毛葡萄叶水提物对血栓形成和血黏度的影响

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作者：荆春霞，周?，杨亚安，王?F晨，王晓春，吴开云

【摘要】 目的探讨毛葡萄叶水提物对血栓形成和血黏度影响并研究其主要作用机理。方法用大鼠动静脉旁路血栓形成模型观察血栓的形成 ,测定血栓湿重及干重；放射免疫法测定txb2和6-keto-pgf1α水平；用血瘀血液流变学模型测定全血黏度。结果毛葡萄叶水提物可剂量依赖性抑制大鼠血栓形成,其血栓干重及湿重与对照组相比均显著降低(p<0.05或p<0.01 )，有降低血浆txb2和升高6-keto-pgf1α水平，对血液黏度也有明显降低作用。结论毛葡萄叶水提物有明显抗血栓形成和降低血黏度作用，其机制可能与影响血浆txb2和6-keto-pgf1α含量水平有关。

【关键词】 毛葡萄叶水提物; 血栓; 模型; 大鼠; 血栓素b2; 前列环素; 血粘度

临床上由血栓引起的心、脑血管病发病率逐年增加，寻找有效的抗血栓药是这一领域的研究热点。近来研究表明从中草药中寻找具有抗血栓作用的药物具有良好的发展前景。毛葡萄vitis quinquangularis rehd，为木质藤本植物，味酸、微苦，性平,根皮和叶可作药用，有调经活血、舒筋活络作用，外用治跌打损伤、筋骨疼痛，外伤出血等［1］。现有的文献资料中并未发现毛葡萄及其提取物具有抗血栓的作用，本实验采用被广泛用于抗血栓药物的研究动静脉旁路模型和急性血瘀血流变学模型［2，3］，首次发现毛葡萄叶水提物有明显抗血栓形成和降低全血血黏度的作用（已申请发明专利，申请号：200810025205.x），并对其主要作用机制进行了探讨。现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 动物sd大鼠,各半， 体质量(250±20)g，苏州大学实验动物中心供应，spf级,实验动物生产许可证号:xcyk(苏)2002-0008,实验动物使用许可证号:syxk(苏)2002-0037。

1.2 仪器

电子精密天平（上海奥豪斯公司）；dk-600型电热恒温水槽；tdl80-2b型台式离心机（上海安亭科学仪器制造厂）；leicarm2126rt石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司）；olympus cx31显微镜（日本olympus公司） ；tyxn-96多功能智能血液凝聚仪 ；γ放免计数仪 fj-2003/50a。

1.3 药品及试剂

毛葡萄叶水提物制备：取500 g干毛葡萄叶（来源：江西，苏州大学生药研究所鉴定），浸泡于水中，加热提取3次，45 min/次，合并提取液用蒸发浓缩至1 000 ml，再用终浓度为50%乙醇沉去杂质，过滤后用旋转蒸发除去乙醇，浓缩后的溶液经冷冻干燥后得到粉末状提取物150 g（批号为：kxsh-t1），主要成分为黄酮（25% ），还含有酚类、氨基酸等。实验时配成30%(约含生药1g·ml-1)；血栓素b2(thromboxane b2,txb2)和6-酮-前列腺素f1α(6-keto-prostaglandinf1α, 6-keto-pgf1α)放射免疫测定试剂盒购自苏州大学江苏省血液学研究所，复方丹参滴丸(compound dan shen dripping pills, cddp ),天津天士力制药股份有限公司产品，规格为每粒27mg，批号：20060802，批准文号：国药准字z10950111。 盐酸肾上腺素注射液 1mg/ml上海禾丰制药有限公司 批号 070902,其它试剂均为市售国产分析纯。

