不同培养条件对油茶根际解磷菌6―Y―09溶磷效果的影响
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摘要 研究了不同碳源（葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖和乳糖）、氮源（硝酸钾、硫酸铵、尿素和硝酸铵）、C/N（40∶1、20∶1、8∶1）、pH值（5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）及温度（24、26、28、30、32、34、36 ℃）对油茶根际解磷菌6-Y-09溶磷能力的影响。结果表明：以葡萄糖为唯一碳源时解磷菌6-Y-09表现出最强的解磷效果，溶磷量达201.51 mg/L；以尿素为唯一氮源时，解磷菌6-Y-09表现出最强的解磷效果，溶磷量达215.43 mg/L；解磷菌6-Y-09最佳C/N为20∶1，最佳pH值为7.0～7.5；另外，解磷菌6-Y-09在28～30 ℃时表现出最强的解磷效果。
中图分类号 S794.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）03-0044-02
Abstract The ability of phosphate solubilizing by strain 6-Y-09 in Camellia oleifera Abel. with different cultivation conditions，including different carbon sources（glucose、fructose、soluble starch、sucrose、maltose、lactose），different nitrogen sources（potassium nitrate、ammonia sulfate、urea、ammonium nitrate），different C/N（40∶1、20∶1、8∶1），different pH value（5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），different temperatures（24、26、28、30、32、34、36 ℃）were studied. The results showed that strain 6-Y-09 had the highest phosphate solubilizing when glucose was used as carbon source，the released soluble P was 201.51 mg/L. When urea was used as nitrgoen source，the released soluble P by strain 6-Y-09 was 215.43 mg/L.In addition，strain 6-Y-09 had the highest capacity of phosphate solubilization when C/N was 20∶1，pH value was 7.0～7.5，and the temperature was 28～30 ℃.
Key words Camellia oleifera Abel.；phosphate solubilizing bacteria；carbon source；nitrogen source；cultivation condition
磷是植物生长发育必需的营养元素之一，同时也是影响作物产量的重要限制因子之一，土壤缺磷直接影响农作物的生长和粮食产量。在我国的总耕地中，磷缺乏的面积占比为74%，且土壤中含有的磷超过95%为无效态，很难被植物直接吸收利用[1]。但是土壤与植物根际中存在大量解磷菌，能够将植物难以吸收利用的磷转化为易被植物吸收利用的磷[2]。有关研究表明施用解磷菌后，可使土壤中的难溶性磷溶解，增加了土壤有效磷的含量，使作物的生长速度加快[3-5]。但不同种类的解磷菌，不仅具有较大的解磷能力，且解磷的机理也有所不同。另外，培养基中碳源[6]、氮源、磷源和无机盐[7]等也均会对解磷菌生长产生影响。也有学者认为，微生物的解磷能力可能与它分泌有机酸类物质有关，也可能存在多个解磷机理[8-9]。本研究旨在探讨从油茶根际土壤中分离筛选获得的高效解磷菌6-Y-09在不同培养条件下的溶磷效果，包括不同碳源、氮源、C/N、pH值及温度对菌株6-Y-09溶磷效果的影响，有利于建立菌株6-Y-09的扩繁技术体系，可为生产上研制油茶专用溶磷菌肥提供一定的理论参考。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试菌株6-Y-09（Burkholderia capacia.），来自本课题组从油茶根际土壤分离、筛选并保存[10]。
1.2 测定方法
1.2.1 不同碳源对菌株6-Y-09溶磷能力的影响。以有机磷培养基为基础培养基，分别设葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖等为碳源，均以等量碳量加入培养基中。于28 ℃、200 r/min摇床发酵培养7 d后测定菌株6-Y-09数量、菌液pH值和水溶性磷含量。每个处理设3次重复。
1.2.2 不同氮源对菌株6-Y-09溶磷能力的影响。以有机磷培养基为基础培养基，分别设硝酸钾、硫酸铵、尿素、硝酸铵等为氮源，均以等量氮量加入培养基中。于28 ℃、200 r/min摇床发酵培养7 d后测定菌株6-Y-09数量、菌液pH值和水溶性磷含量。每个处理设3次重复。
1.2.3 不同C/N对菌株6-Y-09溶磷能力的影响。以有机磷培养基为基础培养基，分别以葡萄糖和硫酸铵为碳源和氮源，设C/N为40∶1、20∶1、8∶1等3个处理。于28 ℃、200 r/min摇床发酵培养7 d后测定菌株6-Y-09数量、菌液pH值和水溶性磷含量。每个处理设3次重复。
