儿童咳嗽与TRPV1基因的关系

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咳嗽是儿童呼吸系统疾病最常见的症状之一［1］，7 ～11 岁的儿童中约 9% 曾患有慢性咳嗽［2］。咳嗽也是一种重要的呼吸防御反射，气道的咳嗽感受器受到刺激后被激活，经咳嗽传入神经将冲动传入脑干咳嗽中枢，再经传出神经活化相应的肌群产生咳嗽。有研究显示位于咳嗽传入神经 C 纤维神经末梢的瞬时感受器离子通道受体 1( transient re-ceptor potential vanilloid-1，trpv1) 在咳嗽机制中发挥重要作用［3］。TRPV1 基因位于人类 17p13 染色体，有研究显示 TRPV1 基因 UTR-3 多态性与中国北京汉族儿童哮喘易感性相关［4］。TRPV1 基因多态性是否与儿童非特异性慢性咳嗽的发生相关，目前还未见相关报道。本研究通过分析非特异性慢性咳嗽患儿和对照儿童 TRPV1 基因 rs222747、rs222748、rs8065080 位点的多态性，探索 TRPV1 基因与儿童非特异性慢性咳嗽的关系。

1 资料与方法

1． 1 研究对象

选择 2008 年 6 月至 2010 年 10 月在重庆医科大学附属儿童医院哮喘中心门诊就诊的非特异性慢性咳嗽( 咳嗽 ＞4 周) 患儿 195 例，其中男 115 例，女80 例，年龄 4 个月至 14 岁，平均年龄 63 ± 34 个月。全部病例诊断按照中华医学会儿科学分会呼吸学组与《中华儿科杂志》编辑委员会 2008 年制定的《儿童慢性咳嗽诊断与治疗指南》的标准［5］。详细询问病史( 包括咳嗽病程，咳嗽性质，有无呼吸困难及喘息病史，有无鼻炎、鼻窦炎，有无哮喘及过敏性鼻炎家族史) ，全面体格检查及辅助检查。初诊后针对病因进行特异性治疗。首次就诊后半个月、1 个月、3 个月随访患儿情况，以明确病因，并及时修正诊断并制定下一步治疗方案。以 2009 年 5 月至2011 年 5 月体检正常儿童和重庆医科大学附属儿童医院骨科病房住院的外伤患儿共 205 例为对照组，均无慢性咳嗽及喘息病史，其中男 127 例，女78 例，年龄 1 ～ 14 岁，平均年龄 66 ± 31 个月。

1． 2 方法

采用聚合酶链反应限制性酶切片段多态性( PCR-RFLP) 方法对 195 例慢性咳嗽患儿及 205 例对照 儿 童 进 行 TRPV1 基 因 rs222747、rs222748、rs8065080 位点的基因型和等位基因分析。

1． 2． 1 TRPV1 基因多态性位点选择 采用 Hap-loview( 4． 2) 软件选择 TRPV1 基因的标签单核苷酸多态性 ( SNP) ，从 中 选 择 位 于 外 显 子 区 域 的rs222747、rs222748、rs222749 位点，因 rs222749 位点未找到合适的酶切位点，故未纳入本研究。Cantero-Recasens 等［6］研究发现在哮喘患儿中 rs8065080 位点基因多态性与喘息和咳嗽的发作有关，故将rs8065080 位点纳入本研究。rs222747 位于 TRPV1 基因第9 个外显子( 参考序列 NG-029716． 1) ，rs222747位点的 C/G 突变在蛋白水平表现为 TRPV1-315 位点异亮氨酸变为蛋氨酸; rs222748 位于 TRPV1 基因第7 个外显子( 参考序列 NG-029716． 1) ，rs222748 位点的 C/T 突变在蛋白水平表现为 TRPV1-167 位点组氨酸的同义突变; rs8065080 位于 TRPV1 基因第 15 个外显子( 参考序列 NG-029716． 1) ，rs8065080 位点的C / T突变在蛋白水平表现为 TRPV1-585 位点缬氨酸变为异亮氨酸。

1． 2． 2 标本采集及血液基因组 DNA 的提取 慢性咳嗽组及对照组均采集经肝素钠抗凝的静脉血，用 TIANamp DNA 提取试剂盒法提取血液基因组DNA( TIANamp 天根生化科技有限公司) 。

