PCR技术在动物检疫中的新应用
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中图分类号：S188 文献标识码：B 文章编号：1007-273X(2008)07-0014-02
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，pcr)技术自1985年建立以来，经过了20余年的发展，应用日益广泛，体现了其强大的生命力。对病原体核酸的扩增被广泛应用于动物病原体的检测中。并在动物检疫中发挥着越来越大的作用。
PCR作为现代分子生物学的核心技术，在科学研究和临床诊断中都发挥了巨大的作用。这项技术经过不断的开发和改进，已经应用到动物检疫领域的各个环节。给我们的工作带来极大的便利。在PCR技术基础上衍生出很多新技术，在动物检疫中逐渐被采用的PCR技术主要有多重PCR和荧光PCR技术。
1 多重PCR技术
多重PCR最先被用于疾病的诊断是1988年Chamber-lain将其应用于人的杜氏肌营养不良(DMD)基因外显子的检测。随后，在人医上被广泛应用于各种疾病的诊断。1993年，WirzB将其用于猪瘟病毒和其他瘟病毒属的鉴别诊断，从而拉开了在兽医诊断领域应用多重PCR的序幕。随后该技术不断的被报道用于动物细菌性、病毒性、寄生虫性疾病等的诊断，被公认为是一种方便、快速、敏感、特异的诊断方法。
1.1 方法的特点
多重PCR是在常规PCR的基础上发展而来的。因此，其基本原理和常规PCR没有差别，所不同的是多重PCR技术是在同一个体系中加入多对引物，同时检测多个目标序列的存在。理论上讲，引物条数可以不加限制，但是实际操作中，由于随着引物条数的增加，引物之间的相互作用变得更为复杂，二聚体和错配的几率大大增加，优化各种条件变得更为困难，从而影响引物的扩增效果。虽然目前已有同时用9对引物扩增出相应目标片段的报道，但是实际工作中通常以使用引物不超过5对为好。在把单重PCR合并成多重PCR之前要进行不同扩增子之间引物的分析，条件进一步优化。
1.2 方法的应用
多重PCR在动物中使用相当普遍，主要用于病原体强弱毒株的区分、鉴别诊断和分型鉴定等。
1.2.1 毒力强弱分析 新城疫是家禽的一种烈性传染病。但有时却表现出慢性疾病的特点，无典型的临床症状。因而需要一种不仅能够诊断该病而且能快速区别病原是强毒株还是弱毒株的方法。早期的研究多集中在RT-PCR扩增结合序列分析的方法上，虽然也不失为鉴别诊断新城疫的准确可靠的方法，但测序比较烦琐，成本也较高，难以进行大批量操作。20世纪80年代末到90年代初。新城疫基因组结构的阐明为建立这种鉴别诊断方法提供了可能。通过对大量不同毒力新城疫基因核苷酸序列的分析，根据强弱毒株FO裂解位点的序列差异设计合成了3对引物，建立了快速诊断新城疫并能鉴别其强弱毒株的反转录一聚合酶链式反应，该方法具有快速特异和操作简便的特点，不仅适用于对鸡胚毒的检测，而且适用于对病鸡组织匀浆液的检测，是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。
1.2.2 鉴别诊断 鸡传染性支气管炎(IB)、禽流感(AI)、鸡传染性喉气管炎(ILT)、鸡新城疫(ND)是严重危害鸡群的4种主要呼吸道传染病。这些传染病感染不同年龄鸡群，具有较高的发病率和死亡率，曾给养鸡业造成沉痛的打击和巨大的经济损失。由于这些病原引起鸡表现相似的临床症状和病理剖解变化，用传统的临床诊断方法难以区别，并且这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐费时。根据4种传染病的各自保守序列设计4重PCR，由扩增后得到的特异性片段的大小来诊断是哪种疾病引起。
猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、典型猪瘟病毒(CS，FV)、圆环病毒(PCV)、细小病毒(PPV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)和猪伪狂犬病毒(PRV)是引起猪繁殖障碍的常见病原，在临床上常呈混合感染。多重PCR技术用于PRRSV、CSFV、PCV、PPV和JEV感染的诊断能同时检测5种病毒的感染。
