添加发酵菠菜液对猪肉灌肠冷藏过程中品质的影响
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摘 要：利用发酵菠菜替代亚硝酸盐的作用，开发新型绿色肉制品。将菠菜打浆后进行自然发酵和接菌（萨科WBL-45复合菌株）发酵，发酵过程中分别为不调节pH值和每0.5 h调节pH值至中性，测定发酵过程中硝酸盐和亚硝酸盐含量的变化。然后将加工猪肉灌肠分3组，CK组（不添加亚硝酸钠）、SN组（添加0.15 g/kg亚硝酸钠）、FS组（添加136 g/kg发酵菠菜液），测定猪肉灌肠在冷藏过程中的抗氧化性（TBARs）、色差和亚硝酸盐残留量。结果表明：菠菜打浆后添加10 g/100 g葡萄糖、接种量4.25×106 CFU/mL、发酵温度38 ℃、发酵12 h时，菠菜中的硝酸盐可以最大程度地转化为亚硝酸盐，亚硝酸盐含量达到1 100 mg/kg。添加了发酵菠菜液的猪肉灌肠在冷藏过程中TBARs值明显比CK组低，且与SN组（亚硝酸钠组）差异不显著，亚硝酸盐残留量小于30 mg/kg，符合国标要求，由于菠菜中含有天然叶绿素、叶黄素等，使产品呈现诱人的鲜亮绿色。
关键词：发酵菠菜液；猪肉灌肠；硝酸盐；亚硝酸盐；品质
Abstract： Nitrite plays a very important role in processing meat products. However， at the same time， it may cause the potential hazard to forme N-nitrosamine. This experiment focuses on finding a new alternative to nitrite for the development of green meat products. Spinach leaves were mashed into a paste and split into two aliquots that were either naturally fermented or inoculated with a composite starter culture （WBL-45） and fermented. During the fermentation process， each aliquot was either adjusted to neutral pH after every half an hour or without pH adjustment， and the changes in nitrate and nitrite contents were monitored. Three groups of pork sausages were set up： CK （without sodium nitrite）， SN （with
0.15 g/kg sodium nitrite） and FS （with 136 g/kg fermented spinach） and the antioxidant activity （thiobarbituric acid reactive substances， TBARs， which are formed as a byproduct of lipid peroxidation）， colgor difference and nitrite residue were measured during the fermentation process. The results showed addition of 10 g/100 g glucose （by mass） to mashed spinach followed by fermentation at 38 ℃ for 12 h with the starter culture inoculated at a level of 4.25 × 106 CFU/mL maximized the conversion of nitrate to nitrite， reaching 1 100 mg/kg. The value of TBARs in pork sausage with fermented spinach was apparently lower than that in CK group and showed no significant difference from that in SN group. Furthermore， the amount of nitrite residue in SN group was smaller than 30 mg/kg， measuring up to the requirement of the Chinese national standard. The bright green color of the sausages was attractive due to the presence of chlorophyll and lutein naturally occurring in spinach.
