茶树新品系“1005”儿茶素含量与结构基因关联分析

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摘要：以茶树新品系“1005”新梢3个不同发育时期的芽头、二叶、四叶为试验材料，用高效液相色谱检测儿茶素含量，高通量测序技术分析结构基因表达差异，应用数据统计分析其儿茶素含量与结构基因表达的关联性。结果表明，茶树新品系“1005”的儿茶素总量与CHI、F3′5′H、ANR、aroG等结构基因的关联系数分别为0.339 74、0.716 47、0.467 89、-0.032 61；简单儿茶素含量与CHI、F3′5′H、ANR、aroG等结构基因的关联系数分别为0.568 99、0.498 87、0.704 26、0.491 51；酯型儿茶素含量与CHI、F3′5′H、ANR、aroG等结构基因的关联系数分别为0.160 66、0.598 08、0.250 61、-0.217 38。试验为研究茶树儿茶素生物合成过程的关键结构基因提供了理论基础。

关键词：茶树；儿茶素；结构基因；关联性

中图分类号：S571.1：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4088-04

Correlation between Content of Catechins and Structure Genes of Tea Plant

New Strain “1005”

GE Guo-ping， ZHANG Shao-xiong， LIN Jin-ke

（College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China）

Abstract： Using bud， the 2nd leaf and 4th leaf from tea plant new strain “1005” as materials， content of catechins was detected by HPLC. Differential expression of structure gene were analyzed with high-throughput sequencing. The correlation between content of catechins and structural gene expression in tea plant new strain “1005” was analyzed. Results showed that correlation coefficient of content of total catechins and structural genes CHI， F3'5'H， ANR and aroG were 0.339 74， 0.716 47， 0.467 89， -0.032 61， respectively. Correlation coefficient of content of simple catechins and structural genes CHI， F3'5'H， ANR and aroG were 0.568 99， 0.498 87， 0.704 26， and 0.491 51， respectively. Correlation coefficient of content of ester catechins and structural genes CHI， F3'5'H， ANR and aroG were 0.160 66， 0.598 08， 0.250 61，-0.217 38， respectively. A theoretical basis was provided for the key structural genes of catechins biosynthesis.

Key words： tea plant； catechins； structural gene； correlation

茶树新品系“1005”属于灌木型中叶种茶树，树姿半披张，分枝较密，叶色黄绿，叶片长椭圆形，叶片茸毛少且不显，叶齿浅钝，叶缘微波，是由福建农林大学农产品品质研究所选育出来的高表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）含量的茶树新品系。据相关报道，茶树EGCG含量高于10%则可视为高EGCG茶树种[1]。试验所用的茶树新品系“1005”的秋季新稍（一芽二叶）EGCG含量高于10%。

茶叶中的儿茶素属于黄烷醇类化合物，在茶叶中的含量为12%～24%（干重）[2]，是茶汤滋味和收敛性的主要根源[3]。儿茶素分为酯型儿茶素和非酯型儿茶素，酯型儿茶素亦称为“复杂儿茶素”，主要包括EGCG、GCG（没食子儿茶素没食子酸酯）、ECG（表儿茶素没食子酸酯）、CG（儿茶素没食子酸酯）；非酯型儿茶素亦称为简单儿茶素，主要包括GC（没食子儿茶素）、EGC（表没食子儿茶素）、C（儿茶素）、EC（表儿茶素）[2]等。前人已确定儿茶素具有重要的保健和药理作用，如抗癌、抗氧化、抗肿瘤，降血压、降血糖、降血脂，保护肾功能、祛黄褐斑、抗抑郁等[4-9]。已研究得出儿茶素总量和组成与茶树品种特性的关系：如适制绿茶要求总儿茶素含量低，酯型儿茶素含量高的品种[10]；适制乌龙茶要求酯型儿茶素与简单儿茶素的比值在1.5～2.0为好[11]；儿茶素总量与红碎茶品质呈极显著的正相关[12]，儿茶素品质指数[（L-EGCG+L-EGC）×100/L-EGC]与绿茶品质呈正相关[13]。已探明改善儿茶素含量的人工栽培措施：如遮阳网及黄红薄膜的利用、外源诱导物WAT的喷施、辐射、有机肥料配合磷钾肥的使用等[14-20]。已克隆得到茶树黄烷醇类化合物的生物合成途径的一些结构基因：如茶树的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）、查尔酮合成酶（CHS）、二氢黄酮醇还原酶（DFR）、花青素还原酶（ANR）、花青素合成酶（ANS）、黄烷酮3-羟基化酶（F3H）等，都已经克隆得到其全长cDNA序列，做了原核表达分析[21-23]。其中，CHS是黄烷醇类合成途径中研究的最清楚的一个酶，在GenBank上已登录的有三条（登录号D26593.1、D26594.1和D26595.1），但是茶树中实际的CHS基因数目可能更多。但对茶树而言，儿茶素合成的分子机制了解仍然较为模糊，除了PAL、CHS以外，对其他涉及酶类的生化性质、生理作用及其调控机制了解很少，从基因工程、代谢工程角度的研究更是缺乏基础[24]，比如虽然茶树的ANR基因已有报道，但对其酶学特性、功能的验证、酶蛋白细胞定位等尚不清晰。简言之，儿茶素作为茶叶中重要且有益的活性成分，对其进行研究具有重要的现实意义。