1.2.3 动物病原体的分型鉴定 猪链球菌分为35个荚膜血清型，1、2、1/2、7、9和14型从发病猪和死猪体内最常分离到的血清型。其中以2型致病性和毒力最强，其他血清型有的毒力偏弱、危害较少。有的甚至在临床上并不导致疾病。因此，在实践中。需要将2型猪链球菌与其他型分开。2型和1/2型猪链球菌的毒力基因cps基因中有几段是其他血清型猪链球菌没有的(cps2F、cps2H、cps2I和cps2J)。建立同时检测这些独有基因和共有基因的多重PCR就可以将2型、1/2型猪链球菌与其他型分开。
流感病毒的基因组极易发生变异，其中以编码血凝素(HA)的基因的突变率最高，其次为神经氨酸酶(NA)基因。迄今已知有16种HA和10种NA，不同的HA和NA之间可能发生不同形式的随机组合，从而构成许许多多不同亚型。据报道，现已发现的流感病毒亚型至少有80多种，其中绝大多数属非致病性或低致病性，高致病性亚型主要是含H5和H7的毒株，特别是H5亚型禽流感病毒可以导致人的死亡，具有重要的公共安全意义。鉴别诊断H5与其他亚型的多重PCR技术已经在动物检疫中广泛使用。
2 荧光PCR技术
实时荧光PCR技术于1996年由美国Applied Biosys-terns公司推出，可以分为探针法和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为准确。荧光PCR把PCR的灵敏度和特异性大大提高，灵敏度接近检测方法的极限，荧光探针增加了检测的特异性。
2.1 荧光PCR技术特点
第一是实现了实时检测。能在反应结束后得到PCR扩增动力学曲线。从而很直观地反映整个PCR过程的动态变化。检测点以Ct值为标准，当荧光信号达到Ct值时，PCR反应体系内各种成分均处于最佳饱和状态。受各种干扰因素的影响最少，最能反应体系中模板的起始含量。第二是具有良好的稳定性和重复性，Gerard报道用荧光定量PCR方法，重复40次反应。其Ct值的变异系数为1，6％。如使用电泳后凝胶扫描定量。其变异系数高达31％，两者相差19倍多。第三是用荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，能获得较高的检测精度，因为荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度。第四是在荧光定量PCR过程中，除加样一次开盖外，其余过程在闭管情况下进行，反应结束后在电脑上显示，不需要后期的凝胶电泳，有效杜绝了产物污染造成的假阳性问题，同时避免了溴化乙锭或同位素对人体及环境的危害。第五是操作简单、快速，工作效率高。整个过程由电脑控制，从加样到结果出来只需要2h左右，内置9600型PCR扩增仪，可同步完成96个样品的扩增及定量，适宜于大批样品的 检测处理，有利于操作规程的标准化。
荧光PCR也可以设计多重，即多重荧光PCR，通过不同的探针标记不同的发光集团实行荧光分类从而实行多重检测的目的。目前，市面上流行的荧光PCR仪中，ABI公司的7500最多可以检测5个通道的荧光，也就是说最多可以进行5重荧光PCR检测。
2.2 荧光PCR的应用
荧光PCR由于具备更多的优势，因此在动物检疫中受到更多的青睐。除了需要对PCR产物进行下游处理的试验外，几乎所有PCR进行的工作都可以由荧光PCR来完成。进出口检验中对方法的灵敏度要求很高，要求有微量的病原体就能够检出，荧光PCR正好可以发挥它的优势。
2.2.1 动物病毒检测 荧光定量PCR技术在动物病毒性疾病的诊断及定量检测中已经被广大临床诊断实验室所接受，现在国内外已经有很多实验室都建立了快速检测病毒的方法，病毒分离结果一致。英国科学家Schweiger报道应用荧光PCR对咽喉拭子等呼吸道标本中禽流感病毒进行型别、亚型鉴定，结果表明敏感性高于常规的病毒分离、培养方法。深圳四基生物工程公司与北京出入境检验检疫局研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒。基于该技术的检测试剂在全国各个出入境检测实验室得到了广泛使用，为有效控制禽流感疫情在国际间的传播起到显著的作用。
