激光透明带穿孔和激光透明带削薄对冻融小鼠卵子受精率的影响
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摘要：目的 探讨激光透明带穿孔和激光透明带削薄对玻璃化冷冻复苏后小鼠卵子受精率的影响。方法 将玻璃化冷冻复苏后的KM小鼠卵子分为4组，前3组为经透明质酸消化处理后脱去颗粒细胞的卵子，其中第1组对透明带进行激光穿孔处理，第2组对透明带进行激光削薄处理，第3组未做激光处理，而第4组为未经透明质酸消化带有颗粒细胞的卵子，同样未做激光处理。此后，在同一时间点使4组卵子与雄鼠进行体外受精，次日观察受精结果，比较各组受精率。结果 4组冻融卵子的受精率分别为52.1%（25/48），25.0%（12/48），21.3%（10/47）和17.0%（8/47）。激光透明带穿孔组的卵子受精率要显著高于其余3组，P0.05。结论 激光透明带削薄虽然对卵子造成的损伤较小，但不能有效提高受精率，而激光透明带穿孔能克服冻融造成的透明带硬化及糖蛋白结构改变等问题，显著提高冻融卵子复苏后的受精率。
关键词：激光；透明带穿孔；透明带削薄；冻融小鼠卵子；受精率
The Effects of Laser Zona Drilling and Laser Zona Pellucida Thinning on the Fertilization Rates of Mouse Vitrified-thawed Oocytes
RAO Jin-peng，QIU Feng，QIAN Xiao-hong，CAI Yi-ting
（Reproductive Medicine Center， The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310052，Zhejiang，China）
Abstract：Objective To evaluate the effects of laser zona drilling and laser zona pellucida thinning on the fertilization rates of mouse vitrified-thawed oocytes. Methods The Kunming mouse vitrified-thawed oocytes were divided into four groups： the first three groups were occytes without cumulus （DO）， but the forth group were oocytes with cumulus （COC）. Among the three DO groups， the first one were treated by laser zona drilling and the second one were treated by laser zona pellucida thinning， however， the third DO group and the COC group were not treated by laser shooting. All the oocytes with or without cumulus were fertilized in vitro at the same time， and the fertilization rate were compared on the next day. Results The fertilization rates of four groups were 52.1%（25/48），25.0%（12/48），21.3%（10/47） and 17.0%（8/47） respectively. The laser zona drilling group's rates were significantly higher than the other three groups' （P0.05）.Conclusion The methods of laser zona drilling could improve the fertilization rates of mouse vitrified-thawed oocytes. However， the laser zona pellucida thinning method seems could reduce the damage caused by laser， but could not overcome the problems of zona pellucida hardening and glycoprotein hurting during vitrification， and could not improve fertilization rates.
