二苯乙烯苷对沟鲶生长体色的影响

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在高密度集约化人工养殖条件下，斑点叉尾( Ictalurus punctatus) 体色异常问题( 白化和黄化) 频频发生。 体色异常时常伴随生长减缓、免疫力降低、肉质下降等诸多问题，其市场价值大大降低［1］。研究表明斑点叉尾 体色异常与其皮肤中黑色素含量密切相关［2］。进一步的研究揭示动物体内黑色素合成的速度和产量是由酪氨酸酶( Tyrosi-nase，TYR) 的表达和活性决定的，而二苯乙烯苷( THSG) 对酪氨酸酶有显著的激活作用［3 －4］。THSG 又称芪多酚，属多羟基芪类化合物，是一种纯天然物质，广泛存在于藓类和高级植物中［5］。THSG 对酪氨酸酶有显著的激活作用，原因是 THSG 能够使黑色素生成过程中的底物左旋多巴( L －3，4 － dihydroxy － phenylalanine，L － DOPA) 的结构或构象发生较大改变，使 L － DOPA 与 TYR 碰撞的有效分子数增加，提高 L － DOPA 与 TRY 的亲和力。THSG 可以显著提高机体黑色素的合成能力，促进黑色素细胞增生［3］，但对于将其添加在饲料里是否可以改善机体体色尚未见报道。本试验借鉴前人的研究经验，在基础配方中分别添加不同含量 THSG，以不含 THSG 饲料作为对照组，饲喂斑点叉尾 ，研究 THSG 对其生长和酪氨酸酶活力、皮肤黑色素含量和分布等体色指标的影响，探讨将其添加在饲料中改善体色效果的可行性，以探寻解决鱼体体色变化的新方法。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 试验鱼

试验鱼苗购自湖北仙桃胡场某养殖场，运回武汉工业学院鱼类营养代谢实验室消毒，暂养并驯食2 周后开始正式养殖试验。试验分组时挑选体质健康、大小均匀、体色正常、平均体重( 15 ± 0. 5) g的斑点叉尾 ，随机分配到 15 个缸中，每缸中盛300 L 水，放鱼 15 尾，分别投喂 5 种不同的饲料，每个处理设 3 个平行组。

1. 1. 2 试验材料

试验用左旋多巴和黑色素标准品来自于美国Sigma 公司( 编号分别为 D9628 和 D9631) ，试验用THSG 由天津汇绿生物科技有限公司提供 ( 纯度50% ) ，网筛孔径为 80 目，重金属≤10 mg / kg，水分≤5. 0%，灰分≤0. 5%。各种饲料原料与预混料由湖北九星饲料有限公司提供。

1. 1. 3 试验饲料

以基础饲料为对照组，在基础饲料中分别添加0. 33% 、0. 67% 、1. 33% 、2. 67% 的 THSG，以膨润土作调节剂，制成 5 种等氮等能试验饲料，分别记为: Ctr、A、B、C、D( 见表 1) 。饲料原料均先粉碎后过 60 目筛，混合制粒，微量添加成分采取逐级扩大法混合均匀，制粒后风干冷藏备用，颗粒饲料粒径 1. 2 mm。

1. 2 饲养管理

试验在规格为 100 cm × 60 cm × 60 cm 的同背景色的玻璃水箱中进行。每日于 7: 00，18: 00 饱食饲喂 2 次。试验期间，每 2 日换 1 次水，保持水温( 25 ±3) ℃，溶氧 ＞6 mg/L，NH4－ N ＜ 0. 1 mg / L。养殖时间持续 6 周，试验前和试验结束时分别对试验鱼进行称重，试验结束时，统计成活数量并采样。

1. 3 生长指标的测定

死亡率 = ( 死亡数/总尾数) ×100%;增重率( WGR) = ［( Wt－ W0) /W0］ ×100%;饵料系数( FCR) = F/( Wt－ W0) ;式中: Wt为试验末鱼总体重( g) ，W0为试验初鱼总体重( g) ，F 为摄取饲料总重量( g) 。

1. 4 酪氨酸酶活力的测定

1. 4. 1 测定原理

在有氧的条件下，L － DOPA 在 TYR 作用下发生氧化生成棕褐色多巴醌，多巴醌在有氧的条件下迅速生成多巴红，多巴红在475 nm的条件下有明显的吸收峰，同时多巴红在转化为下一产物时速率要慢得多，故可在酪氨酸酶的存在下，用比色法测定多巴转化为多巴红的速率而测定酪氨酸酶的活力。

1. 4. 2 样品采集与处理

每组随机取鱼三尾，将其麻醉后在背鳍下方一侧取鱼皮若干，刮肉后剪碎，按 1 g 组织加 5 mL的比例分别加入 pH 6. 8 的磷酸缓冲液( PBS) ，冰浴匀浆，8 000 r/min 冰冻离心25 min，取上部清液即皮肤中酪氨酸酶提取液冰浴保存备用。取皮后的鱼迅速采血，将血液以 3 000 r/min 冰冻离心15 min，取上部清液即血液酪氨酸酶提取液，冰浴保存备用。