2 方法

2.1 动静脉旁路血栓模型与给药分组

sd大鼠50只，各半， 体质量(250±20)g，分为对照组，中药(vre)大、中、小剂量组和丹参(cddp)组各10只，各组动物分养。大剂量中药组每天灌中药4 ml（4g·kg-1）；中剂量中药组每天灌中药4 ml（2g·kg-1）；小剂量中药组每天灌中药4 ml（1 g·kg-1）；对照组灌生理盐水4 ml每只；丹参组（70 mg· kg-1）。连续灌胃9 d；第10天于灌胃1 h后按血栓模型过程行动静脉旁路术。

2.2 动静脉旁路模型的建立

3.6%水合氯醛1ml·100 g-1麻醉后固定于解剖台上，准备好一根塑料管（d=0.3 mm）两端拉细，管中放置一根6 cm的4号线，并灌满50 u·ml-1肝素。分离右侧的颈总动脉和左侧的颈外静脉。静脉端先结扎静脉远心端，剪开一个小口，将管向近心端插入并结扎固定。动脉端先用血管夹夹住近心端，剪开一个小口，将管向近心端插入并结扎固定。然后放开血管夹，保证血流通畅，计时20 min后将线取出［2］。分别称量栓线的湿重和干重，将形成的血栓固定、包埋，切片、he染色，观察血栓成分。并腹主动脉取血，离心2 000 r/min，取血清，-20℃保存待测txb2和6-keto-pgf1α含量。

2.3 血栓重量测定取下栓线后在滤纸上吸干后,用电子分析天平测定其重量。然后置60 ℃烘箱烘干至恒重称其重量为干重。

2.4 血栓形态学观察

各组取血栓形成栓线作石蜡切片,he染色后光镜下观察血栓。

2.5 血栓素b2(txb2)、6-keto-pgf1α检测

用放射免疫法测定血清中的txb2和6-keto-pgf1α的含量并计算出txb2与6-keto-pgf1α比值。

2.6 血淤血流变学模型与给药分组

sd大鼠40只，大鼠,各半， 体质量(250±20) g，将大鼠分为4组，每组10只，即对照组、血瘀模型组、丹参组、中药模型组，各组动物分养。对照组：每天生理盐水灌胃5 ml/只，连续7 d。第7天停食，次晨取血检测。② 造模组: 每日丹参组(70 mg·kg-1)，中药中剂量组(2 g·kg-1) 灌胃，分灌不同药物连续7d，于第7天皮下注射肾上腺素0.08 ml·100 g-1，共2次，2次相隔4 h，于第1次注射后2 h，将大鼠浸入冰水中5 min，处置后停食，次晨取血检测［4，5］。

2.7 全血血粘度的检测

腹主动脉抽血5 ml，edta-2na抗凝，tyxn-96多功能智能血液凝聚仪测定全血高切，中切，低切血粘度。

2.8 统计学处理

所得数据用±s表示，显著性检验采用spss 10.0统计软件进行one-way anova分析并以t检验，组间差异以α<0.05为显著性标准。

3　结果

3. 1 对血栓形成的影响

血栓he染色显示，对照组线栓形成的血栓,血栓体是以血小板、红细胞和少量白细胞的混合型血栓，其中血小板形成的结构最明显（见图 1a）；给药组中的大、中、小剂量组血栓形成明显小于对照组，并且血栓体较疏松,血栓体中血小板形成的结构明显小于对照组（见图1b～d）。丹参组与对照组对比，血栓有不同程度的减小，但与药物组比较，其血栓明显大于药物组。血栓重量测定结果也与形态学观察一致。药物组有明显降低血栓重量(p<0.05,p<0.01 ,p<0.01），见表1，其中中药中剂量组作用最显著。表1 各组大鼠血栓形成重量比较（略）

3.2 对txb2和6-keto-pgf1α水平的影响

对照组血浆txb2含量升高(p<0.01),而6-keto-pgf1α含量降低(p<0.01)，txb2/6-keto-pgf1α数值增大（p<0.01）。与对照组比较，毛葡萄小、中、大剂量组能明显降低血浆txb2含量(p<0.05，p<0.01) ,而升高6-keto-pgf1α含量(p<0.05，p<0.01)，txb2/6-keto-pgf1α数值降低有显著性差异（均p<0.01）。丹参组与毛葡萄中、高剂量组的作用相似（p<0.05、p<0.01）。见表2。表2 txb2和6-keto-pgf1α含量测定结果（略）

