纤维素酶法提取制备复方半边莲注射液的工艺条件

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摘要：探索纤维素酶法提取制备复方半边莲注射液的最佳工艺条件，采用单因素试验和正交试验设计，运用纤维素酶法提取制备复方半边莲注射液，并以HPLC法检测指标成分野黄芩苷含量为指标。结果表明，各因素的影响次序为酶解温度、pH、酶用量、酶解时间，最佳工艺条件为酶解温度45 ℃，酶用量为7.2 mg/g，最适pH为5.0，酶解时间为60 min。在此条件下，复方半边莲注射液中野黄芩苷含量为2.42 mg/mL，明显大于注册标准中煎煮法野黄芩苷含量1.34 mg/mL。相对原注册标准煎煮法，纤维素酶法提取制备复方半边莲注射液工艺简单可行，具有提取效率高、生产周期短等优点。

关键词：纤维素酶;复方半边莲注射液;野黄芩苷;正交试验

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4946-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.20.046

Technologies of Extracting Compound Lobelia Injection with Cellulase

WANG Hai-yan，YE Zhao-wei，CHEN Qiong

（Xinyang College of Agriculture and Forestry/Xinyang Traditional Chinese Medicine Resources Development Engineering Research Center， Xinyang 464000， Henan， China）

Abstract： The conditions of extracting compound lobelia injection with cellulase were optimized. The scutellarin of compound lobelia injection was extracted by cellulase and determined by HPLC in orthogonal experiment. The optimal conditions were the enzymolysis temperature of 45 ℃， the pH of 5.0， the enzymolysis time of 60 minutes. Under these conditions， the content of scutellarin in compound lobelia injection was 2.42 mg/mL， significantly more than 1.34 mg/mL through decocting technology contained in registration standards. Cellulase extraction of compound lobelia injection is simple and feasible， with advantages of high efficiency and short production duration.

Key words： cellulase; compound lobelia injection; scutellarin; orthogonal experiment

复方半边莲注射液为河南同源制药有限公司独家生产的中药注射液，处方主要组成为半边莲、半枝莲、白花蛇舌草，具有清热解毒消肿止痛功效。用于多发性疖肿、扁桃腺炎、乳腺炎等[1]。因其能明显抑制癌细胞的细胞核分裂，抑制DNA的合成，从而达到抑制癌细胞的增殖、复制，故也可配合化疗用于肿瘤的治疗[1]。近年来还有文献报道复方半边莲注射液可治疗小儿支气管肺炎[2]、配合西药治疗毛细支气管炎[3]、小儿急性支气管炎[4]、小儿支原体肺炎[5]、小儿或成人急性呼吸道感染[6]、婴幼儿秋冬季腹泻[7]、外感高热[8]等。

纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。纤维素是半边莲、半枝莲、白花蛇舌草等药材细胞壁的主要成分，亦是胞内苷等大分子化合物溶出的主要屏障，利用纤维素酶水解细胞壁，有利于胞内成分的溶出[9，10]。复方半边莲注射液原注册标准的提取方法为煎煮法[1]，本试验在单因素试验基础上应用正交设计优化纤维素酶提取制备复方半边莲注射液的工艺条件，探索各因素对指标性成分野黄芩苷含量的影响，以期达到提高提取效率、缩短提取时间和降低能耗，为生产复方半边莲注射液的工艺改进提供理论依据，并为酶技术在中药制剂方面的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

半边莲、半枝莲、白花蛇舌草购于信阳市药材站（经河南同源制药有限公司检验合格），野黄芩苷标准品（中国药品生物制品检验所，批号110842-201106），纤维素酶（北京奥博星生物有限公司，批号20110910），去离子水（自制），注射用水（自制），乙醇、氢氧化钠、盐酸、醋酸（均为分析纯），甲醇（色谱纯），一级针用活性炭。

1.2 仪器

电磁炉（美的）;液相色谱仪（安捷伦1100）;SHB-3型循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）;水循环恒温水浴箱（上海智城分析仪器制造有限公司）;PB602-S型电子天平（梅特勒）;H1221型精密pH计（ 上海精密科学仪器有限公司）;101AS-2型电热恒温干燥箱（上海实验仪器有限公司）;200型板框过滤机（禹州市强国化工设备有限公司）;薄膜过滤器;ARF安瓿熔封机（郑州玉祥机械设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 药材处理 将半边莲、半枝莲、白花蛇舌草挑拣淘洗后于105 ℃烘干备用。

