婴儿血症遗传要素研究

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影响新生儿高未结合胆红素血症的遗传因素除主要有血型不合外，近年来的研究主要集中在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 1A1 ( uridine-diphosphate-glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1 ) 基因突变［1］、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶( glucose-6-phosphate dehydro-genase，G6PD) 基因突变［2］和有机阴离子转移因素2［3］( organic anion transporter 2，OATP2) 等方面。在对 UGT1A1 Gly71Arg、UGT1A1 TATA 盒和 G6PD 基因突变与新生儿高未结合胆红素血症关系的研究中，国内外不同地区的学者所得出的结论有较大的差异［4-6］。为了解影响深圳地区新生儿高未结合胆红素血症发生的遗传因素，本研究检测了本地区 72 例高未结合胆红素血症患儿及 65 例正常新生儿的UGT1A1 基因启动子 TATA 盒、外显子 1( Exon 1) 和外显子 5( Exon 5) 及本地区两种主要 G6PD 突变基因型，现报道如下。

1 资料与方法

1． 1 研究对象

72 例高未结合胆红素血症患儿均为 2008 年 1 月至2011 年 5 月间入住我院新生儿科的足月新生儿( 病例组) ，另选取 65 例本市其他医院产科病房的正常足月新生儿为对照组，均为汉族。ABO、Rh 血型不合者，早产、低出生体重儿，巨大儿及有其他疾患如缺氧窒息、败血症等除外。两组间胎龄、母乳喂养率、出生体重等差异无统计学意义。所有病例符合第 4 版《实用新生儿学》新生儿病理性黄疸的诊断标准，并排除高直接胆红素血症［7］。

1． 2 方法

1． 2． 1 材料 抽取 2 mL EDTA 抗凝静脉血，用DNA 抽提试剂盒( QIAGEN 公司) 提取全血白细胞基因组 DNA，－20℃保存基因组 DNA。根据人类基因文库数据，采用 Primer Premier 5．0 引物设计软件，设计 UGT1A1 基因启动子 TATA 盒、Exon 1 和 Exon 5，G6PD 基因 Exon 12 和 β-actin 阳性对照共 5 对引物。引物序列及相关参数见表 1。本研究参考序列 Gen-Bank 登录号为 NC_000002． 11 和 NM_000402． 3。

1． 2． 2 TATA 启动子、Exon 1、Exon 5 和 G6PD 基因扩增体系及相应程序 PCR 反应体系( 总体积50 μL) : ddH2O 36． 75 μL，10 × Buffer( 含 Mg2 +) 5．0 μL，dNTP( 2． 5 mmol / L) 4． 0 μL，Ex Taq 酶 ( 5 U / μL)0． 25 μL，上、下游引物 ( 10 μmol / L) 各 1． 0 μL，模板 2． 0 μL。PCR 反应程序: 95℃预变性 10 min; 然后 94℃变性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃ 延伸分别为45 s、45 s、40 s、30 s，35 个循环; 最后 72℃ 延伸10 min，10℃ 延时。

1． 2． 3 PCR 产物测序 UGT1A1 基因 ( Exon 5、Exon 1) 和 G6PD 基因采用 PCR 产物正向测序，UGT1A1( TATA 盒) 则采用 PCR 产物反向测序，对于发现突变位点的 A( TA) 6TAA ＞ A( TA) 7TAA、Exon1 211G ＞ A、G6PD 1376 G ＞ T 和 G6PD 1388 G ＞ A 4个基因，分别重复测序。

1． 2． 4 克隆验证 针对突变位点 Exon 1 211G ＞ A和 TATA 盒插入突变各选5 例样本，G6PD 1376 G ＞ T和 G6PD 1388 G ＞ A 各选 2 例样本进行克隆构建。连接使用 Promega pGEM-T easy vector，连接反应体系为 2 × Ligation Buffer 5 μL，pGEM-T easy vector0． 5 μL，T4 Ligase( 3 U / μL) 1 μL，PCR 产物 3． 5 μL。上述连接产物转化 DH5α 感受态细胞，挑取单个克隆子并进行测序，测序结果与 PCR 产物测序结果进行对比。

1． 3 统计学分析

用 SPSS 17．0 统计软件进行数据分析。基因型频率、等位基因频率采用 χ2检验。UGT1A1 Gly71Arg基因多态性、UGT1A1 TATA 盒基因多态性和 G6PD基因突变对新生儿高未结合胆红素血症影响的优势比( odds ratio，OR) 和 95% 可信区间( CI) 用二分类变量 logistic 回归分析，P ＜0． 05，OR ＞3，95% CI 值不包含1 为差异有统计学意义。