Key words：Laser； Zona drilling； Zona pellucida thinning； Mouse vitrified-thawed oocytes；Fertilization rates
激光破膜o助孵化（Laser assisted hatching）因具有精确，快速，便捷，安全的特点，近年来已经在辅助生殖技术（Assisted reproductive technology，ART）中广泛应用，对因胚胎冷冻造成的透明带变硬、反复着床失败患者的作用已经得到了普遍认可[1-3]。而人类卵子玻璃化冷冻技术因在生育力保存上具有重大的意义而成为近年来研究的热点。但有研究表明卵母细胞在培养过程中，不理想的体外条件会导致透明带变硬，而玻璃化冻融过程中温度的急剧变化则使得透明带硬化的现象进一步加剧，且冻融造成透明带糖蛋白损伤，使顶体反应进行困难，最终致使无法穿透透明带而受精失败[4]。本研究将激光破膜法运用到冻融小鼠卵子上，探讨激光透明带穿孔和激光透明带削薄两种方法对冻融卵子复苏后受精率的影响，为辅助生殖技术提供新的思路。
1 资料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物 6 w龄雌性昆明系小白鼠（体重25～30 g），10w龄以上成熟雄性昆明系小白鼠（体重30～35 g），购自浙江中医药大学实验动物中心（动物合格证号：SYXK（浙）2013-0184）。
1.1.2药物与试剂 尿促性腺激素（HMG）与绒毛膜促性腺激素（HCG）均购自丽珠制药厂，透明质酸酶（hyaluronidas）及配子处理液G-GAMETE 和G-IVF购自Vitrolife 公司，卵子玻璃化冻融试剂盒购自Origio公司，石蜡油购自SAGE 公司。
1.1.3耗材与设备 四孔皿购自NUNC公司，60 mm 培养皿及巴斯德管购自FALCON 公司， 装载工具CRYOTOP购自KITAZATO公司。激光破膜仪为德国CTAX，超净工作台为丹麦IVFTECH，解剖显微镜为日本OLYMPUS，培养箱为美国THEMRO，液氮罐为美国MVE。
1.2方法
1.2.1冻融前小鼠卵母细胞的准备 雌鼠腹腔注射10 IU的HMG，48 h 后再注射10 IU的HCG，15 h后将小鼠颈椎脱臼处死，用注射器于覆油的G-GAMETE配子处理液中刺破输卵管膨大部，挤出成簇卵冠丘复合物（cumulus-oocyte complexes，COCs）。置于37℃培养箱2 h后，留1/4数量的COCs待用，剩余3/4的COCs放入含透明质酸酶（hyaluronidas）的四孔皿内1 min，再移入剩余3孔的GAMETE中反复吹打至w粒细胞剥离干净，选取形态良好MII期卵母细胞于G-IVF培养液37℃、6%CO2 饱和湿度培养箱内培养30 min待用。
1.2.2卵母细胞玻璃化冷冻复苏 冷冻：采用EmbryoVitri System-Cooling 试剂盒（Origio公司），冷冻液分为BS（base solution，mHTF+12mg/mL HSA）、ES（equilibration solution，7.5%（v/v）DMSO+7.5%（v/v）EG）和VS（vitrification solution，15%（v/v）DMSO+15%（v/v）EG+0.58M 蔗糖）。冷冻前将BS，ES和VS置于室温环境下平衡30min以上，分别将卵子转入BS（1 min），ES （4～10 min）和VS（40 s）。然后将卵子以最小液滴体积2-3 个/滴转移至KITAZATO载体片上，迅速置入液氮中，封上套管，标记保存。解冻：采用EmbryoVitri System-Warming 试剂盒（Origio公司），解冻液分为WS1（warming solution 1，1M蔗糖）、WS2（warming solution 2，0.5M蔗糖）、WS3（warming solution3，0.25M 蔗糖）、WS4（warming solution1，mHTF+12mg/ml HSA）。使用前，WS1 在37℃平衡30min，其他解冻液室温平衡半小时以上。将KITAZATO载体从液氮中取出，迅速将前端载体片浸入WS1 中，轻轻摇晃时卵子脱落到WS1 中1min 后，将卵子转移至WS2 、WS3和WS4各3 min， 再转移至覆盖石蜡油的G-IVF微滴培养液（Vitrolife）中，并放入37℃、6%CO2 饱和湿度培养箱继续培养。