Key words： fermented spinach； pork sausages； nitrate； nitrite； quality
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）03-0015-05
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201503004
亚硝酸盐能使腌肉制品呈现稳定的红色，并具有独特的风味和抗氧化作用[1]，亚硝酸盐还具有抑制肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）生长繁殖的作用，从而防止肉毒毒素产生，降低安全风险[2]。另有研究证实硝酸盐在微生物的作用下转化为亚硝酸盐也可产生上述同样作用[3]。因此，亚硝酸盐被作为不可替代的添加剂应用在腌肉制品领域[4]。然而亚硝酸盐亦可与肉制品中的次级胺，如仲胺、叔胺、氨基酸等发生反应，形成致癌物质N-亚硝胺化合物，诱发消化系统癌变，目前已成为食品安全关注的焦点之一[5-7]。为了达到产品既具有腌肉的品质和特点，也能不直接添加人工合成的亚硝酸钠，“天然腌制”被学者提出，其原理是利用特定微生物将天然来源的硝酸盐转化为天然型的亚硝酸盐，从而替代传统的合成型亚硝酸盐[9-10]。蔬菜作为一种天然物质，富含硝酸盐，所以被作为硝酸盐来源广泛应用到了天然有机腌肉制品中，其中芹菜是应用最多的，其天然硝酸盐含量达到2 100 mg/kg[11-12]。微生物主要利用的是具有硝酸盐还原性的菌，如肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）等。菠菜中富含维生素、矿物质、蛋白质、纤维素等，目前对叶菜类蔬菜产品安全性评价指标主要集中在农药残留和硝酸盐、亚硝酸盐含量上。研究结果显示，人体积累的硝酸盐大约有80%～92%来自于蔬菜，我国菠菜中硝酸盐的含量为239～4 044 mg/kg，属中等偏高水平[13]。本研究利用菠菜中天然含有的硝酸盐，依靠萨科WBL-45复合菌株（肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌）将硝酸盐转化为亚硝酸盐，添加到猪肉灌肠的加工中，以期提高灌肠的品质，开发一种新型的绿色肉制品。
1 材料与方法
1.1 菌种、材料与试剂
萨科WBL-45菌株由意大利Sacco公司提供，萨科WBL-45
菌株由肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和清酒乳杆菌（Lactobacillus sake）组成，总菌数4.25×1010 CFU/g。
新鲜猪通脊肉、猪背膘肉、新鲜菠菜、猪肠衣、香辛料、淀粉等，均购于天津市西青区红旗农贸市场。
亚铁氰化钾、对氨基苯磺酸、乙酸锌、盐酸萘乙二胺、饱和硼砂、7.5%的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，其中含有0.1%丁基羟基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）和0.1%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液，0.02mol/L β-硫代巴比妥酸、氯仿、亚硝酸钠标准溶液（0.2 mg/mL）等均为化学纯。
1.2 仪器与设备
CM-14斩拌机 西班牙美卡公司；CM-5色差仪 日本Konica Minolta公司；SX-300灭菌锅 日本Tomy公司；FA2004精密电子天平 上海精科仪器公司；
TU-1800分光光度仪 日本Hmadzu公司；IMS-50制冰机 河南兄弟仪器设备有限公司； WH2漩涡混合机 上海沪西分析仪器厂有限公司；PB-10酸度计 德国赛多利斯科学仪器有限公司；KDF-2513组织捣碎机 天津市达康电器有限公司；ZXL（B）-250半自动蒸熏炉 沈阳市东方食品机械制造厂；TV-5L不锈钢灌肠机 广东乐王实业有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵菠菜液的实验方案设计
