中药蛋白质组学研究策略
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[摘要] 蛋白质组学在中药研究中的应用已十分广泛，有许多较为成功的实例。作者回顾了前人应用蛋白质组学技术对中药复杂体系的研究工作，并提出建立一门专门针对中药研究的蛋白组学，即中药蛋白质组学。该文对中药蛋白质组学的研究策略及未来的研究方向进行了综述和思考，希望为从事中药蛋白质组学研究者提供一点思路。
[关键词] 中药蛋白质组学； 生物信息学； 蛋白修饰； 蛋白质相互作用
Research strategy of traditional Chinese medicine proteomics
LE Liang1， JIANG Baoping2， XU Jiang1， HU Keping2， CHEN Shilin1*
（1.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；
2.Institute of Medicinal Plant Development， China Academy of Medical Sciences and Peking Union
Medical College， Beijing 100193， China）
[Abstract] The application of proteomics in the research of traditional Chinese medicine （TCM） is very extensive， and there have been many successful cases. In this paper， the previous studies on the complex system of TCM by using proteomics technology were reviewed， and the authors proposed to set up a special subject on proteomics in TCM， which is called TCM proteomics. In this paper， the research strategies and the future research directions of TCM proteomics were reviewed and discussed， which may provide some ideas for the researchers of TCM proteomics.
[Key words] traditional Chinese medicine proteomics； bioinformatics； protein modification； protein interaction
doi：10.4268/cjcmm20162203
中药是我国传统文化的重要财富，是现代医药可持续发展的宝贵资源。历经千年的传承，中药的有效性、科学性和实用性已得到诸多的验证。2015年青蒿素的研制获得诺贝尔生理学或医学奖，是中药应用于世界医学研究中的一次伟大胜利，也是世界对中药单体研究的认可，为中药现代化作出了突出贡献。然而从中药单体的胜利迈向中药复方的胜利仍然需要更多的努力。中药是典型的复杂物质体系，其复杂的体系是中药的一把双刃剑，因其成分的多样使得中药更系统的治疗疾病，也因其成分的复杂也使得中药作用机制的研究非常困难。因此，迫切需要应用现代科学发展的新技术和新手段来研究中药复杂体系的作用机制，探索适合中药研究的新方法、新模式才有可能真正揭示中药的物质基础与作用机制，使中药研究真正迈向现代化。
