洛伐他丁和膦胺霉素对烟草HMGR和DXR活性的影响
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摘要：HMGR和DXR分别是萜类生物合成途径――MVA和MEP途径的2个关键酶。本研究对烟草施用HMGR和DXR的专一抑制剂洛伐他汀（MEV）和膦胺霉素（FSM），测定烟草Nthmgr、Ntdxr、FPPS和GGPPS基因转录水平、HMGR和DXR酶活性变化。结果表明，抑制剂处理后烟草内源基因NtHMGR和NtDXR表达量在24h受到明显抑制；HMGR和DXR活性均在一定时间内受到抑制。MEV和FSM能有效抑制烟草中HMGR和DXR的活性。
关键词：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）；1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）；洛伐他汀；膦胺霉素
中图分类号：TS411文献标识码：A
植物萜类化合物的生物合成至少有2条途径。细胞质中的甲羟戊酸途径（mevalonate pathway，MVA途径）；质体中的2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP途径）[1]。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR）和1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）分别是MVA和MEP上游途径中的2个关键酶[2，3]。
洛伐他丁（mevinolin，MEV）是HMGR的专一抑制剂，它能与HMGR的活性部位结合，竞争性抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）转变成甲羟戊酸（MVA）[4，5]；膦胺霉素（fosmidomycin，FSM）是DXR的专一抑制剂，它能阻断1-去氧木糖-5磷酸（DXP）合成2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）[6，7]。
1材料与方法
1.1材料
野生型烟草“中烟90”种子，由广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心保存。
1.2主要仪器与试剂
MEV（美国Sigma公司）；FSM（美国Sigma公司）； CFX96荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；UV-1800型紫外分光光度计（日本岛津公司）。
1.3方法
1.3.1考察抑制剂喷施浓度和取样时间
考察喷施浓度和取样时间：播种烟草种子，温室培养至三叶一心期（苗龄约6周），进行喷施。植株分为4组，分别喷施MEV、MEV溶剂对照、FSM、纯水对照，连喷3d，观察植株生长情况，取致植株全部白化或变形的最低浓度为抑制剂最适浓度。未处理烟草长至6个月，喷施最适浓度抑制剂，喷施前采样作为0h样品，喷施处理6h、12h、24h、36h、48h后各采集叶片100mg，提取RNA，荧光定量PCR检测。引物见表1，引物退火温度筛选、标准曲线建立方法参考文献[8]。反应条件为：95℃ 30s；95℃ 3s，60℃ 5s，40个循环。采用比较Ct值法[9]计算基因相对表达量F，公式为F=2-Ct，其中Ct=（待测组目的基因Ct值-待测组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值）。0h样品检测NtHMGR、NtDXR基因表达量，MEV及对照喷施组检测NtHMGR基因的表达量，FSM及对照喷施组检测NtDXR基因表达量。
1.3.2基因表达量和酶活性的测定
用考察浓度后的抑制剂喷施苗龄6个月的烟草，测定烟草内源基因NtHMGR和NtDXR、下游基因FPPS和GGPPS表达量。喷施前采样作为0h样品，喷施处理24h、36h、48h后各采集烟草叶片100mg。酶活性的测定根据底物专一性原理，具体测定方法参考文献[10]。烟草叶片于MEV喷施处理后12h、24h、48h后采集，FSM喷施处理后24h、48h后采集。
2实验结果
2.1确定MEV和FSM喷施烟草最适浓度和取样时间
MEV喷施烟草后，叶片呈现皱缩的现象，如图1，使用不同浓度MEV喷施后，烟草皱缩苗率有所不同，用350μmol/L喷施后，烟草皱缩苗率达到57.5%，而400μmol/L喷施后皱缩苗率仅为45%，溶剂喷施后叶片没有出现皱缩（图2）。故采用350μmol/L的MEV为最适喷施浓度。