将新鲜菠菜去根、清洗、沥水、切碎后，用组织捣碎机打成浆，得到菠菜液进行发酵实验。菠菜液的发酵实验分4 组，每组均取50 g菠菜液放入250 mL锥形瓶中，加入事先已灭过菌的20 g/100 g葡萄糖浓溶液50 mL，使菠菜液中的葡萄糖质量浓度为10 g/100 g，然后按照实验设计方案（接菌或不接种；发酵过程调节pH值或不调节）在恒温摇床中进行发酵，发酵温度38 ℃，发酵时间24 h，期间每隔3 h，测定其硝酸盐和亚硝酸盐的含量变化。具体分组情况如下：1组为不接种，完全依靠蔬菜液中自身含有的微生物进行发酵，发酵过程也不调节pH值；2组为不接种，自然发酵过程中每隔0.5 h对发酵液调节一次pH值，使其稳定在7.0～7.1之间；3组为接种萨科WBL-45菌株，接种量为4.25×106 CFU/mL（称取0.1 g萨科WBL-45溶于10mL无菌水中，取1 mL加入实验3组的锥形瓶中摇匀），38 ℃发酵12 h，期间不调节pH值；4组为接菌量同第3组，但发酵过程中每0.5 h将pH值调节至7.0～7.1。所有实验重复2 次。
1.3.2 发酵菠菜猪肉灌肠实验方案设计
1.3.2.1 猪肉灌肠的加工工艺
配方：猪通脊肉800 g、猪背膘肉200 g、食盐25 g、复合磷酸盐3 g、抗坏血酸钠2 g、白糖4 g、葡萄糖4 g、白胡椒粉2.5 g、豆蔻粉1 g、鸡蛋70 g、淀粉80 g、冰水160 mL。
工艺流程：原料肉选择和修整低温腌制加入辅料斩拌灌肠烘烤蒸煮烤制包装冷藏
工艺操作要点：1）原料肉整理：瘦肉修去筋膜，用绞肉机绞碎（3 mm筛板孔径），背膘切块。2）斩拌：按照配方称取各辅料后，依次在斩拌机中加入绞碎瘦肉，开动斩拌机低速转1 min，加入辅料、背膘和冰水，高速斩拌5 min，使肉馅斩拌成肉糜状态。3）灌肠：用灌肠机将肉馅灌入猪肠衣中，注意松紧度，每隔14 cm用线绳结扎，灌好后针刺排气，温水漂洗。4）烘烤：在多功能烟熏炉里烤制，烘烤温度65～80 ℃，时间2～3 h，使肠的中心温度达55～65 ℃。5）蒸煮：保持水温80～85 ℃。当肉馅中心温度达到70～72 ℃时为止。6）烤制：蒸煮好后再一次放入烤炉里进行烤制，温度50 ℃，时间2 h，表面干燥即可。
1.3.2.2 猪肉灌肠的分组
CK组：按照以上配方添加，即不添加亚硝酸钠，也不添加发酵菠菜液；SN组（sodium nitrite，SN）：添加0.15 g/kg亚硝酸盐钠；FS组（fermented spinach，FS）：按照菠菜发酵实验条件的第4组（即接种4.25×106 CFU/mL
萨科WBL-45菌株，发酵温度38 ℃、发酵时间12 h，期间0.5 h调节pH值至中性）进行批量发酵得到发酵菠菜液，经测定发酵菠菜液中亚硝酸盐含量为1 100 mg/kg，按照国标中规定的亚硝酸钠最大添加量为0.15 g/kg计算，在猪肉灌肠加工中发酵菠菜液的添加量为136 g/kg。
按照以上设计方案加工出3组猪肉灌肠，真空包装后4 ℃冷藏4周，每周测定产品中硝酸盐含量、亚硝酸盐含量、脂质过氧化（thiobarbituric acid reactive substances assay，TBARs）值和色差。实验重复2 次。
1.3.3 指标测定
1.3.3.1 硝酸盐含量的测定
按照NYT 1279―2007《蔬菜、水果中硝酸盐的方法测定 紫外分光光度法》[14]测定。
1.3.3.2 亚硝酸盐含量的测定
按照GB 500933―2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》分光光度法测定[15]。
1.3.3.3 pH值的测定
称取5 g样品，加入15 mL蒸馏水，匀浆30 s后，将pH计探头插入其中，读取示数。
1.3.3.4 TBARs值的测定
