响应面优化双孢菇预煮液酶解工艺研究

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摘要：以游离α-氨基氮为指标，对比了中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶对双孢菇（Agaricus bisporus）预煮液的酶解效果，并采用Box-Behnken响应面法优化了中性蛋白酶的酶解工艺。结果表明，中性蛋白酶酶解效果优于风味蛋白酶和木瓜蛋白酶，其最优工艺为添加量0.41%，pH 6.5，55 ℃酶解2.95 h，在此条件下，游离α-氨基氮为419.6 mg/L。

关键词：双孢菇（Agaricus bisporus）；预煮液；酶解；响应面法

中图分类号：S646.1+9；TS264 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5926-05

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.22.049

Optimization of the Enzymatic Hydrolysis Process of Blanching Liquid from Agaricus bisporus by Response Surface Analysis

XUE Shu-jing1，LI Lu1，YANG De1，GUAN Jian1，DUAN Xiu-hui2，WANG Xiao-li1，GAO Hong1，CHENG Wei1

（1.Institute for Processing of Farm Products and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China； 2.College of Food Science & Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，China）

双孢菇（Agaicus bisporus）又称蘑菇、白蘑菇，属伞菌目蘑菇科蘑菇属[1]，是世界上食用和栽培量最高的菇种。2013年中国年产量为2 377 327.12 t。双孢菇味道鲜美、营养丰富、其营养指数、生物价、氨基酸评分、必需氨基酸指数等都比较高，接近于肉类和牛奶。除了营养价值外，保健功能也受到关注，国内已制成“健肝片”用以治疗肝炎，此外还具有抗癌、降血压等多种功能[2]。双孢菇采收季节性强，采后极易褐变、开伞、失水、腐败等。目前最为普遍的加工方式是制罐。而预煮工艺是生产罐头必备的生产工序，在预煮工序中，大量的营养成分会溶于预煮液中。郑桂春等[3]发现平菇杀青后干物质损失高达23.45%。在实际生产中，大量食用菌预煮液往往当做废水排出，不仅造成资源浪费，也会一定程度上带来环境污染。因此，预煮液的综合开发利用问题逐渐引起人们的注意。食用菌预煮液的开发主要是利用食用菌的感觉功能（含风味物质与呈味物质等成分）[4]，加工成酱油、食醋、浸膏等产品[5-8]。研究发现食用菌中构成风味的鲜味主要来自不挥发的氨基酸、肽和核苷酸类含氮化合物[9]。因此，本研究以游离α-氨基氮为指标，利用生物酶水解技术，增加风味物质溶出，从而提高其加工产品品质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜双孢菇去杂清洗，适度切片。添加0.1%的柠檬酸于冷水（双孢菇∶水=1∶1.2）中，待水煮沸后分批加入菇片，10 min/批。预煮结束后，捞出菇体。适度冷却后用3～4层纱布过滤，调节滤液可溶性固形物含量至2%（视情况加水稀释或加热浓缩），滤液冷冻备用。

木瓜蛋白酶，Sigma试剂公司；中性蛋白酶，诺维信（天津）酶制剂公司；风味蛋白酶，诺维信（天津）酶制剂公司，3种酶活见表1。

1.2 方法

1.2.1 双孢菇预煮液蛋白酶处理条件研究 取一定量的双孢菇预煮液，过滤后，分别控制pH、温度、蛋白酶添加量、酶解时间。酶解结束后，水解液在90 ℃下加热灭酶15 min后，将酶解液稀释100倍后，测定游离α-氨基氮含量。

1.2.2 游离α-氨基氮测定 采用茚三酮法[9]。取5支试管，其中3支各加2 mL甘氨酸标准溶液（α-氨基氮2 μg/mL），一支加2 mL试样稀释液，另一支加2 mL水作空白，然后在各管中加1 mL显色剂，摇匀，并在管口放一玻璃球，在沸水浴上加热16 min，取出，立即在20 ℃水浴中冷却20 min，加5 mL稀释液摇匀，在30 min内于570 nm波长下测吸光度。

游离α-氨基氮=（试管的吸光度/标准管平均吸光度）×4×（1/2）×试样稀释倍数

1.2.3 最佳蛋白酶的选择 通过单因素试验确定木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶的最适酶解条件（pH、时间、添加量、温度），分别在3种蛋白酶最佳酶解条件下进行酶解后对比酶解效果，筛选出酶解效果最好的蛋白酶。

1.2.4 响应面优化中性蛋白酶酶解条件 在以上单因素试验的基础上，以中性蛋白酶添加量、pH、酶解时间为因素，各因素拟定3个水平，以游离α-氨基氮为指标，采用响应面Box-Behnken设计试验，得到中性蛋白酶的最优酶解条件。具体响应面设计的因素与水平见表2。数据处理采用Excel 2007，Design-Expert 8.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 双孢菇预煮液最适蛋白酶的选择研究

在食用菌加工中，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶是比较常见的蛋白酶类，而风味蛋白酶是一种混合酶，它同时包括内切酶和外切酶，可将疏水氨基酸从蛋白质末端有效地切除，使末端疏水氨基酸游离，以降低苦味等不良风味[10]。故本研究拟从中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶3种蛋白酶进行筛选。

