母乳中多种含卤持久性有机污染物的联合检测方法
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摘要建立了母乳中多种含卤持久性有机污染物（POPs）的联合检测方法，目标化合物主要包括六溴环十二烷（HBCDs）、多溴联苯醚（PBDEs）、多氯联苯（PCBs）和有机氯农药（OCPs）等。样品的前处理采用液液萃取、凝胶渗透色谱（GPC）净化和固相萃取（SPE）等技术，目标化合物经气相色谱质谱联用仪（GCMS）、液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪（LCMS/MS）和气相色谱三重四极杆串联质谱联用仪（GCMS/MS）等进行检测。样品通过GPC除去脂肪，然后经SPE柱进一步净化并进行多组分分离，极大程度地减小了生物样品中复杂基质的干扰，适合样品量相对较小的人体样本中多种超痕量POPs的分析。应用灵敏度高、选择性更好的GCMS/MS对样品中的PCBs和OCPs等进行分析，进一步降低基质的干扰。方法经过小牛血清加标实验验证，稳定可靠。POPs的加标回收率分别为88.7%～98.8%（PBDEs），88.5%～92.5%（HBCDs），67.9%～82.3%（PCBs）和81.7%～116.1%（OCPs），方法检出限分别为0.13～1.8pg/mL（PBDEs），0.31～1.2pg/mL（HBCDs），0.22～1.4pg/mL（PCBs）和0.20～1.5pg/mL（OCPs）。采用本方法对潍坊地区20例母乳样品进行分析，结果显示，潍坊市母乳中HBCDs＼，PBDEs＼，PCBs、HCHs和DDTs的中值浓度分别为2.86＼，7.76＼，8.84、140和503ng/g脂重，此浓度水平与国内其它地区人群相当。
关键词六溴环十二烷；多溴联苯醚；多氯联苯；有机氯农药；母乳
1引言
六溴环十二烷（HBCDs）、多溴联苯醚（PBDEs）、多氯联苯（PCBs）和有机氯农药（OCPs）是环境中广泛存在的持久性有机污染物（POPs）。由于它们具有环境持久性、远距离传输性、生物蓄积性以及对生物和人体具有毒害效应等特性，成为各国环境科学领域研究关注的热点。PCBs和滴滴涕（DDT）于2001年被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》首批受控POPs名单，α和β六六六（HCH）、林丹以及商用五溴和八溴联苯醚于2009年被列入新增POPs名单，HBCDs也于2013年被列入POPs名单。尽管这些化合物在全球部分地区的应用已受到控制，但是由于长期大量使用以及持久性特征，使得其在环境介质中依然有较高的储备，并通过食物链或其它途径进入人体，带来较大的潜在健康风险，尤其是还在使用这些化合物的地区[1]。因此，有必要持续监测这些POPs在人体内的含量水平，为评估它们的潜在健康风险提供基础数据。
目前人体样品中POPs的分析方法有较多报道，但已有的方法通常针对溴代阻燃剂、有机氯农药等分类进行分析和方法优化[24]。由于母乳和血清等收集难度大，采样量相对较小，所采集的样品往往只能进行一次前处理；同时人体往往受到多种POPs的污染暴露，这些POPs的含量水平相对较低（ng/mL水平），因此，有必要建立适合人体样品多种痕量POPs的联合检测方法，从而实现有限的样品量经一次分析得到多种POPs的浓度水平，这也是当前POPs分析方法发展的主要方向。目前，有关人体样品的多组分联合检测方法的文献报道较少。Sahlstrm等[5]建立了血清中多种溴阻燃剂联合检测方法，该方法在提取脂肪后，将耐酸性化合物与对酸敏感的化合物用固相萃取（SPE）柱分离，然后将二者分开净化，操作较复杂。Shi等[6]建立了母乳和血清中HBCDs、PBDEs和四溴双酚A（TBBPA）的联合检测方法，Wang等[7]建立了血清中PCBs、OCPs、PBDEs、德克隆（DP）、五溴苯（PBBz）和五溴甲苯（PBT）的联合检测方法，以上两种方法在利用凝胶渗透色谱（GPC）除脂后，分别用浓硫酸和酸性硅胶柱进一步净化。人体样品的基质非常复杂，在浓硫酸或酸性硅胶净化过程中，生物基质与浓硫酸反应生成的产物可能干扰POPs的检测，母乳中的胆固醇经浓硫酸脱水后形成胆甾烯，后者在GCMS检测时对BDE99和BDE100产生离子抑制效应或峰干扰效应[8]。