1． 2． 3 引物设计 PCR 引物采用在线引物设计( http: / /seq． yeastgenome． org/ cgi-bin /web-primer) ，检测 rs222747 位点等位基因引物序列: 上游引物 5'-CAGAGACAGAGGGAGTTTGGA-3'，下 游 引 物 5'-ACACACAGATAGCGACGCCA-3'; rs222748 位点上游引物: 5'-TGCTGTCCCAGGACTCTGT-3'，下游引物 5'-AGGATCCCAGAGAAGCAAGGA-3'; rs8065080 位点上游引物 5'-CAAGTCCTGGAGCTCATTTCA-3'，下游引物 5'-GCCCTGACCCAGGTATGTGTA-3'。由上海 In-vitrogen 公司合成，缓冲液配成 100 μmol / L， － 20℃保存，使用前稀释成 10 μmol/L。

1． 2． 4 PCR 扩增目的基因 PCR 扩增用 PCR( Taq) 扩增试剂盒( KT201) ，PCR 反应体系均为25 μL，浓度为 10 μmol / L 的上下游引物各 1 μL，2 × PCR mix( 包含 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、PCR 反应的增强剂和优化剂以及稳定剂) 12． 5 μL，ddH2O 8． 5 μL。按下列程序进行 PCR 扩增: 94℃ 预变性 3 min; 94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，30 个循环; 72℃ 再延伸 5 min。 rs222747、rs222748、rs8065080 位点 PCR 产 物 长 度 分 别 为487 bp、486 bp、486 bp。

1． 2． 5 限制性片段长度多态性分析 rs222747位点 PCR 产物酶切反应体系为 20 μL，10 × NEB 缓冲液 2 μL，PCR 产物 10 μL，限制性内切酶 BsaBI( 纽英伦生物技术有限公司) 0． 5 μL，灭菌双蒸水7． 5 μL，65℃ 水浴 3 h，2% 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系 统 下 观 察，判 断 基 因 型。rs222748 位 点、rs8065080 位点 PCR 产物酶切反应体系为 20 μL，10 × NEB 缓冲液 2 μL，PCR 产物 10 μL，100 × BSA0． 2 μL，限制性内切酶 Hpy99I( 纽英伦生物技术有限公司) 0． 5 μL，灭菌双蒸水7． 3 μL，37℃水浴3 h，2% 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察，判断基因型。

1． 2． 6 PCR-RFLP 的方法学验证 随机抽取部分用 PCR-RFLP 方法鉴定的 rs222747、rs222748、rs8065080 位点野生纯合子、突变杂合子、突变纯合子 PCR 产物送公司( 北京华大基因科技有限公司)测序验证。

1． 3 统计学分析

应用 SPSS 17． 0 统计学软件对数据进行统计分析。基因型及等位基因用频数及百分率( %) 表示，组间等位基因和基因型显著性比较用 χ2检验，采用Bonferroni 检验进行多重检验校正，校正因子为n( m-1) ( n: SNPs 位点的个数，m: 等位基因型的个数) ，P ≤0． 05/［n( m-1) ］( 即 P≤0． 0167) 为差异有统计学意义。

2 结果

2． 1 儿童非特异性慢性咳嗽病因随访

195 例非特异性慢性咳嗽患儿经过 3 个月随访后明确病因如下: 咳嗽变异性哮喘( CVA) 患儿 96 例( 49． 2%) ，CAV 合并上气道咳嗽综合征( CVA +UACS) 患儿 48 例( 24． 6% ) ，感染后咳嗽患儿 34 例( 17． 4%) ，上气道咳嗽综合征( UACS) 患儿 17 例( 8． 7%) 。不同年龄组非特异性慢性咳嗽病因分布不同( χ2= 18． 479，P = 0． 005) 。见表 1。

