孑遗植物双蕊兰菌根真菌培养条件的优化
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摘要：以兰科孑遗植物双蕊兰（Diplandrorchis sinica）菌根为材料，通过分离、纯化、培养其菌根真菌，根据正交试验设计原理，利用正交试验方法筛选温度、碳源、氮源和培养基pH等培养条件建立双蕊兰菌根真菌培养体系。结果表明，双蕊兰菌根真菌菌落白色或浅黄色，呈均匀辐射状向外生长；生长面有稀松或较丰富的气生菌丝，带有透明液滴。通过对菌落生长速率的测定与分析，4种因素的最佳综合水平为：碳源为半乳糖，浓度为2%；氮源为硝酸铵，浓度为0.5%；pH为6；温度为25 ℃。菌落生长速率随着天数的递增而以较快的速度下降，第7天之后趋于稳定。
关键词：双蕊兰（Diplandrorchis sinica）；孑遗植物；菌根真菌；培养条件
中图分类号：S182 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5798-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.22.018
Diplandrorchis Sinica Mycorrhizal Fungi Optimization of Culture Conditions
QU Bo1， JIANG Yu-ling1， ZHANG-YI Zi-han1，2， ZHANG Li-jie1
（1.Bioscience and Technology College， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China；
2.College of Life Science， Inner Mongolia University， Hohhot 010021，China）
Abstract： The Orchid relict plant Diplandrorchis sinica fungi were used as materials. By separation，purification and cultured， the D. sinica mycorrhizal fungi culture system which based on the principle of orthogonal design was established， using orthogonal experimental method to set culture conditions that include temperature，carbon source，nitrogen source and medium pH. The results showed that the white or pale yellow colonies of D. sinica fungi showed the uniform radial outward growth，growth surface of sloppy or rich aerial hyphae with transparent droplets. Through measurement and analysis of colony growth rate，best level of four factors were as following： The carbon source was concentration of 2% galactose； The nitrogen source was concentration of 0.5% ammonium nitrate； pH was 6； The temperature was 25 ℃. Colony growth curve showed downward-trend， with the increase in the number of days，and finally tends to a constant value.
Key words： Diplandrorchis sinica； relict plant； mycorrhizal fungi； culture conditions
p蕊兰（Diplandrorchis sinica），兰科双蕊兰属植物，为单属种，腐生兰，是兰科中最原始的植物之一[1]，是研究兰科植物起源与系统进化的重要材料。目前双蕊兰仅在辽宁省桓仁县和新宾县有发现，其种群量极少，已被列入国家保护植物名录[2]，2012年被评估为国际自然保护联盟濒危物种红色名录（IUCN）极危（Critically endangered，CR）物种[3]。双蕊兰生育期极短，通常8月中旬萌发，9月初开花后即凋谢，约20 d。双蕊兰是兰科植物中极其罕见的原始类型，其繁殖方式至今未知。双蕊兰分布区域极其狭窄，种群数量极少，自然繁殖能力较弱，随着生境的改变，分布范围会日益缩减，若不及时采取有效措施，将有濒临灭绝的危险[4]，因此，有必要开展双蕊兰的保育生物学研究，人工促进其种群恢复及扩大。
兰科菌根（Orchidaceous mycorrhizae）是兰科植物与真菌形成的共生联合体，在兰科植物生长和生命活动中有重要的作用[5，6]。菌根真菌促进兰科植物种子萌发，提高繁殖率，加快植株的生长，增强宿主的抗逆性，同时还能促进植物产生许多药用成分和新化合物等[7]。目前国内外对于与双蕊兰共生的真菌研究仍未见报道，从而限制了双蕊兰保育工作的顺利进行。因此，对双蕊兰菌根深入研究，有助于研究共生长发育模式，为人工抚育双蕊兰提供理论依据，同时，也为进一步探索兰科植物的适应机制提供参考[8-10]。
1 材料与方法
1.1 试验菌种
供试的双蕊兰来自辽宁省抚顺市新宾县（E124°41′～125°05′，N41°11′～41°21′）。取其根段 2 cm，75%乙醇浸1 min，0.1%升汞表面消毒10 min，切成小段，直接放在PDA培养基上室温下培养。分离纯化后，挑取菌根真菌菌丝，ZESS显微成像系统拍照。同时将其作为本试验的菌种。
1.2 培养条件