本研究利用液液萃取、GPC净化和SPE分离等技术，建立了母乳样品中HBCDs，PBDEs，PCBs和OCPs等多种POPs的联合检测方法；同时利用灵敏度高和选择性好的GCMS/MS对样品中PCBs和OCPs进行检测。
2实验部分
2.1仪器与试剂
7890A5975C气相色谱质谱联用仪、7890A7000气相色谱三重四极杆串联质谱联用仪（美国安捷伦公司）；1100液相色谱（LC，美国安捷伦公司）耦合应用生物系统API4000三重四极杆串联质谱系统（MS/MS，美国AB公司）；BS210s电子天平（德国Sartorius公司）；TDL5A离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；R210旋转蒸发仪（瑞士步琪公司）；50mL聚四氟乙烯离心管（美国橡树岭公司）等。
PCBs混合标样（包含PCB28＼，52＼，101＼，118＼，138＼，153＼，180），PBDEs混合标样（包含BDE28＼，47＼，99＼，100＼，153＼，154＼，183＼，209），高溴PBDE单标（BDE196＼，197＼，201＼，202＼，203＼，206＼，207＼，208＼，209），以及单标BDE77＼，BDE128＼，BDE181均购自美Accustandard；α、β、γHBCD，13C12标记和d18标记的α＼，β＼，γHBCD，13C10PCB141，13C10PCB208，以及13COCPs（含13C6标记的βHCH＼，13C12标记的4，4′DDE和4，4′DDT）均购自美国剑桥同位素实验室；OCPs混标（含αHCH＼，βHCH＼，γHCH＼，4，4′DDD＼，4，4′DDE＼，4，4′DDT）购自美国Supelco公司。
二氯甲烷（农残级，德国CNW公司）；正己烷和甲醇（LC级，德国Merck公司）；甲基叔丁基醚和乙醇（LC级，德国CNW公司）；草酸钾（99%，美国AlfaAesar公司）；无水硫酸钠（分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司）；凝胶渗透色谱填料为BioBeadsSX3（美国BioRad公司）；硅胶（63200μm，德国Merck公司）。
2.2实验用品的制备
玻璃器具用热洗液（含5%K2Cr2O7的浓H2SO4）清洗，放置5h后，依次用自来水和去离子水清洗，烘干后，经450℃高温焙烧5h后，用铝箔纸封口保存备用。无水硫酸钠经450℃高温焙烧5h后，置于密封干燥器中保存备用。硅胶经150℃活化12h后，在干燥器中平衡12h，加入2.5%（m/m）的水失活，置于密封干燥器中备用。
2.3母乳样品的采集
母乳样品于2010年11月至2011年03月采自山东省潍坊某医院。所有志愿者都自愿参加并签署知情同意书，在该医院医护人员的协助下，收集母乳量约20mL。母乳样品置于
80℃冰箱保存。同时对参与人员进行无记名登记调查，记录相应母亲的年龄、胎次、职业等信息。
2.4样品处理
基于本课题组建立的母乳中PBDEs的分析方法[9]，建立母乳样品中POPs多组分联合检测方法。样品依次经过脂肪提取、GPC除脂和SPE分离纯化等过程。
2.4.1脂肪提取取5mL解冻后的母乳样品，加入加标指示物（BDE77，BDE128，BDE181，13C6标记的βHCH，13C12标记的4，4′DDE和4，4′DDT，13C10标记的PCB141，13C12标记的α，β，γHBCD），振荡后平衡12h。加入5mL水稀释母乳，再加入1mL饱和草酸钾溶液和10mL乙醇使蛋白质变性并沉淀。用10mL甲基叔丁基醚和正己烷混合溶液（1〖KG-3∶〖KG-51，V/V）萃取一次，再用5mL正己烷萃取两次。合并有机萃取液，无水Na4SO4除水，旋转蒸发仪浓缩至1mL，转移至细胞瓶并用柔和氮气吹干，放入干燥器中恒重后，称量脂肪的质量。
2.4.2GPC净化与SPE分离
恒重后的脂肪溶于1mL正己烷二氯甲烷混合溶液（1〖KG-3∶〖KG-51，V/V）中，通过GPC除去脂肪等大分子，收集55～175mL淋洗液，经旋转蒸发仪浓缩至1mL。浓缩液经SPE柱（填料是以2.5%水失活的中性硅胶，0.50g）分离非极性组分与极性组分。非极性组分（F1，含PBDEs，PCBs，DDTs等）由10mL正己烷洗脱下来，氮吹浓缩至1mL后，转移至进样瓶，氮吹至干，加入进样内标（13C10PCB208），定容至20μL异辛烷中。极性组分（F2组分，含HBCDs、HCHs等）用7mL正己烷二氯甲烷混合溶液（1〖KG-3∶〖KG-51，V/V）洗脱，氮吹浓缩至1mL后，转移至进样瓶，氮吹至干，加入进样内标（13C10PCB208），定容至20μL正己烷中。F2组分先经GCMS/MS检测OCPs的含量，再将溶剂切换至200μL甲醇中，加入进样内标（d18标记的α，β，γHBCD），经LCMS/MS检测HBCDs的含量。