1.2.3激光透明带穿孔或削薄 穿孔： 使用德国CTAX激光破膜仪，将含卵子的微滴皿移至载物台上，先于低倍镜下找到待处理的卵子，再将物镜切换至专用激光物镜上，点击激光解锁键，调节激光发射能量为2～3 ms，将激光瞄准十字标定位到透明带待穿孔区域，依次点击激光发射键6～8次，直至透明带某一区域完全穿透，激光射击的位点应尽量远离极体，且保证仅作用在透明带上，不误伤卵子实体。削薄： 在激光定位到透明带待削薄区域后，同样将能量调节至2～3 ms，用激光将1/6周长的透明带削薄，而削薄透明带的厚度控制在50%～80%，且使得激光不完全穿透透明带。
1.2.4体外受精培养 冷冻复苏后的卵子（经激光处理和未经激光处理）都需在体外进行继续培养1.5 h， 与此同时，处死雄鼠，剪取输精管及附睾尾取出，放入装有G-IVF的EP管中使其上游获能1 h。选取形态正常的卵母细胞（大小正常，折光度好，且没有明显的胞浆溢出与皱缩）进行体外受精，调节加入的浓度，使得每个卵子周围有2～3万条，然后移至37℃、6%CO2 饱和湿度培养箱培养4 h后换液，继续培养过夜。
1.2.5结果统计 受精后16～24 h在倒置显微镜下观察受精和卵裂情况，受精率=2细胞及发育较快的3～4细胞的数量/总细胞数量。
1.3统计学方法 采用SPSS 19.0 统计学软件对数据进行统计分析，计数资料采用χ2 检验，P
2 结果
4组冻融卵子中，激光透明带穿孔组的复苏后受精率显著高于其余3组（P0.05），见表1。
3 讨论
卵子在冻融过程中，温度的急剧变化、细胞膜内外渗透压的改变、结晶和重结晶的发生以及高浓度渗透性和非渗透性保护剂的毒性作用均会对卵母细胞造成损伤，影响其后续的受精和发育过程[5]。而冷冻过程中，超低温环境还会引起透明带糖蛋白基质的改变，导致透明带变硬，这些都将影响顶体反应的进行及随后的受精结局[6]。
本研究中，分别冻融了一批经透明质酸处理后脱去颗粒细胞的小鼠卵子以及带有颗粒细胞的卵子，而复苏后的受精率分别只有21.3%和17.0%，要远低于常规体外受精获得的受精率60%～80%，这一结果也验证了冻融确实对卵子产生损伤，造成受精困难。而当我们用激光破膜法对卵子透明带进行激光穿孔处理后，其冻融后的受精率获得了显著的提高（P
孙玲等[8]使用激光透明带穿孔和激光透明带削薄技术对受精后第3 d的胚胎进行辅助孵化操作，发现穿孔组的妊娠率45.8%（44/96）和着床率25.2%（68/270）均要高于削薄组的40.7%（37/91）和24.8%（58/234），这似乎也提示激光穿孔的效果要优于激光削薄。但黄绮云[9]通过对冻融胚胎进行激光透明带穿孔和激光透明带薄化却得出了截然相反的结果，在其实验中，穿孔组的种植率及妊娠率均要低于薄化组。他认为当用激光将整个透明带穿透，热效应对卵裂球产生了极大伤害，而激光削薄处理与之相比则可以最大程度上避免这一损伤，获得更好的胚胎孵出结局。但是在激光辅助孵化中，透明带的削薄只是克服了孵化前的简单机械性阻力，减低孵化过程中所消耗的能量阈值，而精卵结合的受精过程却是一个非常复杂的生物分子化学反应过程，要克服的不只是物理上的阻力[10]。
刘丽均等[7]通过免疫荧光染色技术发现小鼠卵子冻融后透明带糖蛋白-2结构受到不同程度的损伤，而糖蛋白-2上存在着精卵结合的作用位点，它的受损使得无法结合到透明带上，也无法诱发其后的顶体反应，而顶体反应是穿过透明带的先决条件[10]。因此，激光透明带削薄处理虽然克服了部分透明带冻融变硬造成的机械阻力，但其不能修复冻融对糖蛋白造成的损伤，激光处理甚至进一步破坏了糖蛋白结构，最终使得无法识别透明带上的结合位点，而一旦不能与透明带结合，也就不能穿过最后一层透明带[10]。这也解释了本研究中用激光削薄处理透明带并未取得理想结果的原因。
综上所述，在应对卵子因冻融导致的受精困难的问题时，不建议采用激光透明带削薄的方法，而应控制好激光激发的强度和位置，完全将透明带某一区域穿透，如此才能有效提高冻融卵子受精率。
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