2 结果

2． 1 PCR 产物分析

病例组和对照组样本的基因型通过 PCR 产物测序确定，有突变位点的样本进行克隆构建，其克隆子测序结果与 PCR 产物测序结果完全一致。

2． 2 两组 UGT1A1 Gly71Arg 多态性基因型分布及等位基因频率的比较

病例组和对照组 UGT1A1 Gly71Arg 多态性的基因型 分 布 差 异 有 统 计 学 意 义 ( χ2= 22． 278，P ＜ 0． 01) ; 病例组 Arg 等位基因频率明显高于对照组( χ2= 9． 584，P = 0． 002) 。见表 2。2． 3 两组 UGT1A1 TATA 盒多态性基因型分布及等位基因频率的比较病例组和对照组UGT1A1 TATA 盒多态性的基因型分布差异无统计学意义( χ2= 0． 887，P = 0． 394) ;病例组 A( TA) 7TAA 等位基因频率与对照组比较差异亦无统计学意义( χ2= 0 ． 790 ，P = 0 ． 374 ) 。见表 3。

2． 4 UGT1A1 Gly71Arg 基因多态性对新生儿高未结合胆红素血症发生的影响

UGT1A1 Gly71Arg 基因多态性对新生儿高未结合胆红素血症发生的 OR 值为 5． 468，95% CI 为2． 274 ～ 12． 818，P ＜ 0． 001，提示 UGT1A1 Gly71Arg基因突变是新生儿高未结合胆红素血症发病的危险因素。见表 4。

2． 5 UGT1A1 TATA 盒基因多态性对新生儿高未结合胆红素血症发生的影响

UGT1A1 TATA 盒基因突变多态性对新生儿高未结合胆红素血症的 OR 值为0．668，95%CI 为0．266 ～1． 778，P = 0． 440，提示 UGT1A1 TATA 盒基因突变不是新生儿高未结合胆红素血症发病的危险因素。见表5。

2． 6 G6PD 基因突变对新生儿高未结合胆红素血症发生的影响

G6PD 基因突变对新生儿高未结合胆红素血症的OR 值为 5． 081，95% CI 为 1． 070 ～ 24． 133，P = 0． 041，提示 G6PD 基因突变是新生儿高未结合胆红素血症发病的危险因素。见表6。

3 讨论

通常认为 UGT1A1 活性的缺陷是引起新生儿高未结合胆红素血症的一个关键因素［1］。未结合胆红素进入肝细胞后，需要在肝细胞内经清除胆红素的关键酶，即 UGT1A1 的作用下，与葡萄糖醛酸结合成为水溶性的结合胆红素而排出体外［8-9］，若UGT1A1 活性下降，导致肝脏内未结合型胆红素向结合型胆红素的转化过程发生障碍，从而引起以血清未结合型胆红素水平升高为主的临床症状。

UGT1A1 的编码基因定位于染色体 2q37，现已发现30 多个 UGT1A1 基因突变位点，分别位于启动子区域和 5 个外显子中［10-12］。UGT1A1 基因变异包括两种类型: ( 1) TATA 盒 TA 突变型，欧洲和亚洲人常见有 TA 插 入，使 正 常 A ( TA) 6TAA 突 变 为A ( TA) 7 TAA［10，13］，非洲血统人群中存在5 个和8 个TA 重复子。( 2) 单碱基突变中 UGT1A1 的 Gly71Arg( 即 Exon 1 211G ＞ A) 较 为 多 见，另 外 UGT1A1Pro229Gln、第 4 外显子 Arg367Gly、第 5 外显 子Tyr486Asp 的突变等也有报道［9，14］。

国外 Akaba 等［1］报道 Gly71Arg 突变高频率与日本、朝鲜及中国人中较高的新生儿高胆红素血症发生率有关。2002 年 Yamamoto 等［15］报道日本新生儿高胆红素血症 Gly71Arg 突变等位基因频率明显高于对照组，但此突变在高加索白人中很少见［16］。本研究表明 UGT1A1 Gly71Arg 突变等位基因频率明显高于对照组的基因频率，表明 UGT1A1Gly71Arg 基因突变对新生儿高未结合胆红素血症的发生有显著性影响。1

998 年 Beutler 等［17］对欧洲血统的高加索白人、亚洲人、非洲血统美国人进行 UGT1A1 启动子区TA 重复数的研究，发现白种人 A( TA) 7TAA 等位基因频率为 0． 387，亚洲人为 0． 16，非洲血统人群中存在 5 个和 8 个 TA 重复子的启动子突变。本研究中病例组 A ( TA) 7 TAA 等位基因频率与对照组差异无统计学意义。在国内，研究 UGT1A1 Gly71Arg、UGT1A1 启动子区 TA 重复数、G6PD 基因突变与新生儿高未结合胆红素血症发生间的关系的课题较少。2005 年傅雯萍等［4］报道 G6PD 缺陷同时存在 Gly71Arg 突变使新生儿高胆红素血症发病增加，而单一 G6PD 缺陷或单一存在 Gly71Arg 突变与高胆红素血症发病无关。2008 年傅雯萍等［5］报道 UGT1A1 TATA 盒基因突变与新生儿高胆红素血症的发病无关。田桂英等［6］认为 UGT1A1 基因 G1y71Arg 变异可能是汉族母乳性新生儿黄疸的发病原因之一。本研究显示UGT1A1 Gly71Arg 突变和 G6PD 突变两者可能都是新生儿高未结合胆红素血症的发病原因，而UGT1A1 基因启动子 TATA 盒基因突变与之无关。本研究结果与上述国内研究报道类似，但不尽相同，可能因研究对象的地域分布不同而略有差异。