2.5仪器分析
2.5.1GCNCIMS测定PBDEs色谱条件：DB5HT高温毛细管柱（15m×0.25mmi.d.，0.10μm，J&WScientific公司）；载气为氦气（1.2mL/min），恒流模式；无分流模式，进样量为1μL；进样口温度为290℃。色谱柱初始温度为110℃，保持5min；以20℃/min升至200℃，保持4.5min；以7.5℃/min升至300℃，保持10min。质谱采用负化学电离源（NCI）：甲烷为反应气（2mL/min）；离子源温度为250℃；四极杆温度为150℃；传输线温度为300℃。采用选择离子监测模式（SIM），进行定性与定量分析，监测离子分别为13C10PCB208：m/z473.7和m/z475.7；3～8溴PBDEs：m/z79和m/z81；9～10溴PBDEs：m/z79、m/z81、m/z486.7和m/z488.7。
2.5.2GCMS/MS测定PCBs和OCPs色谱条件：DB5MS（30m×0.25mmi.d.，0.25μm，J&WScientific公司）；载气为高纯氦气（1.2mL/min），恒流模式；无分流模式，进样量为1μL；进样口温度为250℃。色谱柱初始温度为70℃（保持1min），以10℃/min升温至160℃，以5℃/min升至280℃（保持5min），以20℃/min升至300℃（保持5min）。质谱采用电子轰击离子源（EI）：碰撞气为高纯氦气和高纯氮气，淬灭气为高纯氦气；离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；传输线温度为300℃。
2.5.3LCMS/MS测定HBCDsZorbaxSBC18反相色谱柱（250mm×4.6mmi.d.，5μm，Agilent公司）；M样量为20μL；流动相组成为水（A）/甲醇（B）/乙腈（C），流速为0.5mL/min；初始流动相组成为A〖KG-3∶〖KG-5B〖KG-3∶〖KG-5C=10〖KG-3∶〖KG-580〖KG-3∶〖KG-510（V/V，下同），在18min内缓慢调整为A〖KG-3∶〖KG-5B〖KG-3∶〖KG-5C=10〖KG-3∶〖KG-550〖KG-3∶〖KG-540，23min时调整为B〖KG-3∶〖KG-5C=30〖KG-3∶〖KG-570（保持7min），然后在5min内调整为A〖KG-3∶〖KG-5B〖KG-3∶〖KG-5C=10〖KG-3∶〖KG-580〖KG-3∶〖KG-510，最后色谱柱平衡10min。质谱分析采用负离子电喷雾离子源（ESI）和多重离子裂解监测模式（MRM），监测离子对为＼[M-H＼]
Br
；高纯氮气为辅助气、帘气和碰撞气；13C12标记的、d18标记的以及未标记的HBCDs的监测离子对分别为m/z652.778.8，m/z658.778.8，m/z640.778.8。
3结果与讨论
3.1SPE柱分离与净化流程的优化
母乳样品经GPC净化后，已除去大部分脂肪和蛋白质等大分子基质，对于小分子基质，利用它们与目标化合物在硅胶上的吸附特征不同，通过硅胶SPE柱进一步分离净化，最大程度减小仪器分析时生物基质的干扰。
在利用SPE柱净化的同时，通过改变洗脱剂的极性将母乳样品中目标化合物分成两个组分：F1组分包括PCBs、PBDEs和DDTs等，F2组分主要是HCHs和HBCDs。首先以正己烷为洗脱剂将非极性组分洗脱下来，然后增加洗脱剂的极性（正己烷二氯甲烷，1〖KG-3∶〖KG-51，V/V），将一定极性的化合物洗脱下来，极性更强的小分子基质则保留在SPE柱上，从而达到分离与净化的目的。
3.2PCBs和OCPs检测方法的优化
母乳中PCBs和OCPs的含量采用GCMS/MS测定。母乳样品中目标化合物经SPE柱分离后，尽管DDTs与HCHs在不同的组分，但是PCBs与DDTs均在同一组分，故建立PCBs和DDTs同时检测方法，可以减少进样次数，提高实验效率。首先，在质谱单扫描模式下，对PCBs和DDTs目标化合物分别进行全扫描（Fullscan，m/z50～500），确定每个化合物的特征碎片离子；然后，将特征碎片离子作为母离子，进行子离子扫描，确定每个目标化合物的定性和定量离子对；最后，通过多级反应监测模式（MRM），对每个化合物的碰撞能等参数逐一优化，使其达到最优。以同样的方法优化HCHs的仪器参数。最终确定的OCPs和PCBs的定性和定量离子对以及碰撞能如表1所示。
