东风桔药材HPLC指纹图谱研究

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[摘要] 目的 建立东风桔药材hplc指纹图谱，结合化学计量手段，对多批次药材进行质量控制。 方法 采用Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈（A）-0.5%冰乙酸水（B）为流动相系统梯度洗脱（0～30 min，20%50%A；30～70 min，50%100%A），流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm，柱温35℃。对12批药材样品进行相似度分析、聚类分析和主成分分析。 结果 建立了东风桔药材专属性的HPLC指纹图谱，标示了18个共有指纹峰，12批样品分为5大类。 结论 将HPLC指纹图谱与化学计量手段相结合，可有效对东风桔药材进行真伪鉴别和质量评价，为其质量控制方法提供参考。

[关键词] 东风桔；高效液相色谱法；指纹图谱；相似度评价；聚类分析；主成分分析

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）01（b）-0014-04

Study on the HPLC fingerprint of Atalantia buxifolia

JIANG Li-juan1 PI Sheng-ling2 FANG Tie-zheng1 YAO Jiang-xiong1 XU Zhao-dong1 LIN Li-mei2

1.Guangzhou Baiyunshan Xingqun Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou 510208，China；2.School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China

[Abstract] Objective To establish the HPLC fingerprint chromatogram of Atalantia buxifolia coupled with chemometrics means for the quality control of multi-batches of medicinal material. Methods The samples were analyzed on Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） column with a acetonitrile（A）-0.5% acetic acid（B） as the mobile phase （0-30 min，20%50%A；30-70 min，50%100%A） at a flow rate of 1.0 ml/min.The detective wavelength was 254 nm and the column temperature was at 35℃.12 samples was constructed for similarity evaluation，cluster analysis and principle component analysis. Results A specificity HPLC fingerprint spectrum was developed for Atalantia buxifolia，18 common peaks were indicated and 12 samples were divided into 5 groups. Conclusion With the combination of chemometrics means，the HPLC fingerprint chromatogram provides a method for evaluation of authenticity and quality control of Atalantia buxifolia，which is favorable to improve quality control of Atalantia buxifolia.

[Key words] Atalantia buxifolia；HPLC；Fingerprint；Similarity evaluation；Cluster analysis；Principle component analysis

东风桔为芸香科植物酒饼{[Atalantia buxifolia（Poir.）Oliv.]的根及根茎部分，产于海南、台湾、福建、广东、广西等地，通常见于离海岸不远的平地、缓坡及低丘陵的灌木丛中，其气香，味微辛、苦，性温，具有祛风散寒，行气止痛的功效。与其他草药配用治支气管炎、风寒咳嗽、感冒发热、风湿关节炎、慢性胃炎、胃溃疡及跌打肿痛等[1]。主要含有挥发油、柠檬苦素类、生物碱、香豆素类、黄酮类等成分。东风桔的药用历史悠久，民间历来沿用本品治疗急、慢性气管炎，目前广东各大医院用于临床治疗慢性支气管炎，且取得较好的临床效果。研究证实，其有化痰、止咳、平喘的药理活性[2-3]。东风桔有较高的开发利用价值，应用前景良好，但目前尚未有东风桔药材的质量控制标准。本研究建立东风桔药材的HPLC指纹图谱，为东风桔药材的真伪鉴别和质量控制提供科学依据，为进一步开发和利用东风桔资源、发展道地药材生产提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；T-214型电子分析天平（Denver公司）；Waters e2695高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器（Waters 公司）。

1.2 材料

冰乙酸（天津市化学试剂研究所，色谱纯）；乙腈（Honeywell公司，色谱纯）；水为超纯水（实验室制备）。12份不同批次或产地的东风桔药材样品[广州星群（药业）股份有限公司]，由中药鉴定教研室龚力民老师鉴定为芸香科植物酒饼{的干燥根及根茎，具体信息见表1。

表1 东风桔药材样品来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%冰乙酸水（B）为流动相系统梯度洗脱（0～30 min，20%50%A；30～70 min，50%100%A）；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：35℃；进样体积：10 μl。