试验以2012年秋季茶树新品系“1005”新梢的3个不同发育时期的芽头、二叶、四叶为试验材料，用高效液相色谱检测儿茶素含量，用高通量测序法分析儿茶素生物合成过程的结构基因表达差异，应用数据统计分析其儿茶素含量与结构基因表达的关联性，以期为研究茶树的儿茶素生物合成过程的关键结构基因提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及预处理 2012年9月下旬采自福建农林大学农产品品质研究所的茶树新品系“1005”的芽头、二叶、四叶，分别标记为E0、E2、E4，先经液氮瞬时冷冻固样，之后于-80 ℃保存备用。

1.1.2 仪器 电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A型）；电子天平（Sartorius BSA124S-CW）；数显恒温水浴锅（XMTD-204）；离心机（Sigma3k15）；HPLC仪（Waters1525泵、Waters2487紫外检测器；色谱柱（Agilent Eclipse XDB-Pheny 4.6 mm×250 mm，2.5 μm）。

1.2 方法

1.2.1 儿茶素含量分析 儿茶素类检测按照GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》进行。

1.2.2 茶树RNA提取与质量检测 采用Novogene公司的Trizol总RNA提取试剂盒，参照说明书的要求提取总RNA，并用RNA-free的DNaseI（ Promega， Madision，WI， USA ）进行DNA消化，以保证总RNA中不含有DNA污染。

1.2.3 数据处理与分析 转录组测序与结构基因RPKM值计算委托北京诺禾致源公司完成。运用Excel 2003数据统计软件，根据各个基因在样品中的RPKM值与相应的儿茶素含量进行关联性分析；运用DPS数据处理软件，采用Duncan’s新复极差法进行儿茶素含量显著性分析。

2 结果与分析

2.1 茶树RNA质量检测

经检测，提取的3个RNA样品的OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.2之间，RIN值在6.6～8.7之间，结果均符合转录组测序对RNA的质量要求。检测结果如图1所示。

2.2 基因表达量

根据转录组测序原理，测序过程是统计转录组中各转录本打断后随机采样的统计过程[25]。因此，当某个基因表达水平较高或长度较长时，该基因的reads条数就多；另外，测序深度也与基因的reads条数有关。因此，需要对reads数据进行归一化来估计基因表达水平。在转录组测序技术中，RPKM（Reads Per Kilo bases per Million mapped Reads）是每百万reads中来自某一基因每千碱基长度的reads数目，RPKM同时考虑了测序深度和基因长度对reads计数的影响，是目前最为常用的基因表达水平估算方法[26]，其计算公式为：

RPKM=■×109。其中RPKM 为特定生物样品中某一基因的表达水平；R为匹配到该基因上的原始 reads数目；T 为该样品测序得到的reads总数；L为该基因的长度（bp）。当然，这里的reads必须是能够匹配到基因组上的高质量reads。茶树新品系“1005”新梢的3个不同发育时期（芽头、二叶、四叶）RPKM分布情况如表1所示。

通过分析转录组测序得到的Unigene的RPKM分布情况，发现整体上3个样品的RPKM在各个区间分布密度区别不大，且均以中低表达丰度的Unigene为主。RPKM在0.00～0.10之间的极低表达丰度的Unigene占很大一大部分，达到40%左右，RPKM在0.30～3.57之间的中等表达水平的Unigene 在20%以上，RPKM大于60的Unigene在1.3%左右。