a.喷施MEV后的皱缩苗b.喷施溶剂后的正常苗图1350μmol/L MEV和溶剂喷施后烟草幼苗表型对比
图2不同浓度MEV喷施烟草幼苗后的皱缩苗率
FSM喷施烟草后，叶片呈现黄化及白化的现象，如图3，使用不同浓度FSM喷施后，烟草黄白苗所占比例有所不同，用75μmol/L喷施后，黄苗率达到67.5%，用100μmol/L喷施后，白苗率达到82.5%，用150μmol/L和200μmol/L喷施后，白苗率都达到95%，其余5%均出现黄化（图4），说明150μmol/L FSM处理烟草即可达到效果，故采用150μmol/L为最适喷施浓度。
a.喷施FSM后的白化苗b.喷施纯水后的正常苗图3150μmol/L FSM和纯水喷施后烟草幼苗表型变化
图4不同浓度FSM喷施烟草幼苗后的黄白苗率
专一抑制剂喷施烟草后，对应的基因表达量会随着时间的变化有所降低和升高。NtHMGR表达量在36h达到最高值，为未处理的4.34倍，如图5-a。NtDXR基因表达量在36h达到最高值，为未处理的6.26倍，如图5-b。
根据图5变化趋势确定基因表达量采样时间为24h、36h、48h，HMGR酶活性为12h、24h、48h，DXR酶活性为24h、48h。a.MEV喷施烟草NtHMGR基因表达量变化b.FSM喷施烟草NtDXR基因表达量变化图5专一抑制剂喷施烟草后NtHMGR和NtDXR表达量变化
2.2喷施MEV和FSM对烟草基因表达量和酶活性的影响
2.2.1基因表达量变化
MEV喷施烟草后，NtHMGR表达量在36h达到最高值，如图6-a。FSM喷施后，NtDXR基因表达量在36h有一个低谷，36～48h出现升高，如图6-b。MEV喷施后，FPPS与GGPPS表达量在36h达到最高值，在48h回到原水平，与NtHMGR表达变化呈现一致的趋势，如图6-c。FSM喷施后，FPPS表达量缓慢升高，GGPPS表达量变化不大，如图6-d。图6MEV及FSM喷施野生型烟草后基因表达量变化
2.2.2HMGR和DXR活性变化
烟草在喷施专一抑制剂MEV后，HMGR活性在12h、24h和48h分别是溶剂对照的0.82倍、0.80倍和1.29倍。12h和24h时HMGR活性受到抑制，48h HMGR活性出现了反馈性的提高，如图7-a。喷施FSM后，烟草内的DXR活性在24h和48h分别是溶剂对照的1.3倍和0.485倍，DXR活性在48h受到抑制，如图7-b。
3讨论
作为植物中萜类生物合成途径MVA途径和MEP途径中关键酶的抑制剂，洛伐他汀（MEV）和膦胺霉素（FSM）已经被广泛应用于HMGR和DXR的调控研究[11，12]。本文对烟草施用MEV和FSM，抑制了HMGR或DXR酶活性，烟草内源基因NtHMGR、NtDXR，下游基因FPPS、GGPPS表达量在一定时间内有所提高。a.烟草喷施MEV和溶剂对照HMGR活性比较b.烟草喷施FSM和溶剂对照DXR活性比较图7烟草喷施抑制剂和溶剂对照酶活性含量比较
喷施抑制剂MEV后，烟草HMGR活性在12～24h受到抑制后，NtHMGR基因及下游FPPS、GGPPS基因表达水平均出现反馈性提高，从而弥补了HMGR由于受抑制而降低的现象，增加HMGR的合成，在48h时测定的HMGR活性回升至比对照更高的水平，推测此时NtHMGR基因转录由于已满足HMGR的合成需求，因此又回落至处理前水平，下游基因表达水平也在此时回落。Joseph和Ross[13]研究发现，在烟草细胞培养液中添加一定浓度的MEV，可使细胞内HMGR活性比对照减少33%以上，本实验烟草喷施MEV后HMGR活性在24h内受到抑制。喷施抑制剂FSM后，烟草DXR活性在24h并未受到明显影响，NtDXR基因及下游FPPS、GGPPS基因表达水平也与对照持平，在48h时DXR活性受到抑制，NtDXR基因表达出现一个明显上升的趋势，说明此时基因转录水平出现了反馈性的提高，下游FPPS基因表达水平也随之逐渐上升。用HMGR和DXR的专一抑制剂处理烟草后，相应的酶基因及部分下游基因表达水平有明显增加，表明烟草体内对抑制剂处理具有明显的反馈补偿作用，由于抑制剂抑制了IPP合成途径中关键酶的活性，导致IPP来源不足，细胞通过增加关键酶基因转录水平的表达来抵消抑制剂的作用。
4结语
本文结果表明，通过对烟草施用MVA途径和MEP途径中关键酶HMGR和DXR的专一抑制剂洛伐他汀（MEV）和膦胺霉素（FSM），在一定时间内抑制了HMGR或DXR酶活性，烟草内源基因NtHMGR、NtDXR，下游基因FPPS、GGPPS表达量在一定时间内有所提高，该结果为利用MEV和FSM抑制植物萜类的合成，以及进一步阐明萜类化合物2条生物合成途径间的协同作用奠定了良好的实验基础。
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