采用Liza 等[16]的方法。取5.0 g切碎的样品，加15 mL
1.3.3.5 色度的测定
制备均匀样品，平铺在色差平皿底部，将色差仪进行白板校正后检测其红度（a*）值。
1.4 数据分析
所有数据使用SPSS 17.0进行分析。
2 结果与分析
由图1可知，在发酵过程中，4组菠菜液中的硝酸盐含量变化趋势一致，均呈先下降，大约发酵到12～15 h，又开始出现回升现象。但这种变化的速率不同，第4组（即接菌并调节pH值）硝酸盐下降速度最快，其次是第3组，第1组和第2组硝酸盐下降速率稍慢。硝酸盐在发酵过程中含量的变化是消耗与生成的一个动态平衡过程。发酵初期由于菠菜本身携带的乳酸菌活动微弱，形成抑菌的物质（乳酸、过氧化氢、乳酸菌肽等）含量低，因此发酵菌株快速繁殖[17]，硝酸盐含量在发酵初期迅速降低。随着抑菌物质的积累和发酵体系中碳源等营养物质的消耗，发酵菌株的生长代谢受到抑制，硝酸盐还原作用减弱，当还原作用小于生成作用，硝酸盐含量就会回升[18-19]。
2.2 菠菜液发酵过程中亚硝酸盐含量变化
由图2可知，4组亚硝酸盐含量变化出现一个峰值，但峰值的高低和峰值出现的时间点不同。1组和2组尽管无人为接种WBL-45复合菌株，但菠菜自身携带的硝酸还原菌会将硝酸盐转化为亚硝酸盐。经过统计软件显著性分析可得，1组（不调节pH值）的亚硝酸盐峰值出现在发酵第15 h，且含量为310 mg/kg，而2组（调节pH值）的亚硝酸盐峰值较1组提前3h出现，且含量明显提高（P
（P
WBL-45复合菌株并不断调节pH值，可显著提高亚硝酸盐的生成量。实验过程中产生“亚硝酸盐峰值”，可能是因为亚硝酸盐生成的同时也伴随着大量亚硝酸盐降解，这种亚硝酸盐降解主要是由于亚硝酸还原酶的微生物作用结果[20]
和乳酸菌发酵引起的酸降解[21]，即当发酵液pH值降到4.0～4.5时，亚硝酸盐迅速分解，并且这种降解作用随着pH值的降低而增强。所以，由于发酵前期发酵菌种生长代谢活跃，亚硝酸盐大量生成，且作用效果大于其他微生物对于亚硝酸盐的分解作用，所以亚硝酸盐含量在前期出现上升，进入到发酵后期时，亚硝酸盐的酸降解作用要大于其生成作用，亚硝酸盐含量就会下降，从而出现了“亚硝酸盐峰值”。
2.3 3组猪肉灌肠制品在冷藏过程中TBARs值变化
由图3可知，3 组猪肉灌肠在冷藏过程中，随贮藏时间的延长TBARs值呈现上升趋势。但CK组在冷藏各时间点的TBARs值均高于SN组和FS组（P
2.4 3组猪肉灌肠制品在冷藏过程中亚硝酸盐含量的变化
由图4可知，3 组猪肉灌肠中的亚硝酸盐含量符合国标要求（≤30mg/kg），在冷藏过程中，亚硝酸盐含量有降低的趋势，因为CK组的配料中没有添加亚硝酸盐或发酵菠菜液，所以CK组的亚硝酸盐含量一直小于5 mg/kg，SN组和FS组的亚硝酸盐含量在冷藏过程中均低于
30 mg/kg，两组之间差异不显著（P>0.05）。
由图5可知，因为SN组添加了亚硝酸盐，所以其a*值一直明显高于CK组和FS组，灌肠呈现腌肉制品特有的鲜红色；CK组没有添加亚硝酸盐或发酵菠菜液，所以灌肠呈现暗红色；FS组的a*值呈现负值是因为尽管含有亚硝酸盐的发色作用，但菠菜的叶片中含有叶绿素（包括叶绿素a和叶绿素b）、叶黄素及胡萝卜素等天然色素，色素含量较高，呈现蓝绿、黄绿、橙黄和黄色，正是由于这些色素的掩盖作用，导致猪肉灌肠呈现绿色，为开发新的绿色肉制品开辟新的思路。
3 结 论
本实验将菠菜打浆，利用萨科WBL-45复合菌株发酵菠菜液，发酵温度38 ℃，发酵过程中每0.5 h调节pH值至中性，当发酵到12 h，菠菜中的硝酸盐可以最大程度转化为亚硝酸盐，含量达到1 100 mg/kg。将这种发酵菠菜液按照0.15 g/kg的亚硝酸盐折算后添加到猪肉灌肠中，实验结果发现，产品在冷藏过程中TBARs值明显比CK组低，亚硝酸盐含量符合国标要求，产品呈现鲜亮的绿色，可为市场开发一种新式绿色肉制品。
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