中药的现代化研究一直是中医药界多年来关注的焦点和研究的热点。目前中药现代化取得了许多新进展，如整体观认识在提高；中药多成分与药效研究在加强；从药效物质基础阐明中药作用的内涵；对于具有多成分的中药，从植物化学角度建立中药化学成分指纹图谱；应用现代科学对“辨证论治”和“君臣佐使”配伍规律进行研究；“组学”方法和技术的应用等[1]。在大数据时代，基于各种组学，如基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学等技术平台的系统生物学是中药现代化研究的必备工具[2]。使用系统生物学研究中药复杂体系的思路，为中药现代化的发展提供了崭新的思路和方法，成为目前中药现代化研究的热点。迄今为止，不少科研工作者都在系统生物学思路指导下开展了对中药复杂体系的研究。而在后基因时代，蛋白质组学等基因功能学的研究成为系统生物学研究的重点。
1 中药蛋白质组学的定义
将蛋白质组学的技术应用于中药研究领域，一方面通过比较对照细胞或动物组织的蛋白质表达谱和给予中药后蛋白质表达谱的差异，可以找到中药的可能靶点相关蛋白质，另一方面不同中草药及其不同组分，例如根茎叶中蛋白质组的差异，用以评价中草药活性成分与其生长过程中蛋白组的变化的关系，寻找中药高活性的原理，由此发展起来的学科称之为中药蛋白质组学。
2 中药蛋白质组学的主要研究内容
不同于其他蛋白质组学，中药蛋白质组学的研究对象为中草药本身及用中药（单体化合物、中药组分或复方）处理后的生物体（细胞或组织），于此发现中药的有效成分及作用机制。中药蛋白质组学的研究目标包括：中药药物作用靶点的发现和确认，特别是中药复方的多靶点效应，蛋白质组学能更好的发现中药复方的多种靶点；研究中药植物蛋白质组成的差异；阐明中药的作用机制及中药毒理的作用机制，以及为中药配伍提供科学依据。
3 中药蛋白质组学的常用技术
蛋白质组学已经历了20多年的发展，现今技术成熟，被应用于多种学科的研究。对中药蛋白质组进行分析需要有合适的研究策略和技术、有效的实时分析模式，从而获得在基因组和转录组上不易获得的功能信息。以下是一些常用的技术。
4.2 利用蛋白质组学寻找中药作用靶点 目前大部分中药蛋白质组学的应用实例都是关于利用蛋白质组学技术寻找中药作用靶点的，该方法在研究中药单体、单味药及中药复方中都多有应用（表2）。例如2008 年和2010 年，Yue 等[2021]分别利用蛋白质组学技术研究了中药灵芝单体化合物灵芝酸 D，B，F，K，AM1（ganoderic acid D，B，F，K，AM1） 对于人宫颈癌HeLa 细胞毒性的作用机制，发现了多种与灵芝酸类化合物作用相关的靶点蛋白。2013年Pan等[2223]利用蛋白组学技术分析丹参酮ⅡA对宫颈癌Caski细胞的抑制作用，发现C/EBP同源蛋白和细胞凋亡信号调节激酶1参与丹参酮ⅡA的抑癌作用。小檗碱又称黄连素，具有多种药理活性，如调血脂、降血糖、防治神经病变甚至抗癌。2012年Chou等[24]利用二维电泳结合质谱探索小檗碱抗乳腺癌的作用，至少96种参与蛋白质折叠，蛋白质水解、氧化还原调控、蛋白转运、细胞信号转导、电子传递失调，代谢和中心体的结构等多种功能的蛋白质调节小檗碱的抗癌作用。2011年Feng等[25]研究丹酚酸B对心肌保护的作用，采用2维电泳结合质谱的方法发现EGFR可能是丹酚酸B的作用靶点。同年Ma等[26]研究丹酚酸B对血小板的作用靶点发现Hsp70，CLP36的蛋白可能是其在血液中的作用靶点。9，11脱羟基麦角固醇来源于赤芝，2010年Cui等[27]利用蛋白质组学研究其细胞毒性发现9，11脱羟基麦角固醇的细胞毒性可能与6种蛋白有关，其中包括stathmin 1，一种主要的细胞骨架蛋白。藤黄能明显抑制肝癌细胞的增殖，1，3，6，7四羟基氧杂蒽酮是藤黄中的一种有效成分，2012年Fu等[28]采用蛋白组学研究其抑制肝癌细胞生长的作用机制，发现1433δ和P16蛋白表达明显上调，而抑制1433δ的表达则明显减少这种化合物的抑癌作用，表明1433δ可能是其作用靶点。