1.3.2 野黄芩苷含量测定[2] 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇-水-醋酸（35∶61∶4）为流动相;检测波长为335 nm。理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于1 500。精密称取野黄芩苷标准品适量，加20%甲醇溶解，制成50 μg/mL的溶液，即得标准品溶液。精密移取复方半边莲注射液2 mL，置10 mL容量瓶中，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀，以微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

1.3.3 提取方法

1）原注册标准提取方法[1]。准确称取半边莲、半枝莲、白花蛇舌草各50 g，加去离子水煎煮两次，第一次药材10倍量水煎煮2 h，第二次药材5倍量水煎煮1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15（55～60 ℃）的清膏，加乙醇至含醇量为65%，静置12 h，滤过，滤液调节pH 8.0～8.5，静置1 h，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水至50 mL，调节pH 2.0～3.0，加活性炭5 g，搅拌均匀，煮沸30 min，滤过，滤液调节pH 6.0，冷藏24 h，滤过，再调节pH 6.0～7.0，加注射用水至100 mL，灌封，100 ℃煮沸灭菌30 min。

2）纤维素酶纤维素酶提取法。准确称取半边莲、半枝莲、白花蛇舌草各50 g，加10倍药材量纯化水，加纤维素酶、调节pH、调温度并酶解规定时间，按L9（34） 正交表设计试验，对9组试验条件下制得的复方半边莲注射液中野黄芩苷的含量进行测定。清膏的纯化与注射液的制备同原注册标准。因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶提取法的单因素试验结果

2.1.1 酶解时间对野黄芩苷含量的影响 由图1可知，酶解时间达到60 min时，分解趋于完全，野黄芩苷大部分已溶出，随着反应时间的延长，其含量增加幅度不明显，因此酶解时间选择60 min较合适。

2.1.2 酶解温度对野黄芩苷含量的影响 由图2可知，在其他条件相同的情况下，45 ℃酶解的野黄芩苷含量高于其他温度，说明45 ℃为所用纤维素酶的最适温度。

2.1.3 酶解pH对野黄芩苷含量的影响 由图3可知，在其他条件相同的情况下，酶解pH为5.0时，野黄芩苷含量最高，说明pH 5.0为所用纤维素酶的最适pH。

2.1.4 酶用量对野黄芩苷含量的影响 由图4可知，酶用量从6.0～7.0 mg/g，野黄芩苷含量显著提高，后趋于平缓，说明7.0 mg/g的酶用量已能将样品最大程度酶解。

2.2 正交试验结果

正交试验结果如表2所示。由极差R的大小可知，纤维素酶提取法中各因素对野黄芩苷提取率影响的主次顺序为酶解温度、酶解pH、酶用量、酶解时间，即酶解温度为主要影响因素，酶解时间影响最小。在考察范围内，最佳工艺条件可选择为A2B2C2D3，即酶解时间60 min、酶解温度45 ℃、酶解pH 5.0、酶用量7.2 mg/g。验证试验结果表明，在该条件下，野黄芩苷平均含量为2.42 mg/mL，较原注册标准提取方法（野黄芩苷含量1.34 mg/mL）提高了80.6%。

3 结论

通过对运用纤维素酶法提取制备复方半边莲注射液工艺的探讨，在单因素试验的基础上，采用正交试验设计，确定复方半边莲注射液的最佳提取工艺参数为A2B2C2D3，即酶解时间60 min、酶解温度45 ℃、酶解pH 5.0、酶用量7.2 mg/g，在此条件下，复方半边莲注射液中野黄芩苷的平均含量为2.42 mg/mL，与注册标准中的煎煮法相比，野黄芩苷含量高出80.6%，提高了有效成分的提取率，而且提取时间由原来3 h缩短至60 min，大大节约了能源，减少了人工劳动强度，缩短了生产周期，为复方半边莲注射液提取工艺的改进提供了参考依据。

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