2． 2 TRPV1 基因 rs222747、rs222748 及 rs8065080位点基因型

在慢性咳嗽患儿和对 照 儿 童 中，rs222747、rs222748、rs8065080 位点均可检出 3 种基因型:rs222747 ( CC、GC、GG ) ; rs222748 ( CC、TC、TT ) ;rs8065080( CC、TC、TT) ( 图 1) 。3 种基因型的扩增产物进行测序分别测出野生型、突变型纯合子和杂合子，与 PCR-RFLP 方法结果一致( 图 2) 。经吻合度检验，rs222747 位点基因多态性分布( 表 2) 不符合 Hardy-Weinberg 平衡定律( P ＜ 0． 05) ，故未进行下一步分析。rs222748、rs8065080 位点基因多态性分布在各组均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律( P ＞ 0． 05) 。

2． 3 TRPV1 基因 rs222748 和 rs8065080 位点在两组儿童中基因型分布及等位基因频率

慢性咳嗽组及对照组儿童 rs222748、rs8065080位点基因型分布及等位基因频率经 Bonferroni 检验校正差异无统计学意义，见表 3 ～4。

3 讨论

本研究 195 例非特异性慢性咳嗽患儿中，CVA、UACS、感染后咳嗽是引起儿童慢性咳嗽的主要病因，与张晓波等［7］报道相似。CVA 合并 UACS 患儿48 例，提示在儿童非特异性慢性咳嗽的诊断中应注意两种病因合并存在的情况。TRPV1 是瞬时感受器离子通道蛋白 ( TRP) 家族的一个亚群，广泛分布于哺乳动物的呼吸系统感觉神经，尤其是无髓鞘的 C 纤维神经末梢［8］。TRPV1可被辣椒素和多种炎性物质( 如三磷酸腺苷、缓激肽、前列腺素 E2 等) 激活。有研究显示在慢性咳嗽病人 TRPV1 表达升高［9］，并发现慢性咳嗽病人气道黏膜 TRPV1 表达神经密度与辣椒素激发试验检测的咳嗽敏感性显著相关［10］。Veronesi 等［11］研究表明，辣椒素颗粒性吸入物及多种内源性炎性物质可协同作用于呼吸道上皮细胞上 TRPV1 通道，从而促进炎性介质( IL-6、IL-8、TNF 等) 释放，后者进一步激活或敏化分布于呼吸道黏膜的感觉神经TRPV1通道，最后以 P 物质释放的形式通过神经传导介导了咳嗽病理的发生。TRPV1 基因位于人类 17p13 染色体，rs222748位于 TRPV1 基因第 7 个外显子( 参考序列 NG-029716． 1) ，rs222748 位点的 C / T 突变在蛋白水平表现 为 TRPV1-167 位 点 组 氨 酸 的 同 义 突 变;rs8065080 位于 TRPV1 基因第 15 个外显子( 参考序列 NG-029716． 1) ，rs8065080 位点的 C/T 突变在蛋白水平表现为 TRPV1-585 位点缬氨酸变为异亮氨酸。本研究中非特异性慢性咳嗽组和对照组比较，rs222748 和 rs8065080 位点基因型经多重检验校正差异均无统计学意义。Cantero-Recasens 等［6］研究发现 rs8065080 位点基因多态性与哮喘的发生无关，但在哮喘患儿中既往 1 年有喘息和咳嗽发作的患儿T 等位基因明显增多; 受到热或辣椒素刺激时转染TRPV1-Ile-585 的希拉细胞( HeLa cells) 内 Ca2 +明显高于转染 TRPV1-Val-585 的希拉细胞。本研究结果发现非特异性慢性咳嗽组和对照组 rs8065080 位点基因型和等位基因比较差异虽无统计学意义，但表现出与儿童非特异性慢性咳嗽相关的趋势( 基因型P = 0． 075，等位基因 P = 0． 046) ，可能与本研究中样本量较少有关。rs222748 位点与慢性咳嗽的关系目前还未见相关报道。rs222748 位点、rs8065080 位点基因多态性与儿童非特异性慢性咳嗽的关系还需要经多中心大样本基因多态性分析进一步研究。

综上所述，非特异性慢性咳嗽患儿中 CVA、UACS 和感染后咳嗽是引起儿童慢性咳嗽的主要病因。TRPV1 基因 rs222748 位点、rs8065080 位点基因多态性可能与非特异性慢性咳嗽无关。由于本实验研究的样本量不够大，TRPV1 基因多态性与儿童非特异性慢性咳嗽的关系还需要经多中心大样本基因多态性分析进一步研究。