也有许多关于利用蛋白质组学研究单味药的报道，如2008 年，Yao 等[2930]分别利用蛋白质组学技术探讨了与三七总皂苷和丹参总酚酸抑制大鼠血小板聚集作用相关的靶点蛋白。天麻是兰科天麻属多年生草本植物，其根茎入药用以治疗头晕目眩、肢体麻木等症。2012年Umamaheswari等[31]采用定量蛋白质组学技术对体外SHSY5Y细胞模型中受到天麻调控的因子进行表达谱测定，结果表明伴侣蛋白/蛋白酶通路相关蛋白影响天麻的神经保护作用。而同时Manavalan等[32]则利用体内大鼠灌胃天麻模型并采用定量蛋白质组学技术研究天麻对大鼠脑组织蛋白质组学的影响，结果显示天麻长期治疗可以改善大脑神经生长和突触活动相关的蛋白的表达变化，如Gnao1和Dctn2蛋白。同时，天麻还诱导上调分子伴侣和错误折叠相关蛋白，如Anxa5等。南蛇藤是卫矛科南蛇藤属落叶藤状灌木，其根、藤祛风活血，消肿止痛。2014年Zhu等[33]研究南蛇藤抗胃癌的作用，利用蛋白质组学技术发现TGFβ1介导的HSP27信号通路可能参与其抗癌作用。刺五加是一种灌木，在中国医药学中作为药物广泛应用已有悠久的历史，具有“补中益精、坚筋骨、强志意”的作用，久服“轻身耐老”，与他药配伍亦可“进饮食、健气力、不忘事”。2014年Li等[34]研究刺五加的神经保护作用，采用定量蛋白质组学发现了3 425个差异蛋白，其中16种可能是其潜在靶点，这些蛋白与路易小体的形成、线粒体能量代谢、蛋白质合成等相关。
另外，有许多关于利用蛋白质组学技术研究中药复方，寻找中药复方相关作用靶点都文献报道。例如，2009 年，NquyenKhuong等[35]探讨了由栝楼、大豆、中药五味子和西地格丝兰提取物组成的混合物作用于人膀胱癌细胞后蛋白质组的表达谱变化，鉴定了多种与能量代谢、细胞骨架、蛋白质降解以及肿瘤抑制相关的蛋白。2011年Huang等[36]利用蛋白质组学技术探索了扶正增效方治疗肺腺癌作用的蛋白质表达谱变化，结果鉴定了蛋白S100A9和亲环素A可能是扶正增效方放射增敏作用的靶点蛋白。2010年Fan等[37]研究双龙方对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的影响，发现至少36种参与细胞骨架、细胞组织能量代谢和信号转导的蛋白质能影响双龙方的功能。2016年Pan等[38]采用二维电泳结合质谱技术研究黄芩和大黄复方提取物对二甲基亚硝胺诱导肝损伤模型治疗后的蛋白质组差异，结果发现黄芩和大黄复方提取物对氧化应激和细胞骨架的紊乱具有明显的改善作用。痹祺胶囊是由马钱子、地龙、党参、茯苓等中药配制而成，主治益气养血，祛风除湿，活血止痛。2011年Wang等[39]研究其对巨噬细胞的抗炎作用，采用蛋白质芯片技术评价40种细胞因子的表达变化，发现iNOS，COX2，TNFα，IL6 和 IL1β等明显减少，其可能参与痹祺胶囊的抗炎作用。同样是这个课题组，2012年[40]又对左金丸抗炎作用进行评价，结果发现iNOS， COX2， IL6， IL1β，TNFα等细胞因子也参与左金丸的抗炎作用，但不同的是， NFκB也是参与左金丸抗炎作用的重要靶点。2016年Li等[41]研究补肾益肺方对慢性阻塞性肺疾病的作用及机制，发现补肾益肺方的长期作用疗效显著，抑制慢性阻塞性肺疾病的炎症细胞因子的高表达、胶原沉积和蛋白酶与抗蛋白酶的失衡等，作者利用结合蛋白质组学、代谢组学和转录组学的数据，发现许多基因、蛋白质、代谢物参与补肾益肺方调节的脂质代谢、炎症反应、氧化应激等信号通路。
4.3 中药作用靶点的预测及验证 利用分子对接技术高通量筛选中药单体化合物，再通过体内外实验验证中药单体的药效是目前寻找中药有效成分的较好的一种高通量药物筛选方式。该方法的有效进行得益于日渐完善的蛋白质空间结构数据库，目前常用的蛋白质空间结构数据库包括PDB，ISSD，SCOP，MMDB等，其中以PDB（Protein Data Bank）数据库收录最为详尽。PDB数据库由美国Brookhaven实验室于1971年建立[42]，收录了通过X射线晶体衍射、核磁共振和电子显微镜方法测定的生物大分子的三维结构。分子对接技术包括正向对接及反向对接，正向对接是指通过蛋白质的空间结构搜索与其特异性结合的小分子，而反向对接则是根据其提供的蛋白质空间结构采用小分子配体搜索潜在结合蛋白的方法，2种技术都可以预测中药单体化合物与靶点蛋白的相互作用。目前用于分子对接的软件有Discovery Studio，AutoDock，Surflex，FlexX，MVD，INVDOCK等。例如Yue等采用反向INVDOCK寻找能够分别与灵芝酸D和丹酚酸B直接结合的靶点蛋白，结果表明，1433蛋白可能是灵芝酸 D 直接结合的靶点蛋白[20]，而EGFR蛋白可能是丹酚酸B直接结合的靶点蛋白[25]。然而分子对接的实验结果必须利用实验技术来验证，常用的实验验证手段包括体外细胞实验，Elisa试剂盒验证以及采用BIAcore生物大分子相互作用仪通过体外表面等离子体共振技术对中药单体化合物与靶点蛋白的结合活性进行验证[43]。
