应用鲎试剂凝胶法检查抗狂犬病血清中细菌内毒素的研究
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作者:薛向光，白春杰，柳春红，夏天瑶，张梅，高峰
【摘要】 目的 研究鲎试剂凝胶法与家兔测温法检测抗狂犬病血清不同生产阶段产品中细菌内毒素与热原试验结果的相关性，来确定抗狂犬病血清细菌内毒素的限量标准。方法 确定内毒素的限值和供试品溶液最大有效稀释倍数；制备供试品溶液在最大有效稀释倍数下作干扰试验；确认无干扰作用后，用鲎试剂凝胶法检测抗狂犬病血清不同生产阶段产品进行细菌内毒素的限量检查，并与家兔测温法结果相对比。结果 连续检查十批抗狂犬病血清制品细菌内毒素的限量符合规定，鲎试剂凝胶法与家兔测温法试验符合率100%。结论 用鲎试剂凝胶法对抗狂犬病血清不同生产阶段产品进行细菌内毒素的限量检测为快速、准确，可用鲎试剂凝胶法代替家兔测温法检测抗狂犬病血清制品中热原。
工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每个内毒素浓度平行做4管，另外2管作为阴性对照管。按凝胶法鲎试剂说明书检查操作进行，封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入(37±1)℃的恒温器中，保温(60±2)min。然后取出观察结果。
1.2.1.4 凝胶法干扰试验 取3批经热原检查法检测合格的抗狂犬病血清，根据MVD将抗狂犬病血清溶液稀释做为3批供试品溶液，每批取36支鲎试剂，其中16支根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用供试品溶液溶解，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每个内毒素浓度平行做4管，作为干扰试验系列（E/S系列）；而另16支，也根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每个内毒素浓度平行做4管，作为鲎试剂标示灵敏度的对照系列（E系列）；把剩余4管，2管作为供试品溶液检查（S），另外2管作为阴性对照（NC）。按凝胶法鲎试剂说明书检查操作进行，封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入(37±1)℃的恒温器中，保温(60±2)min。然后取出观察结果。
1.2.1.5 凝胶限量试验 将抗狂犬病血清10批制品，按MVD稀释作为供试品溶液，每批取鲎试剂8支，其中2支作为供试品溶液检查管（MVD-S）；2支作为供试品阳性对照管（MVD-PPC）；2支作为阳性对照管（PC）；2支作为阴性对照管（NC）。按凝胶法鲎试剂说明书检查操作进行，封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入(37±1)℃的恒温器中，保温(60±2)min。然后取出观察结果。
1.2.1.6 结果判断标准 将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁画脱者为阴性。
1.2.2 家兔测温法 （依照《中国药典》2005年版 三部附录Ⅻ D检查）［2］
1.2.2.1 试验前准备和操作 家兔在检查前至少1h开始停止给食并置于固定架上，直至检查完毕。挑选预测体温合格的家兔3只，自家兔耳静脉缓缓注入规定剂量的抗狂犬病血清，每隔30min测体温一次，共测6次，根据体温升高均值和总和判定结果。
1.2.2.2 注射剂量 按家兔体重每1kg注射3.0ml。
1.2.2.3 结果判断标准 在3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.4℃，认为供试品的热原检查符合规定；反之认为不符合规定。
2 结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核试验 将18支鲎试剂试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，观察凝胶是否变形，记录结果。计算反应终点浓度的几何平均值，即鲎试剂灵敏度的测定值λc=0.52EU/ml，由于0.5λ≤λc≤2λ，本批鲎试剂的灵敏度标示值正确。结果见表1。
2.2 凝胶法干扰试验 将每批36支鲎试剂试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，观察凝胶是否变形，记录结果。计算E系列和E/S系列的反应终点浓度的几何平均值，即Es和Et值，由于Es在0.5～2λ及Et在0.5～2Es之间，则供试品在该浓度下无干扰作用，结果见表2。
2.3 抗狂犬病血清二次除菌过滤后细菌内毒素检查和热原检查结果 将十批抗狂犬病血清，按MVD稀释作为供试品溶液，将每批8支鲎试剂试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，观察凝胶是否变形，判断结果。并与热原检查法结果比较，见表3。 表1 鲎试剂灵敏度复核试验
表2 三批抗狂犬病血清干扰试验
表3 十批抗狂犬病血清细菌内毒素检查和热原检查结果比较
3 讨论
鲎试剂凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测内毒素的方法。热原是指在临床上能使哺乳类动物产生热原反应的物质；细菌内毒素是革兰阴性细菌细胞壁的产物，具有多种生物活性，其化学结构是脂多糖，为热原的主要来源，能引起机体发热。热原与细菌内毒素的关系是包含与被包含的关系，在药品检定范畴，可以说无细菌内毒素就无热原；在药品生产范畴，控制细菌内毒素就是控制热原。药品和生物制品用细菌内毒素检查取代热原检查已成为必然的趋势。传统家兔测温法不仅检测时间长，样品用量多，并存在较多的干扰因素。另外，家兔的人工饲养和居住条件等经费大，成本高，也存在一定问题。鲎试剂是一种生物制剂，鲎试剂凝胶法检查细菌内毒素具有快速、简便、经济、灵敏度高、再现性好等优点，已广泛应用于《中国药典》2005年版 三部生物制品的检定中［2］。本实验通过对鲎试剂灵敏度复核试验、三批抗狂犬病血清凝胶法干扰试验和十批抗狂犬病血清细菌内毒素检查，结果表明，供试品溶液和检查用水对细菌内毒素检查无干扰作用，制品的鲎试剂凝胶法检查结果与家兔测温法结果相同，两方法比较，结果符合率为100%。生物制品检测的持续性和复杂性等决定了要对每个指标的检测做实际验证实验［3］。两者检测结果一致，表明应用鲎试剂凝胶法对抗狂犬病血清不同生产阶段产品进行细菌内毒素检测和质量控制是可行的。此方法快速、准确，能作到时时监控，能获得即经济又安全、有效和可控的优质产品。
【参考文献】
1 Moesby L，Hansen EW，Christensen JD.Endotoxin testing of proteins for administration using the Mono Mac 6 assay.J Clin Pharm Ther，2000，25(4):283-289.
2 国家药典委员会.中国药典.2005年版.2005，三部：163，附录77-79.
3 王军志.生物技术药物研究和质量控制.北京：科学出版社，2002，135.