浅论黄孢原毛平革菌产木素过氧化酶

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摘要：本实验先采用正交设计法对黄孢原毛平革菌产木素过氧化物酶的培养条件进行优化，再通过放大实验对最佳培养条件进行验证，最终得出结果：最佳培养条件主要参数为：pH4.5、葡萄糖：10g/L、酒石酸铵：0.2g/L、吐温-80：0.2g/L。关键词：黄孢原毛平革菌，木素过氧化酶，藜芦醇黄孢原毛平革菌，(Phanerochaetechrysosporium，简称P.Chrysosporium)是一种丝状真菌,区别于单细胞微生物。菌对底物进行降解时,其次生代谢活动对反应环境的要求较为苛刻,需要一定的营养组分和严格的偏酸环境(pH约4.5左右)。其对底物（染料）的降解主要是依靠其次生代谢产物——胞外木素分解酶系。胞外木素分解酶系的发现是利用黄孢原毛平革菌降解木质素研究的重大进展。该酶系是一组同功酶，由两类酶构成：木素过氧化物酶（Ligninperoxidases，简称Lip）和锰过氧化物酶（Mndependentperoxidases，简称Mnp）。kirkTK[1]小组于1983年首次从黄孢原毛平革菌培养基中发现木素过氧化物酶，并发现该酶与赖锰酶（Mnp）、漆酶（Laccase）构成木素降解酶体系，该酶系有一个很重要的特点，就是它对底物的氧化是高度非特异性的，广泛研究表明，该菌可以降解多种染料，包括偶氮类、三苯甲烷类、杂环类、聚合染料等，在染料废水处理方面具有广泛的应用前景[2]，目前该菌已成为这类研究的模型菌种。在国外，利用黄孢原毛平革菌降解各种结构各异的污染有机物已经成为一个非常热门的研究方向，他们已在木素降解酶系的生产、酶系的性质、酶系的分子生物学研究和利用酶系降解有机污染物方面作了大量的工作。而我们国内的研究却起步比较晚，开始于九十年代初，主要在木素过氧化物酶的生产条件和木素酶漂白纸浆废水方面进行了一些探索。[3]Pasti[4]已完成了P.Chrysosporium产生的Lip对22种偶氮染料的氧化速率的测定。而且在整个合成阶段Lip的合成量要比Mnp大得多，再加上Lip能降解木质素的模型物，因此Lip在木质素的降解中起着主导作用，成为后来的主要研究酶。[5]本文主要通过对黄孢原毛平革菌培养条件进行优化--正交设计法对培养基组分进行优化，再通过放大实验对最佳培养基条件进行验证比较。从而最终确定对黄孢原毛平革菌产木素过氧化酶最有利的培养基方案。1材料和方法1.1材料1.1.1试验材料菌种黄孢原毛平革菌(中国科学院微生物所5.776)。斜面培养基：马铃薯琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯煮汁1000mL，蔗糖20g，琼脂20g，pH4.8～6.0。基本培养基：葡萄糖，酒石酸铵，吐温-80，以上成分的量按正交表设计添加。醋酸缓冲液10mmoL/L（pH4.5），KH2PO42g/L，VB11mg/L，0.5M藜芦醇溶液1.0mL/100mL，微量元素混合液70mL/L，注意此时分不同pH值（4.0、4.5、6.0）。微量元素混合液（L-1）：氨基乙酸：0.5g，MgSO4·7H2O：3g，NaCl：11g，FeSO4·7H2O：0.1g，CoSO4：0.1g，CaCl2·2H2O：0.1g，ZnSO4·7H2O：0.19g，CuSO4·5H2O：0.01g，AlK（SO4）2·12H2O：0.01g，H2BO3：0.01g，Na2Mo·2H2O：0.01g，MnSO4·H2O：0.01g。0.1标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先于100～105℃烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。斐林试剂1.1.2仪器设备温控摇床，太仓市华美生化仪器厂；紫外可见分光光度计（UV-9100），北京市瑞利分析仪器公司。