每一种酶都有最适的酶解时间、pH、温度和添加量。通过试验，以游离α-氨基氮为指标，确定3种蛋白酶的酶解条件（图1）。图1（a）显示了木瓜蛋白酶的酶解结果：当酶解初始pH 6.5时，酶解效果最好；酶解时间为120、180 min时游离α-氨基氮含量均较高，且相差不大，考虑试验高效性，选择120 min作为最佳酶解时间；添加量达到0.2%后，游离α-氨基氮随添加量的增加升高不明显，故添加量为0.2%时即为最佳；随着温度上升，游离α-氨基氮不断增加，当温度为55 ℃时，酶解效果最好。所以木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为初始pH 6.5、添加量0.2%、55 ℃酶解120 min。图1（b）显示了中性蛋白酶的酶解结果：随着初始pH上升，游离α-氨基氮有所增加，当pH 6.5时，游离α-氨基氮达到峰值，之后随着pH升高，游离α-氨基氮含量逐渐减少；酶解时间为150 min时游离α-氨基氮达到峰值，酶解效果最好；游离α-氨基氮含量随着添加量变化缓慢增加，增幅不明显，考虑经济性，选择0.3%为最佳添加量；随着温度上升，游离α-氨基氮不断增加，当温度为55 ℃时，酶解效果最好。所以木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为初始pH 6.5、添加量0.3%、55 ℃酶解150 min。图1（c）显示了风味蛋白酶的酶解结果：当pH 6.0时，游离α-氨基氮_到峰值，酶解效果最好；随着酶解时间增加，游离α-氨基氮含量逐渐上升，并在180 min时含量最高；游离α-氨基氮含量随着添加量变化缓慢增加，在添加量达0.4%时酶解效果最好；随着温度上升，游离α-氨基氮不断缓慢降低，故45 ℃为最佳酶解温度。所以风味蛋白酶的最佳酶解条件为初始pH 6.0、添加量0.4%、45 ℃酶解180 min。

分别在3种蛋白酶最佳酶解条件下进行酶解，其酶解效果对比结果如图2所示。从图2可以看出，中性蛋白酶优于风味蛋白酶和木瓜蛋白酶，故以中性蛋白酶进行响应面优化试验。

2.2 中性蛋白酶酶解条件响应面优化

为优化单因素试验得到的工艺条件，在55 ℃温度下，以中性蛋白酶酶解条件添加量、pH、酶解时间为因素，游离α-氨基氮为指标，采用响应面Box-Behnken设计试验，试验结果见表3。应用Design-Expert 8.0软件对表3中的数据进行分析，获得自变量与游离α-氨基氮（Y）的回归方程：Y=421.34+2.91A-1.85B-3.69C-10.47AB-25.57BC-28.17A2-44.24B2-18.52C2（R2=0.948 6），结果如表4所示。从表4可以看出，该回归模型P为0.000 2，回归模型达到极显著；失拟项为0.023 3，达到显著水平；回归模型因变量和自变量之间的关系显著（R2=0.948 6），说明模型的拟合程度较好，试验误差较小；影响中性蛋白酶酶解双孢菇预煮液效果的酶解条件中，影响游离α-氨基氮含量的显著性关系为酶解时间>添加量>pH；考虑因素之间的交互作用，pH和酶解时间之间存在交互作用，达到显著水平。

三维空间的响应面图能比较形象的反映各因素之间的交互作用。为进一步反映两变量交互作用对游离α-氨基氮影响的显著性，也作了相应的等高线图，图中椭圆形则表示显著，而圆形表示不显著[11]。中性蛋白酶酶解双孢菇预煮液效果的酶解条件中添加量、pH和酶解时间之间的交互作用对游离α-氨基氮含量的影响如图3所示。

从图3a可以看出，pH和添加量对游离α-氨基氮含量的影响均成抛物线，即随着pH和添加量的同时增大，游离α-氨基氮含量先增大后降低，因此酶解时适当增加pH和添加量可以提高游离α-氨基氮含量。从图3b可知，等高线图呈椭圆形，说明pH和酶解时间之间的交互作用对游离α-氨基氮含量的影响显著，这与和方差分析显示结果一致。只有在添加量、pH和酶解时间适宜的情况下，中性蛋白酶才能发挥最佳的酶解效果。

为精确计算出中性蛋白酶最佳酶解条件，利用回归方程对各自变量（A、B、C）求极值，得到极值点为A=0.051，B=0.003，C=-0.101，即添加量0.41%，pH 6.5，酶解时间2.95 h。在此最优条件下，游离α-氨基氮为421.6 mg/L。经过3次验证试验后，得到平均游离α-氨基氮为419.6 mg/L，与理论值相符。说明该回归模型能较好地将中性蛋白酶酶解产生游离α-氨基氮的含量预测出来，优化得到的酶解条件是准确可靠的，具有实际应用价值。

3 结论

以游离α-氨基氮为指标，以蛋白酶对双孢菇预煮液进行酶解。试验从3种酶（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶）中筛选出了中性蛋白酶，并采用响应面法优化了酶解工艺，其最优工艺为添加量0.41%，pH 6.5，55 ℃酶解2.95 h，在此条件下，游离α-氨基氮为419.6 mg/L。

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Abstract： With free α-amino nitrogen as index， the enzymatic hydrolysis effects of neutral protease， papain and flavour protease on blanching liquid of Agaricus bisporus were compared， and the enzymatic hydrolysis process of neutral protease was optimized by Box-Behnken response surface experiment. The results showed that， the enzymatic hydrolysis effect of neutral protease was better than that of flavour protease and papain. The optimal conditions were an additive amount of 0.41%， t=2.95 h， pH=6.5， T=55 ℃. Under the conditions， the content of free α-amino nitrogen was 419.6 mg/L.

Key words： Agaricus bisporus； blanching liquid； enzymatic hydrolysis； response surface experiment