1.2.4 不同pH值对菌株6-Y-09溶磷能力的影响。以有机磷培养基为基础培养基，将基础培养基的pH值分别设为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于28 ℃、200 r/min摇床发酵培养7 d后测定菌株6-Y-09数量、菌液pH值和水溶性磷含量。每个处理设3次重复。
1.2.5 不同温度对菌株6-Y-09溶磷能力的影响。以有机磷培养基为基础培养基，将培养温度设为24、26、28、30、32、34、36 ℃，然后置于200 r/min摇床发酵培养7 d后测定菌株6-Y-09数量、菌液pH值和水溶性磷含量。每个处理设3次重复。
1.2.6 菌体数量、pH值和水溶性磷含量的测定。将已经培养7 d的菌液在1 500 r/min的较低速度下离心3 min，然后取4 mL菌液用等体积1 mol/L HCl稀释，目的是除去上清液中残留的碳酸钙颗粒，采用平板计数法计算菌株的数量。剩余的菌液再在10 000 r/min的速度下离心10 min后用pH计测定上清液pH值，最后用钼锑抗比色法测定上清液中水溶性磷含量。测定方法详见参考文献[11]。
1.3 数据处理
数据采用Excel和SAS软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 不同碳源对菌株6-Y-09溶磷能力的影响
由表1可知，不同的碳源可对解磷菌6-Y-09的溶磷能力产生明显的影响。若选择葡萄糖为唯一碳源时，该菌株的解磷能力最强，溶磷量可达201.51 mg/L。在试验中选择的6种碳源中，该菌株解磷效果按照从高到低排列为葡萄糖>果糖>蔗糖>麦芽糖>可溶性淀粉>乳糖。菌体生长量变化趋势与溶磷量相似，葡萄糖为唯一碳源时解磷菌的生长量显著高于其他碳源。综合溶磷量和菌体生长量可以看出，葡萄糖为碳源时菌株6-Y-09溶磷能力最强。另外，各处理培养7 d后发酵液的pH值与初始pH值变化不明显，且各处理间的pH值差异也不显著，可能是有机磷细菌主要是通过分泌胞外植酸酶、核酸酶和磷酸酶等非有机酸类物质将有机酸分解[12]，而这些物质对培养液的pH值改变不大。
2.2 不同氮源对菌株6-Y-09溶磷能力的影响
由表2可知，不同氮源显著影响解磷菌的溶磷能力，其中以尿素为唯一氮源时，菌株6-Y-09的溶磷量达到最高（215.43 mg/L），同时发酵液中菌株6-Y-09的生长量也达到最大。可能是不同氮源影响了菌株6-Y-09的代谢途径，从而有效地对其分泌的次生代谢产物组分进行改变，最终表现出不同的解磷能力。与碳源结果相同，各处理培养7 d后发酵液的pH值与初始pH值变化不明显，且各处理间的pH值差异也不显著。
2.3 不同C/N对菌株6-Y-09溶磷能力的影响
由表3可知，不同C/N显著影响解磷菌的溶磷能力，当C/N为20∶1时，其溶磷量最高，达到119.43 mg/L，是C/N为40∶1处理的1.42倍，C/N为8∶1处理的1.87倍，但是从培养介质的pH值的变化情况来看，3个处理之间pH值没有显著的差异。当C/N为20∶1时，菌体的生长量为最多，8∶1时为最少。
2.4 不同pH值对菌株6-Y-09溶磷能力的影响
由表4可知，不同pH值显著影响菌株6-Y-09的溶磷能力，其中pH值为7.0时，溶磷量达到最大（195.93 mg/L），pH值为7.5时次之（192.78 mg/L）。pH值为7.0、7.5时菌株生长量显著大于其他处理，综合溶磷量及菌株生长量可以看出，菌株6-Y-09最适宜的pH值为7.0～7.5。此外，各处理发酵培养后的pH值与初始pH值相比，变化幅度均不明显。
2.5 不同温度对菌株6-Y-09溶磷能力的影响
由表5可知，不同温度显著影响菌株6-Y-09的溶磷能力，当处理温度为28 ℃时，其溶磷量达到最大（199.47 mg/L），温度为30 ℃ 时次之（192.78 mg/L），菌株生长量也达到最高（分别为6.7×1010、4.1×1010 cfu/mL），说明菌株6-Y-09最适温度为28～30 ℃。此外，与以上因素处理结果相同，各处理培养7 d后发酵液的pH值与初始pH值变化幅度不明显。
3 结论与讨论
解磷微生物的解磷作用并不是一成不变的，随着外界环境或是营养物质的变化，会改变解磷菌的生长代谢途径，甚至影响解磷菌的生长和繁殖，从而导致解磷效果的不稳定。有关研究表明，溶磷能力的大小主要是由菌株的特性所决定的，在不同的条件下，菌株的解磷能力有很大差异。而且菌体的生长量与溶磷量间也并不是总呈正相关关系，有时有机酸的作用更大[13]。虞伟斌等[11]报道同一株磷细菌在不同的碳氮源或C/N时表现的解磷能力并不一致，解磷菌表现出的解磷能力与其所处环境有很大关系。不同的碳源会改变菌株分泌有机酸种类，Patel等[14]发现Citrobacter sp. DHRSS解磷菌以蔗糖和果糖为碳源时主要分泌乙酸，当改以葡萄糖和麦芽糖为碳源时主要分泌葡萄糖酸。另外，刘晓芳等[15]报道，2株黑曲霉ML2、ML4随着C/N的增加，菌体生长量随之增大，菌株的溶磷量先是随C/N的升高而升高，后又降低，在C/N为35∶1时达到最大。
本研究发现菌株6-Y-09在碳源为葡萄糖、氮源为尿素、C/N为20∶1的培养条件下更适合发挥其解磷作用，说明不同的菌株都有自身最适合的培养条件。此外，经研究发现，各处理经发酵7 d后，各处理培养7 d后发酵液的pH值与初始pH值变化不明显，这有可能是有菌株6-Y-09主要是通过分泌胞外植酸酶、核酸酶和磷酸酶等非有机酸类物质将有机酸分解[12]，而这些物质对培养液的pH值改变不大。但是，由于微生物溶磷机制的复杂性，菌株6-Y-09的溶磷机制还有待进一步研究。
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