1.2方法1.2.1基本培养条件PDA培养基培养5d的菌丝体加入到无菌水当中，适当搅拌，进行孢子计数。然后按照不同的量接入到250mL三角瓶中，三角瓶装液量100mL，接种量（以孢子计）1.0×106mL-1；培养温度：37℃，转速：150r/min，培养6d。1.2.2酶活测定方法木素过氧化物酶（Lip）活力的测定（用氧化黎芦醇的速率表示）。1mL反应液中含0.2mL藜芦醇溶液、0.4ml酒石酸缓冲液（250mmoL/L，pH3.0）、0.4mL培养液或稀释液、20μLH2O2溶液（20mmoL/L），于30℃反应2min，测310nm波长下的吸光度（ξ）变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化黎芦醇产生1μmoL/L黎芦醛所需的酶量。1.2.3葡萄糖残糖测定（斐林法）[6]1.2.4菌体干重测在发酵过程中，每隔一天时间从发酵罐中取一定体积的发酵液，用已称重的干燥滤纸进行过滤。而后将滤纸（连带菌体）在100℃左右烘箱中烘至恒重，减去滤纸重量，即得菌体干重。1.2.5放大培养利用最优方案及比拟放大对该最佳方案进行放大试验，记录整个过程中pH、DO2、残糖量、菌体干重、木素过氧化酶酶活的变化。2结果与讨论2.1确定最佳培养时间在静置和摇床培养条件下测定黄孢原毛平革菌5.776产木素过氧化物酶（Lip）活力随培养时间的变化，结果如图1，Lip活力在第6d出现峰值，达到69.1U/L。Lip属于次级代谢产物，与菌体生长不同步[7]，且Lip的合成与菌体生长是非偶联的。由此确定第6d是研究培养条件改变对Lip活力影响最适时间。[8]图1：对照酶活变化曲线2.2正交表的选择选取pH、葡萄糖、酒石酸铵、吐温-80为考察因素，每个因素取3个水平，按正交表L9（34）来设计实验[9]，正交表如下：表1正交试验因素水平的安排[10]因素水平ApHB葡萄糖（g/L）C酒石酸铵（g/L）D吐温-80（g/L）1233.04.56.02.05.010.00.20.51.00.20.51.02.3数据分析从上述结果可以做出判断：在其它条件相同的情况下，培养基中碳源（葡萄糖）丰富时更有利于黄孢原毛平革菌产木素过氧化酶，相比其他，其酶活性高出2～3倍。同时，根据喻国策等[11]的研究也表明，木质素降解酶的产生受氮浓度条件影响，低氮浓度有利于酶的产生，高氮浓度则抑制酶的产生。2.3.1数据处理与分析表2正交试验结果分析表因素水平ABCDXi酶活力（U/L）12345678912312312311122233321313232131223112326.157.731.818.724.022.791.978.181.0Lip含量K1K2K3Sk1k2k3R136.7159.8135.5125.145.653.3 45.28.1115.665.4250.06106.838.521.883.761.9157.4126.9147.7161.952.542.349.210.2172.3128.6131.1401.557.442.943.714.5总和432ST=6795.32.3.2变量分析表3Lip活力方差分析表方差来源平方和自由度均方F值显著性ABCD125.065977.51161.89418.98222262.532988.7680.95204.4947.801.293.27__不显著不显著F0.05（2，2）=19.0；F0.025（2，2）=39.0[12]2.4确定最优培养基方案2.4.1确定最优培养基配方从极差和方差分析中看出影响黄孢原毛平革菌产木素过氧化物歧化酶的因素的主次顺序为葡萄糖浓度（碳源）pH，其中酒石酸铵浓度和吐温-80浓度对木素过氧化物歧化酶活力的增加的影响不明显，葡萄糖浓度的影响则为很显著。而pH对酶活力影响很小（误差）。所以正交实验的最佳培养基条件为A2B3C1D1，即pH在4.5，葡萄糖（碳源）含量为10.0g/L，酒石酸胺（氮源）含量为0.2g/L，吐温-80含量为0.2g/L时为最优培养基方案。