4.4 中药靶点蛋白相互作用网络结构的研究 随着蛋白质组学技术的发展，人们越来越认识到蛋白质相互作用的重要性。每一个蛋白都是一个重要的个体，通过相互作用的网络将这些个体联系起来从而发挥功能。中药常是多成分体系，对蛋白质相互作用网络的影响更能表明中药体系的实际药效。目前研究蛋白质相互作用的技术包括酵母双杂交、Pulldown、免疫共沉淀、亲和色谱和表面等离子共振等。目前的蛋白质相互作用数据库有STRING数据库（http：//string.embl.de）、DIP数据库（http：//dip.doembi.Ucla.edu）、BIND数据库（http：//bind.ca）等。例如2011年Feng[25]和Ma等[26]分别采用该方法绘制了丹酚酸B的靶点蛋白相互作用网络结构。而对于网络结构中的一些关键蛋白，可以采用基因敲除或过表达的方式来验证其相互作用。尽管中药靶点蛋白质相互作用网络结构的研究非常重要，但由于中药体系的复杂性以及蛋白质网络结构的多样性，使得这一工作进展缓慢，相关报道仍然较少，也极少有突出性的成果。
4.5 中药体系靶点蛋白修饰谱的研究 随着质谱技术的发展，许多蛋白修饰的研究成为可能。如2006 年，美国的Kim 等[44]首次使用在全蛋白质组学水平进行乙酰化修饰研究的方法，用赖氨酸乙酰化特异性抗体富集乙酰化肽段，然后nanoHPLCMS/MS 进行鉴定，在200多个蛋白质中鉴定出大约 400 个赖氨酸乙酰化位点。Liu等[45]在对人血浆 N糖蛋白质进行研究时，采用免疫亲和的方法结合肼化学法富集糖基化蛋白质，采用FTICR对鉴定的糖基化位点的可靠性进行评估，总共鉴定了 303个N糖蛋白质的2 053个N糖肽。Peng 等[46]运用亲和标签富集泛素化蛋白，再结合强阳离子交换色谱（SCX）、RPLC分离泛素化肽段，通过 LCQ 串联质谱鉴定酵母中的1 075个泛素化蛋白质，110个泛素化位点。而磷酸化修饰通常包括丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化三类，分离富集技术包括：金属亲和磷酸化蛋白质磷酸化肽段（IMAC）、免疫沉淀、 SCX、强阴离子交换色谱（SAX）、反相色谱等。如Hayduk等[47]采用一种可专门针对磷酸化蛋白质进行染色的荧光染料 ProQ Diamond 并结合双向电泳对中国仓鼠卵细胞的磷酸化蛋白质进行了观测，在1 877个总蛋白点中观测到了672个磷酸化蛋白质点，约占总蛋白质的36%。
尽管翻译后修饰蛋白质组学技术条件还不完全成熟，而比较中药体系靶点蛋白翻译后修饰谱的研究更是少之又少，但由于翻译后修饰是蛋白质功能的主要方式，因此翻译后修饰是未来蛋白质组学的主要的发展方向，那么中药蛋白质组学的研究方向也必然需要向这一方面发展。
5 结语
中药是人们经过数千年的努力累积起来的宝贵资源，其安全性、有效性和科学性毋庸置疑。采用新近发展的各种组学技术来认识中药的作用机制、作用物质基础和安全性是值得提倡的。而蛋白质组学在中药体系的研究中，其合理性和可行性获得广大中药研究者的认可。同时，蛋白质组学在中药复杂体系中的应用为中药的现代化发展带来巨大的机遇。但是蛋白质组学技术来中药作用机制的研究中仍然处于初级阶段，往往流于蛋白质表达谱的变化，却没有更深入的对机制的探索。笔者认为未来中药研究者需要从两方面提升中药蛋白质组学的发展，一是应用更先进的外部技术，如开发适用于中药复杂体系作用机制研究的高通量蛋白质组学研究方法，中药复杂体系对翻译后修饰的蛋白质组学技术的应用，蛋白质网络结构的研究等。二是提升中药作用机制的研究深度，各种组学技术更多的是提供新发现和探索未知的工具，而中药作用机制的深度研究是未来中药走向世界的必经之路。相信随着技术的不断进步，中药现代化和走向世界指日可待。
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