1. 4. 3 测定方法

参考宋琦如等［6］的方法，拟定本次试验酪氨酸酶活力的测定方法如下: 向比色皿中加入一定量的 L － DOPA ( 0. 012 mo1/L) 及 pH 6. 8 的 PBS 溶液，充分混匀，置于 30 ℃水浴中温育 10 min 后加入 H2O2和酶提取液，混匀，立即用 721 分光光度计于 475 nm 处测定吸光度 E。以在规定时间内( 10 min) 每分钟 E475 nm增加 0. 001 为 1 个酶活力单位( U) 。为了使溶液的吸光值不溢出分光光度计的量程，通过预实验设定皮肤和血液中酪氨酸酶测定时各种物质添加量见表 2。

1. 5 鱼皮肤中黑色素含量的测定

每组随机取鱼三尾，将其麻醉后在每条鱼体背鳍末端居中的位置取一块长宽均为 1 cm 的鱼皮，放于生理盐水中冰浴保存备用。参考 Pavlidisa等［7］的研究，拟定本次试验皮肤中黑色素含量的测定方法如下:( 1) 将鱼皮从生理盐水中取出，用蒸馏水清洗数次后，放入装有 5 mL 的 0. 2% NaOH 溶液的试管中，沸水浴煮 1 h，待至鱼皮完全融化。( 2) 称取 5 mg 的黑色素标准品，将其溶解于5 mL的 NaOH 溶液( 1mol / L) 和 30 μL 的 H2O2( 浓度 3%) 溶液中，沸水浴煮 30 min，待其完全溶解后定容于 100 mL 的容量瓶中，配制成 50 μg/mL的黑色素标准溶液。将黑色素标准溶液进一步稀释，分别配制成 1、4、7、10、13、16、20 μg/mL等不同浓度的黑色素标准溶液，用 UV2102C 紫外分光光度计在 340 nm 处测定各标准溶液的吸光值，绘制标准曲线。( 3) 将溶有鱼皮的溶液稀释 5 倍后，在 340 nm处测其吸光值，与标准曲线对比，计算出其黑色素含量。

1. 6 皮肤中黑色素分布的测定

每组随机取鱼 3 尾，将其麻醉后在每条鱼体背部居中的位 置 带 肉 取 一 块 长 约 1. 5 cm、宽 约0. 8 cm 的鱼皮，铺平固定后放入 Bouin 氏液中，24 h后制成组织切片，用光学显微镜观察不同倍数下黑色素的分布情况，并在 10 ×10 倍数下在每个鱼皮样品的相同区域选取9 个视野，拍照后用 Pho-toshop 图像处理软件处理后，统计出每个视野内黑色素的分布面积，每张图片中黑色素分布面积与图片中包含的皮肤长度的比值即为黑色素分布量的值。

1. 7 数据处理与分析

试验结果用平均值 ± 标准差表示。用 SPSS17. 0 统计软件进行 One － Way ANOVA 单因素方差分析，若差异显著进行 LSD 多重比较，显著性水平 P ＜0. 05。用 Excel2003 软件作图。

2 结果与分析

2. 1 THSG 对斑点叉尾 生长的影响

饲料中添加 THSG 对斑点叉尾 生长的影响见表 3，各试验组中以 A 组的生长性能最好，B 组次之，Ctr 组居中，C、D 组最差。其中 A 组的增重率比对照组提高了 51. 29%，饵料系数比对照组降低了 32. 84%，但差异不显著( P ＞ 0. 05) 。D 组的增重率比对照组降低了 25. 56%，饵料系数比对照组升高了 27. 21%，差异均不显著( P ＞ 0. 05) 。表明适当添加 THSG 对斑点叉尾 的生长有一定的促进作用，而过多的THSG添加量对生长有一定的抑制作用。6 周的饲养试验，除了 B 组存活率为 97. 78%外，其余组存活率均为 100%，表明 THSG 对斑点叉尾 的存活率无影响。

2. 2 THSG 对斑点叉尾 酪氨酸酶活力的影响

6 周的试验后，斑点叉尾 皮肤中的酪氨酸酶活力( 见表 4) 以对照组的最低，C 组次之，两组之间差异不显著( P ＞0. 05) ; 其余三个试验组的酶活均在 10. 0 U 以上，显著高于对照组( P ＜ 0. 05) ，其中又以 B 组酶活最高。血液中酪氨酸酶活以 A、C 两组最高，与对照组相比分别提高了 3. 89% 、3. 31% ; B 组比对照组降低了 14. 10% ; D 最低，比对照组性降低了 67. 33%，差异显著( P ＜0. 05) 。