2.4.2放大试验利用最优方案对该实验进行放大试验，具体方案如下：培养液体积：3L、pH4.5、葡萄糖：10g/L、酒石酸铵：0.2g/L、吐温-80：0.2g/L、醋酸缓冲液10mmoL/L（pH4.5），KH2PO42g/L，VB11mg/L，0.5M藜芦醇溶液（VA）10mL/L，微量元素混合液70mL/L、温度：37°C、接种量：1.0x109个孢子/L、转速：80r/min，培养时间为8d，测定酶活方法同上，同时，测定菌体干重、DO2值、pH变化以及残糖含量，结果如下：综合上述两图(图2和图3)可知，黄孢原毛平革菌生长的迟缓期很短，在曲线中基本上无法体现出来。不过对于一般生产周期较短的真菌而言，这是比较正常的。而菌体的对数生长期则较明显（1～3d），此过程中黄孢原毛平革菌以最大的速率生长和分裂，菌体数量呈对数增加，而且菌体内各成分也按照同样的比例有规律的增加，由于黄孢原毛平革菌是好氧微生物，所以在生长的同时大量的消耗氧气，导致DO2值明显下降。随着菌体的生长，也伴随着生长代谢产物的生成，对于黄孢原毛平革菌来说，主要的代谢产物是过氧化物酶和乙二醛氧化酶。随着营养物质的消耗，代谢产物积累和pH等环境的变化，逐步不宜黄孢原毛平革菌的生长，导致生长速率逐渐降低，从而进入稳定期，这个阶段也就是黄孢原毛平革菌产木素过氧化酶的最佳时间，即培养过程中的4～7d，此阶段木素过氧化酶的酶活性最高，具体出现在培养的第7d，酶活高达110U/L，比同时期摇床培养最高酶活（91.9U/L）高接近20U/L。随着氮源（酒石酸铵）的耗尽，菌体也开始死亡，自溶，从而造成pH和溶氧的回升。3结论黄孢原毛平革菌产木素过氧化酶的最佳培养条件为：pH在4.5，葡萄糖（碳源）含量为10.0g/L，酒石酸胺（氮源）含量为0.2g/L，吐温-80含量为0.2g/L。但在实验过程中我们也发现，在氮源耗尽时还有相当量的葡萄糖存在，约在6g/L左右，所以可考虑适当降低培养基中葡萄糖的含量，以减少资源浪费，增加效益。作者简介：郑锐东（1982-），男，学士，揭阳职业技术学院生物工程系助教，主要从事微生物工程的相关工作。参考文献：[1]丁佐龙,邢邦启.木素过氧化物酶合成的部分影响因素[J].合肥工业大学学报(自然科学版),1998,6(21):1～2.[2]章燕芳,李华钟,华兆哲等.黄孢原毛平革菌合成的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶及其菌球在染料脱色过程中的作用[J].过程工程学报,20__,3(2):246.[3]梁园园,张朝晖,周哓云.黄孢原毛平革菌木素降解酶系的研究进展[J].工业微生物,20__,4(33):42～43.[4]PastiMB,PaszczynskiA,GoszczynskiS,etal.InfluenceofAromaticSubstitutionPatternsonAzoDyeDegradabilitybyStretomycessp.andPhanerochaetechrysosporium[J].Appl.Environ.Microbiol.,1992,58(11):3605～3613.[5]张朝晖,夏黎明,林建平等.黄孢原毛平革菌培养合成木素过氧化物酶研究[J]。浙江大学学报(自然科学版)，1999,2(33):132～133.[6]华南理工大学等.工业发酵分析[M].北京:中国轻工业出版社,20__.16～17.[7]刘稳,李杨,高培基等.过氧化物酶研究进展[J].纤维素科学与技术,20__,8(2):50～64.[8]杨晓宽,杜连祥,路福平等.白腐菌产锰过氧化物酶培养基的优化.生物技术,20__,3(14):49.[9]武继玉.应用概率统计[M].北京:航空工业出版社,1994.254～261.[10]刘心平.多水平正交试验用表的逻辑设计[J].摇测摇控,1995,4(17):38～48.[11]喻国策,文湘华,李东锋等.黄孢原毛平革菌在多种氨氮浓度下木质素降解酶的产生[J].环境科学学报,20__,6(23):804.[12]肖攸南等.概率论与数理统计[M].北京:北京大学出版社,20__.附表5.