缘关系相近，说明HbWRKY1也属于WRKY家族中的第II类，它们具有类似的功能与结构。用Psort软件()对HbWRKY1转录因子进行亚细胞定位，结果表明，该蛋白最终定位于细胞核的可能性最大，为30%。用Protfun在线工具(www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)预测HbWRKY1蛋白的功能分类，结果表明该蛋白具有转录、转录调控、信号传导和逆境应答的可能性分别达到0.537、0.363、0.064和0.025，其可能性远高于其他功能。植物WRKY转录因子在转录、转录调控、信号传导和逆境应答中的功能已经得到证实，因此推测HbWRKY1蛋白在橡胶树中可能具有转录、转录调控、信号传导和逆境应答的功能。

2.3HbWRKY1的遗传转化应用根癌农杆菌GV3101(pCAMBIA1304-HbWRKY1)植物转化系统对烟草进行遗传转化，初步获得了65株潮霉素抗性烟草再生株系(图5)。转基因烟草植株PCR检测

以野生型植株及转基因苗的基因组DNA为模板，按照pCAMBIA1304载体上连接的目的基因两侧的序列分别合成PR-F和PR-R引物，并以pCAMBIA1304-HbWRKY1质粒DNA为阳性对照，以野生型烟草植株为阴性对照，进行PCR扩增。结果表明，野生型植株基因组没有出现扩增信号，在72株含HbWRKY1基因的抗性烟草植株中，有65株的基因组DNA可以扩增出与pCAMBIA1304-HbWRKY1质粒扩增产物大小一致的特异条带，阳性率为90.3%(图6)，证明这些植株为转HbWRKY1基因的烟草植株。由于PCR高敏感性导致的高污染率，其阳性结果并不能完全说明目的基因已转化进入受体中，因此还需要进一步验证。HbWRKY1过量表达对干旱胁迫的响应

利用RT-PCR技术对HbWRKY1的表达特性进行分析，结果表明，ABA和PEG6000处理能够诱导HbWRKY1基因表达(数据未发表)。ABA作为一种重要的植物激素，在植物对干旱、高盐等胁迫反应中起重要作用。本研究设计了干旱胁迫实验，分析HbWRKY1过量表达对干旱胁迫的反应。干旱实验结果表明，干旱处理15d后，HbWRKY1过量表达植株的生长基本正常，而对照植株则大部分萎蔫(图7a)；恢复浇水20d后，HbWRKY1过量表达植株生长更加茁壮，对照植株虽然也恢复了生长，但其长势较弱，且老叶边缘枯黄(图7b)。这些实验结果表明，HbWRKY1过量表达能够增强烟草对干旱胁迫的抗性。

3讨论

通过RACE技术，利用巴西橡胶树SSH文库，克隆得到1个编码WRKY转录因子的基因，该基因编码的氨基酸序列与蓖麻、杨树的相应氨基酸序列具有较高的相似性。同时，该蛋白包含1个WRKY家族特有的WRKY结构域及1个C2H2类型的锌指结构，这是首次公开报道从热带产胶植物巴西橡胶树中克隆到WRKY基因，故将其命名为HbWRKY1。本研究利用农杆菌介导的叶圆盘法将克隆到的HbWRKY1基因导入烟草，经PCR检测表明有65株转基因烟草中HbWRKY1基因已经成功整合到烟草基因组中。还有7株为假阳性植株，这可能是外植体在筛选过程中，选择压加得太迟或加得太少，致使未转化细胞能正常分裂分化，或者外植体的某些表层细胞稳定表达外源抗性基因，降低了其周围培养基中的Kan浓度，而一些非转化细胞在较低的选择压力下继续分化。另外，T-DNA进入细胞后并没有整合到受体基因组中，而是以游离状态存在，这也将导致PCR的结果呈阳性。植物在漫长的进化史中，形成了一套有效的防御系统来抵御各种外界伤害，其中通过乙烯、茉莉酸和水杨酸等信号分子激活植物体内一系列防御基因的表达,从而使植物表现出对生物胁迫的抗性反应是植物应答各种伤害的主要途径之一。WRKY转录因子基因受各种生物和非生物胁迫诱导，在植物遭受各种胁迫时，WRKY基因能迅速表达，通过与下游靶基因启动子中的顺式作用元件特异性结合，从而调控基因的转录和表达，最终开启植物自身防御系统进行防卫应答[13]。本研究利用乙烯利刺激条件下处理与未处理胶乳差异表达构建的cDNA消减文库克隆得到HbWRKY1基因，推测该基因可能参与了橡胶树乙烯信号的传递过程，其表达受乙烯诱导，通过利用乙烯信号转导途径调节自身转录水平，从而对巴西橡胶树防御反应的激活起着重要作用。另外，我们对筛选出的阳性植株进行干旱胁迫处理，结果表明转基因植株与野生型植株相比，表现出较明显的耐旱性，初步说明HbWRKY1过量表达能够增强烟草对干旱胁迫的抗性，暗示HbWRKY1基因可能在橡胶树适应干旱胁迫的过程中扮演至关重要的角色。目前，对WRKY转录因子的功能还了解得不很透彻，如对其表达特性进行分析及下游靶基因的筛选与功能鉴定等，还需要进行更加深入的研究。此外，对转基因株系进行深入的生理实验也是必须的，尤其是抗逆、抗病相关的生理实验，这将为橡胶树抗逆机理的研究提供科学依据。