2.3 茶树新品系“1005”的儿茶素含量与结构基因关联分析

经3次HPLC分析检测取平均值，茶树新品系“1005”的儿茶素含量如表2所示。表2数据显示，茶树新品系“1005”的3个不同发育时期的儿茶素含量差异显著。

根据高通量测序RNA-Seq结果，茶树新品系“1005”的3个不同发育时期共有7个不同的儿茶素合成相关基因差异表达，分别为4CL（4-coumaroyl-CoA ligase）、CHI（chalcone isomerase）、F3′5′H（flavonoid 3′，5′-hydroxylase）、DFR（dihydroflavonol 4-reductase）、ANR（anthocyanidin reductase）、aroG（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase）、aroD（3-dehydroquinic acid dehydratase）等。数据统计软件表明，各基因与儿茶素关联性结果如表3所示。

从表3可以看出，茶树新品系“1005”的儿茶素总量与CHI、F3′5′H、ANR、aroG等结构基因的关联系数分别为0.339 74、0.716 47、0.467 89、-0.032 61；简单儿茶素含量与CHI、F3′5′H、ANR、aroG等结构基因的关联系数分别为0.568 99、0.498 87、0.704 26、0.491 51；酯型儿茶素含量与CHI、F3′5′H、ANR、aroG等结构基因的关联系数分别为0.160 66、0.598 08、0.250 61、-0.217 38（与多基因家族ANR结构基因的关联系数取3个Unigene的平均值以便整体统计）。经分析发现，基因F3′5′H与高EGCG含量的茶树新品系“1005”的儿茶素总量、酯型儿茶素含量的关联系数分别为0.716 47、0.598 08，它们在对应类中的关联系数的绝对值由大到小排名均位列第2，排名都是次于基因4CL，但不是位于同一个控制4CL的基因之后，另外4CL基因的关联系数有正负有待探讨。相反，基因F3′5′H与高EGCG含量的茶树新品系“1005”的简单儿茶素含量的关联系数0.498 87在对应类中绝对值由大到小排名则较靠后，这将为推测基因F3′5′H（comp153174_c0）能作为儿茶素生物合成过程的关键结构基因提供可能的理论依据和指导方向。另外，ANR与简单儿茶素的关联系数最大为0.704 26，这与前人研究得出的非酯型儿茶素C、GC、EC和EGC合成直接相关的酶是LAR和ANR相一致[27]。

3 小结

同其他许多木本植物一样，目前关于茶树分子生物学方面的研究还相对薄弱，遗传背景了解较少，如目前茶树中已登录的儿茶素生物合成相关基因不多，且大多数是单基因；加之传统测序手段的固有缺陷，导致无法对茶树重要的次生代谢产物的分子机制进行深入研究和探讨，借助高通量平台的转录组测序技术为从分子方面研究茶树提供了某些便捷的途径。试验研究了4CL、CHI、F3′5′H、DFR、ANR、aroG、aroD等7个结构基因在茶树新品系“1005”的3个不同发育时期发生显著差异表达（差异倍数至少在1.3倍以上）。其中，4CL、DFR、aroD等3个多基因家族结构基因表达差异与儿茶素含量的关联系数有正相关或负相关，该问题有待进一步研究。试验根据关联分析推测基因F3′5′H（comp153174_c0）能作为儿茶素生物合成过程的关键结构基因提拱了可能的理论依据，这与马春雷[28]对不同茶树品种间儿茶素合成相关酶研究表明LAR和DFR是儿茶素合成的重要酶略有出入，该问题也有待进一步研究。

由于儿茶素的生物合成非常复杂，它不仅受一系列结构基因的控制，此外一些转录因子，如MYB类、bHLH类也发挥一定的作用。而基因PAL、CHS、CHI、DFR、aroG、LAR、ANR、ANS、4CL、F3′5′H等不仅影响儿茶素的合成，同时也影响花青素、木质素、黄酮醇及原花青素的合成。因此，分析发现7个结构基因与儿茶素的关联系数有的相对较小，表明有的可能与儿茶素的生物合成关联不大；但是通过关联分析将为后续结合儿茶素含量变化趋势及基因功能加以注释，为研究茶树的儿茶素生物合成过程的关键结构基因提供理论依据。

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