3.3 对全血血粘度的影响模型组，中剂量组与丹参组血粘度高切，中切，低切都明显高于对照组。但中剂量组与丹参组都降低了3种切变率状态下的血粘度（p<0.01，p<0.05）。见表3。表3 各组血粘度检测结果（略）

4　讨论

血栓形成是一个复杂的过程，血小板在血栓形成过程中是一重要因子。当血管受损伤时,血小板在病变部位蓄积 ,导致血栓形成闭塞血管,引起缺血性组织损伤。血栓形成是许多心脑血管疾病的主要发病原因。阻止血栓形成是预防心脑血管疾病的关键［5］。本文采用动静脉旁路模型观察了毛葡萄叶水提物3种剂量（1，2，4 g·kg-1）对血栓形成的影响及作用机制。从实验结果可以看出中药（大、中、小剂量）组都有明显抗血栓形成作用，给药组的血栓干、湿重与对照组相比明显减小。血栓的he染色也可以看出各组均是混合型血栓（红细胞、血小板和白细胞组成），但对照组血栓体是以血小板形成的结构最明显，给药大、中、小剂量组血栓形成明显小于模型组且栓体较疏松,血栓体中血小板形成的结构明显小于对照组，特别中剂量药物组血小板形成的结构明显减少。

血栓素a2(txa2)主要在血小板生成，能引起微血管收缩、血小板凝聚、血栓形成和止血。而前列环素(pgi2)主要在血管壁生成，作用与txa2相反呈强力扩张微血管，抗血小板凝聚，防止血栓形成，正常生理状态下,完整无损的血管内皮细胞具有抑制血小板在其表面粘附聚集和活化、抗血栓功能,在循环血液中txa2 和pgi2 的浓度处于相对平衡状态,二者在体内形成一种精巧的分子调节机制,对血管舒缩,血小板聚集及血栓形成起着重要的调节作用。由于二者的极不稳定，txa2半衰期为30 s, pgi2的半衰期也仅有3 min，所以二者分泌后便迅速稳定代谢为txb2 和6-keto-pgf1a ［6］，因此通常通过测定txb2和6-keto-pgf1a 的变化来反映txa2和pgi2的变化情况，从本实验结果表明毛葡萄小、中、大剂量组能明显降低血浆txb2含量,而升高6-keto-pgf1α含量，其中中剂量效果最好；与阳性药物丹参组对照其与中剂量组也好于丹参组。说明毛葡萄叶提取液的抗血栓作用与txb2和6-keto-pgf1α水平相关。

中医理论认为心脑血管疾病是“暴怒”所致肝阳上亢，突遇外寒之邪侵袭可引发寒凝气滞，致使血行不畅、脉络不通最终造成血淤［3，6，7］。现代医学认为血黏度反映的是血液在流动时内摩擦力的大小，内摩擦力越大，血液的淤度就越大，它在血管中流动的阻力就越大，血液流动的速度也就越慢，最终导致组织缺血缺氧，如血管受损更易形成血栓［8，9］。许多研究证明血淤度增高是由于红细胞的变形能力、刚性及红细胞的聚集能力的改变，影响微循环及组织、器官的血流量，以导致疾病的发生。本实验在急性血淤模型上证明毛葡萄叶水提物对血黏度有明显改善作用，给药组血黏度高切，中切，低切都明显低于对照模型组和丹参组。该模型具有血液流变性指标变化稳定，重复性好，对活血化淤中药的反应敏感等优点［4，10］。

本实验首次观察了毛葡萄叶提取物对血栓形成的影响，并初步证此药对血栓形成和降低血黏度有较好作用。毛葡萄来源广泛，其提取工艺简单，具有广阔的开发前景。本实验结果为临床上寻找良好的抗血栓药打下了一个较好基础。

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