2. 3 THSG 对斑点叉尾 黑色素含量的影响

由表 4 可知，随着饲料中 THSG 添加量的增加，斑点叉尾 皮肤中黑色素含量呈现上升的趋势，但各组之间差异不显著。

2. 4 THSG 对斑点叉尾 黑色素分布的影响

斑点叉尾 皮肤组成结构和黑色素分布情况见图 1。斑点叉尾 的皮肤分为表皮和真皮两个部分，在真皮下面是肌肉组织。黑色素细胞主要分布在表皮与真皮之间、真皮与肌肉之间，其中表皮与真皮之间的色素带较为明显，有大量的黑色素细胞聚集，而在真皮与肌肉之间的色素带较小，分布的色素细胞数量较少。随着饲料中 THSG 添加量的增加，斑点叉尾皮肤中黑色素分布量呈现先升后降趋势( 表 4) ，其中，以 B 组的黑色素分布量最高，比对照组增加了 87. 23%; A 组次之，比对照组增加了 62. 87%，差异显著。当 THSG 的添加量达到 1. 33% 时，黑色素含量却开始下降，添加量分别为 1. 33% 和2. 67% 的 C、D 两组，其黑色素含量仅为 6. 49% 与6. 14% ，与对照组差异不显著。

3 讨论

3. 1 不同 THSG 添加量对斑点叉尾 酪氨酸酶活力的影响

本试验中，在饲料中添加 THSG 后斑点叉尾皮肤中酪氨酸酶活力有显著的提高，而在酪氨酸酶活力升高后，皮肤中的黑色素分布量也有相应提升，这与一些研究结果［8］相符合，表明提高动物机体的酪氨酸酶活力可以促进黑色素的生成。比较皮肤与血液中酪氨酸酶活力后发现，虽然在测定血液酶活力时采用的底物浓度和酶用量均比测定皮肤时要低，但是其酶活力却比皮肤要高，说明斑点叉尾血液的酪氨酸酶活力高于皮肤，这与诸葛燕等［9］的研究结果相反，究其原因，可能与 THSG 的作用方式有关。THSG 的直接作用对象是 L － DOPA 而并非 TRY，血液作为各类营养物质的载体，其 TH-SG 含量较皮肤中要高，对 L － DOPA 的作用效果会更强，相应地与 TRY 的结合能力就强，酶活力就高。这提醒我们在考虑使用 THSG 来改善鱼体体色时，不光要考虑鱼体对 THSG 的消化吸收能力，还应考虑 THSG 在鱼体内向皮肤的转运与扩散效果。

3. 2 饲料中添加 THSG 改善体色的可行性

本试验在饲料中添加 THSG 饲喂斑点叉尾 以后，鱼体的黑色素含量和黑色素分布量均比对照组要高，表明在饲料中添加 THSG 用以改善斑点叉尾的体色具有一定的可行性。从饲料着手来改善鱼体体色，国内外在此方面已有丰富的经验，其主要手段有两种: 一是通过在饲料中添加一定量的类胡萝卜素，增加鱼体色素的含量，以达到增色的要求，如 Bjerkeng［10］通过在饲料中添加 100 mg/kg 的虾青素饲喂虹鳟( Oncorhyn-chus mykiss ) ， 使 其 肌 肉 中 的 虾 青 素 含 量 达 到7. 0 mg / kg，袁万安等［11］在饲料中添加类胡萝卜素，使大口鲇( Silurus meridionalis Chen) 的体色更加鲜艳; 二是在饲料中增加或者添加一些有利于色素物质吸收的营养素，如脂类含量不足影响鱼体消化道对饲料原料中类胡萝卜素的吸收［12］，提高饲料中的脂肪水平，提高叶黄素的利用率从而改善瓦氏黄 颡 鱼 ( Pelteobagrus vachelli Richardson) 的 体色［13］。但从生理生化层面改善体色的研究，目前尚少见报道。本试验的结果表明采用改变饲料成分的方式，刺激机体本身产色素能力也是一个值得人们关注和思考的途径。管淑玉［3］在其研究中发现，一定浓度的 THSG会引起黑色素颗粒聚集，导致黑色素分布存在明显的区域差异，当饲料中的 THSG 含量过高时，或许会引起鱼体黑色素颗粒的聚集，导致黑色素的分布变得疏散，本试验中，随着饲料中 THSG 添加量的增加，鱼体皮肤中黑色素的分布量也出现一个先增加后减少的趋势，表明在饲料中添加 THSG 有一个最适的添加量，并非添加越多效果越明显。

综上所述，饲料中添加 THSG 对斑点叉尾 酪氨酸酶和黑色素含量等体色指标均有显著的提高作用，而对其生长却无不良影响，说明在饲料中添加THSG 以改善鱼体体色的方法是可行的。但需要指出的是，本试验中存在着样品数量少、部分试验数据标准差过大、重复性差、饲喂过程中较多饲料浪费导致饵料系数过高等问题，在一定程度上对实验结果造成影响。本试验只是提供一个可供参考的研究思路，至于 THSG 在机体的消化吸收转运机制，其对色素细胞的作用原理，以及在饲料中的最适添加量等，还有待进一步研究。