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMDV感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病。患病动物的口、舌、唇、蹄和等部位出现水泡，破溃并形成烂斑。该病一经检出，相应的家畜及畜产品就禁止运输和出口，造成巨大的经济和政治影响。FMD的暴发和流行除了对畜牧业生产造成巨大的损失外，对人民生活所需要的奶品、肉品供应也造成很大的影响，故各国对FMD的检验检疫非常严格。FMD检测可以通过病毒分离、补体结合实验(CFF)、病毒中和实验(VNT)和动物接种实验等方法。然而，这些方法费时费力。特异性和灵敏度也无法满足需要。急需一种快速、准确的检测技术。在我们国家，检验检疫系统中首先建立了口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测技术，之后形成检验检疫行业标准，成为进出口动物及动物产品的重要检疫规范。
此外，荧光PCR新城疫病毒和猪蓝耳病病毒的检测方法已经建立。部分口岸实验室也在应用。
2.2.2 动物细菌病检测 2005年6月，四川省资阳、内江相继暴发猪链球菌病，截止到8月20日，累计报告人感染猪链球菌病病例204例。死亡38例。这些事件不但造成了人员伤亡，而且引发了全国性的食品安全恐慌，造成巨大的经济损失。全国多个动物检疫实验室建立了荧光PCR检测2型猪链球菌的检测技术，其中珠海出入境检验检疫局建立的多重荧光PCR检测技术同时检测2型猪链球菌的荚膜多糖基因cps2I和溶菌素释放蛋白基因MRP，对于控制疫情、减少扩散起到积极作用。
炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的一种共患病，炭疽芽孢杆菌可通过消化道、呼吸道及皮肤接触感染人和动物，具有高度致病性，特定条件下炭疽芽孢杆菌可以形成芽孢，抵抗力强，在外界环境中可存活数十年。2002年美国出现的炭疽生物恐怖事件更是给人们敲响了警钟，快速准确的检测技术对于炭疽的监测和控制具有重大意义。张玲建立了SYBR GREEN I染料法荧光PCR技术，实现了炭疽杆菌的快速检测。2005年陈苏红等针对炭疽杆菌的pX01和pX02质粒建立了Taqman探针荧光PCR检测技术，使检测的特异性和灵敏度大大提高。根据实验数据，他们的研究都取得了不错的效果，有望在实践中，特别是进出口检验中发挥越来越大的作用。
另外，大肠杆菌0157、霍乱沙门氏菌也都建立了相应的荧光PCR检测技术，对保障进出口动物健康和食品安全具有重要作用。
3 小结
新技术的出现往往给生产和应用带来巨大的便利，PCR技术作为现代分子生物学的核心技术，已经在实践中发挥出无法替代的作用。然而，所有的检测方法都有自身的不足，基于核酸扩增的PCR技术也不例外。RNA病毒的快速变异使我们无法知道下一个突变发生在什么地方，如果新的毒株在我们的检测区域发生突变，就可能出现漏检现象。特别是荧光PCR技术，如果在探针位置出现不匹配，检测很可能出现假阴性。我们曾经在实验中使用过10多套引物、探针检测口蹄疫病毒，并且在一些位点使用了兼并碱基，然而。没有一套可以从理论上兼顾到所有的毒株。也就是说，没有一套引物可以成功扩增迄今为止出现的所有口蹄疫病毒，只能在尽可能保守的区域设计引物、探针，进而随着病毒变异不断尝试新的检测区域。特别是型特异性引物、探针的设计，必须是在型内高度保守、型间易于区分的区域，给研究人员带来了一定的挑战。实际上，一些研究者在进行单个病原体的检测时已经开始使用多重PCR或者多重荧光PCR，只要有一个特异性片段出现就可以判断结果阳性。生产实践中的需要使PCR技术已经得到了很大的改进和发展，相信随着新问题的出现，新的技术方法和原有方法的新应用会不断出现。