2.2 供试品溶液的制备

取东风桔药材粉末（过60目筛）约0.5 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 ml，密塞，称重，70℃回流水浴加热45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一产地（广西）药材粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测定指纹图谱。以9号峰的保留时间和峰面积为参照，计算样品中所含18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰相对保留时间的RSD为0.001%～0.1%，相对峰面积的RSD为0.022%～2.38%，表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一产地（广西）药材粉末，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样6次，测定指纹图谱。考察样品中所含18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间的RSD为0.008%～0.07%，相对峰面积的RSD为0.060%～2.47%，表明方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取一份（广西）药材粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、15、24 h测定指纹图谱，考察样品中所含18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间的RSD为0.001%～0.3%，相对峰面积的RSD为0.088%～2.27%，表明东风桔药材样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 指纹图谱共有模式的建立 取12批药材粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μl，记录HPLC色谱图（图1）。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）进行分析，生成共有模式指纹图谱，标定了18个共有峰（图2）。其中以峰9为参照物，其余各共有峰与峰9的相对保留时间与相对峰面积见表2、表3。

表2 东风桔药材HPLC指纹图谱共有峰相对保留时间

表3 东风桔药材HPLC指纹图谱共有峰相对峰面积

2.4.2 指纹图谱的相似度评价 上述12批东风桔药材相似度计算结果依次为0.975、0.981、0.933、0.959、0.961、0.972、0.973、0.994、0.996、0.954、0.966、0.955，说明样品批次之间差异性较小，质量稳定。

2.5 聚类分析

将12批东风桔药材HPLC指纹图谱中18个色谱峰的峰面积与样品号建立矩阵，导入SPSS 19.0软件，采用组间联接法，以欧氏距离的平方为测度，对数据进行标准化转换，得到东风桔药材的聚类分析谱图（图3）。结果表明，12批样品可分为5类，S1、S2聚为一类，S4、S5聚为一类，S8、S9聚为一类，S6、S7、S10、S11、S12聚为一类，S3单独聚为一类。

图3 聚类分析图

2.6 主成分分析

采用SPSS 19.0软件对12批东风桔药材样品进行主成分分析。结果表明，S6、S7、S10、S11、S12集中分布在一个区域，可聚为一类，其余样品根据距离远近可分为4类。该图直接反映了各批次样品之间的差异大小，与聚类分析的结果一致（图4）。

图4 主成分分析图

3 讨论

3.1提取方法的考察

考察了水浴回流提取法和超声提取法[4-6]，结果发现水浴回流提取的收率较超声提取高；对提取溶剂甲醇、50%甲醇、75%甲醇、乙醇、50%乙醇、75%乙醇进行了考察[7-10]，发现甲醇的提取效果最好；同时对提取体积10、20、25、30 ml和提取时间15、30、45、60 min也进行了考察，发现10 ml提取45 min时效率最高。

3.2 色谱条件的优化

尝试了乙腈-0.5%冰乙酸水、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.5%冰乙酸水不同流动相体系[11-15]，结果表明，乙腈-0.5%冰乙酸水系统得到的色谱峰峰形较好且稳定；比较了245、254、265、300、320 nm波长下的色谱图，结果在254 nm检测条件下色谱峰较多，各峰吸收均匀，峰形较好，故选择254 nm作为检测波长；比较了Kromasil 100-5C18 （250 mm×4.6 mm）、LiChrospher？R 100 RP-18 endcapped（5 μm）Hibar？R RT 250-4.6、Athena C18 120A（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）4种不同型号的色谱柱，结果表明Kromasil柱的各色谱峰的分离度、峰形较其他色谱柱好，本实验选择Kromasil色谱柱。

3.3 聚类分析和主成分分析

两者相互佐证，结果一致，可以看出样品被分为5大类：Ⅰ（S1，S2），Ⅱ（S4，S5），Ⅲ（S3），Ⅳ（S8，S9），Ⅴ（S6，S7，S10，S11，S12）。分析其结果，Ⅳ类与Ⅴ类距离最近，Ⅱ类与Ⅴ类距离最远，Ⅰ～Ⅴ类各类之间相距较远，说明药材的主要成分类似，但其含量不同，不同批次或产地的同种药材之间存在一定差异[16-20]。本实验对东风桔的HPLC指纹图谱进行多方面的考察，结果准确、可靠，可用于东风桔药材的质量控制。