1.2.1 培养基 本试验所用培养基为马铃薯培养基（PDA）：马铃薯200 g，去离子水1 000 mL，沸水煮熟后过滤得马铃薯汁，加入碳源20 g、氮源5 g、琼脂15 g。
1.2.2 试验条件 确定以温度、碳源、氮源、pH为主要影响因素，采用4因素3水平正交试验设计方案，共设置9种处理。根据前期单因素预试验结果，温度分别设置为15、20、25 ℃；碳源为葡萄糖、蔗糖、半乳糖；氮源为氯化铵、硝酸铵、甘氨酸；pH分别设置为5、6、7（表1、表2）。每个处理3个重复，于接种后每天用游标卡尺采用十字交叉法测量菌落直径，并拍照记录。
1.3 数据分析
用Microsoft Excel和SPSS Statistics 19软件进行数据处理，统计分析菌株生长速率并比较各条件差异的显著性。
2 结果与分析
2.1 双蕊兰菌根菌形态特征
双蕊兰菌根菌接种后，菌落呈均匀辐射状向外生长，菌落先呈白色，第5天时菌落边缘逐渐变为浅黄色；生长面有稀松或较丰富的气生菌丝，带有透明液滴（图1A）。菌丝宽约2～4 μm，有隔；分支略呈直角，分支处缢缩，距菌丝分枝点较近处形成隔膜，隔膜具桶孔（图1C）。分生孢子长椭圆形，长8～12 μm，宽3～5 μm（图1D）。
2.2 正交试验结果
从表3、表4可知，温度间的F=807.641，P=0.000
F检验的结果表明，不同的碳源、氮源、pH和温度都对菌落生长速率有极显著的影响，故应分别考察不同碳源、不同氮源、不同pH和不同温度的多重比较结果，以选出最优组合。
由表5可知，在95%置信区间内，均值越大，对生长速率影响越大。所以通过比较“均值”列，可以发现半乳糖>葡萄糖>蔗糖，碳源最佳水平为半乳糖；硝酸铵>甘氨酸>氯化铵，氮源最佳水平为硝酸铵；pH 6>pH 5>pH 7，pH最佳水平为6；25 ℃>20 ℃>15 ℃，温度最佳水平为25 ℃。
2.3 菌落生长情况
通过观察9种处理的菌落生长状况（图2）发现，前5 d 9种处理菌落直径都以较快的速度稳定增加，类似线性递增。第5天至第11天，处理2、处理3、处理4和处理8的生长速率较快；处理1、处理5、处理6和处理9的生长速率较慢；处理7的生长速率则趋于稳定。第11天至第15天，处理2、处理3、处理4和处理8的生长速度于第11天左右达到最高峰之后便趋于稳定；处理1、处理5、处理6和处理9的生长速度继续增加，未达到峰值；处理7仍以3.5 mm/d的速率增长。
对第1、3、5、7、9、11、13、15天的9种处理的菌落直径作生长曲线（图3），可以得出9种处理的三项拟合的生长曲线公式，如下：
处理1：y=0.003x3-0.146x2+6.218 4x-4.422，R2=0.997 7；
处理2：y=-0.050 7x3+0.922 2x2+2.932 8x+9.484 1，R2=0.995 1；
处理3：y=-0.025 7x3+0.097 7x2+9.715 8x+7.129 6，R2=0.988 9；
处理4：y=-0.028 2x3+0.201 6x2+8.401 9x+12.103，R2=0.986 0；
处理5：y=-0.005 5x3+0.191 9x2+2.82x+4.240 4，R2=0.999 1；
处理6：y=-0.023x3+0.549 6x2+1.174 1x+12.151， R2=0.997 5；
处理7：y=0.031 5x3-1.003 7x2+11.55x+4.890 5，R2=0.997 5；
处理8：y=0.000 3x3-0.586 9x2+14.269x+5.588 5，R2=0.992 7；
处理9：y=-0.031 1x3+0.721 4x2+1.250 1x+7.806 8，R2=0.999 4。
C上所述，生长曲线呈抛物线状，生长公式的R2越大，曲线斜率越小；生长曲线先进行线性增长，达到顶峰再趋于恒定值，最后再逐步减小。生长公式符合真菌生长的规律。
3 小结与讨论
不同的兰科植物的菌根菌生长条件有着显著差异，在自然环境下，菌根菌的生长受环境因素影响较大。
1）温度：大部分兰科植物的菌根菌在25 ℃下生长速度较快[11]，而本试验双蕊兰菌根菌的最适生长温度恰好为25 ℃。有研究表明，华石斛的菌根菌最适生长温度也为25 ℃，生长温度范围为5～40 ℃之间[12]；美花石斛的最适温度为25 ℃或28 ℃[13]；但也有例外，美花兰的菌根菌在25 ℃恒温培养下生长缓慢，30 ℃是其最适的生长温度[14]。这说明生活型不同，菌根菌的生长最适温度范围不同。
2）碳源：每种菌根菌对不同的碳源利用率不同，本试验中的双蕊兰的菌根菌对半乳糖利用率最高。有试验曾验证霍山石斛的菌根菌最适碳源为蔗糖[15]；而华石斛的菌根菌可利用的碳源范围较广，可利用单糖、双糖、多聚碳水化合物的多种碳源，对麦芽糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素、蔗糖利用效果较好[12]。由此看来，与腐生的双蕊兰共生的菌根菌更适合利用单糖。
3）pH：菌根菌适合在酸性土壤中生长（pH 4.0～6.0），本试验验证了这种说法。但是也有少数菌根真菌在弱碱性条件下生长，例如美花兰的菌根菌在pH 8.0时能够快速生长[14]；美花石斛的优势菌根真菌均对碱性环境条件适应性较强[13]。这表明与兰科植物共生的菌根菌对酸碱度的耐受性和兰科植物栖息的环境有直接关系。
4）氮源：不同菌根菌对相同氮源的吸收和利用率存在较大差异，同一菌根菌对不同氮源的吸收效果也不同。如华石斛的菌根菌对酵母膏、蛋白胨、甘氨酸、硝酸钠利用效果较好，对氨态氮利用效果较差[12]。徐超等[16]研究表明，在对兰科植物铁皮石斛进行纯培养氮源的筛选过程中，无机氮源（硝酸铵）为适用于铁皮石斛菌根真菌生长的氮源，与本研究的结果基本一致。
利用SPSS Statistics 19软件进行试验设计，通过正交试验优化培养条件，分析试验所选各因素对生长速率的影响。结果表明，试验误差较小，说明依据该培养条件所建立的双蕊兰菌根菌的培养体系稳定，有利于菌丝生长。综上所述，双蕊兰菌根真菌最优培养体系为：碳源为2%半乳糖，氮源为0.5%硝酸铵，pH为6，温度为25 ℃。
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