3.3检出限、回收率及重现性
配制2.5，5，10，25，50，100，200和400ng/mL的混合标准溶液，以标准品与内标浓度比值为Y轴，标准品与内标峰面积比值为X轴，绘制标准曲线。目标化合物在相应浓度范围内线性良好，相关系数R2≥0.998。取信噪比大于5时的标准溶液，连续进样6次，计算标准偏差S，根据检出限（LOD）=3.36S，计算PBDEs，HBCDs，PCBs和OCPs的仪器检出限分别为0.06～0.25pg/μL，0.08～0.19pg/μL，0.07～0.28pg/μL和0.07～0.18pg/μL。以低浓度的母乳（5mL）为基准，PBDEs，HBCDs，PCBs和OCPs的方法检出限分别为0.13～1.8pg/mL＼，0.31～1.2pg/mL＼，0.22～1.4pg/mL和0.20～1.5pg/mL。
由于母乳样品采集难度大且样品量相对较小，以及母乳中含有一定浓度的目标化合物，尤其是DDTs和HCHs（我国12省普通地区人群所有母乳中均检测到DDTs和HCHs，其最低含量分别高达149和52ng/g脂重[10]），故分析方法的研究中一般不用母乳进行测定。以往文献中曾使用牛奶作为基质进行加标实验[10～12]，Shi等[6]在建立血清和母乳中HBCDs、PBDEs和TBBPA的联合分析方法时，分别用新生小牛血清和牛奶进行基质加标实验，结果显示，两种基质中目标化合物的回收率一致，但是牛奶中目标化合物回收率的相对标准偏差（RSD）显著大于新生小牛血清，尤其是αHBCD（13.9%vs2.7%）和βHBCDs（14.0%vs1.7%）。本研究中也有同样的发现，牛奶作为基质的方法稳定性较差，而新生小牛血清中加标指示物的回收率和RSD值与母乳接近（表2），证实新生小牛血清可以替代母乳用于基质加标实验。因此，本研究采用新生小牛血清（5mL）进行基质加标实验，表3列出了各目标化合物的加标回收率。PBDEs，HBCDs，PCBs和OCPs的加标回收率分别为88.7%～98.8%＼，88.5%～〖CM（4492.5%＼，67.9%～82.3%和81.7%～116.1%，其RSD值分别为8.7%～11.7%、3.6%～4.0%、0.72%～〖CM）
5.5%和7.5%～11.1%，表明本研究建立的多组分联合检测方法稳定可靠。
将本方法与文献报道的人体样品中多组分联合分析方法进行比较（表4）可知，本方法具有良好的加标回收率和较低的方法检出限，能满足实际样品测定的要求。
3.4实际样品的分析
将本研究方法应用于山东潍坊市20份母乳样品中PBDEs，HBCDs，PCBs和OCPs的分析。图1是母乳样品中POPs的典型色谱图。高溴PBDEs（8～10溴）是潍坊母乳样品中主要的PBDEs同系物，与本课题组报道的上海地区人群母乳类似[9]。参考高溴PBDEs标准物质，鉴定母乳中高溴PBDEs的同系物组成如图1A所示。αHBCD是潍坊母乳中最主要的HBCD异构体（图1B），与Shi等[15]报道的我国12省普通人群母乳类似。PCB28和PCB153是母乳中最主要的PCBs同系物（D1C），这与我国12省饮食中PCBs的组成特征类似[16]。4，4′DDE和βHCH分别是母乳中最主要的DDTs和HCHs（图1C〖CM（44和图1D），与国内其它地区普通人群母乳类似[10]。母乳样品中POPs的浓度如图2所示，HBCDs，〖CM）
PBDEs＼，PCBs＼，HCHs和DDTs的中值浓度分别为2.86＼，7.76＼，8.84＼，140和503ng/g脂重，该浓度水平与我国其它地区普通人群相当[9，10，12，17]。其中，DDTs的含量最高，HCHs次之，与中国疾病预防控制中心对我国12省普通人群的POPs内暴露调查结果一致[10，15，17]，表明我国普通人群以DDTs和HCHs为〖CM（44主的暴露特征。这与我国历史上曾大量生产和使用DDTs和HCHs，以及它们在环境和生物体内难以降解转化有关。
4结论
本研究建立了母乳样品中HBCDs，PBDEs，PCBs和OCPs等多种POPs的联合检测方法，利用GPC除脂，有效避免了浓硫酸在除脂过程中带入新的基质干扰，并用SPE柱进一步净化，极大程度降低了生物样品中复杂基质的干扰。另外，本研究利用灵敏度高和选择性好的GCMS/MS检测OCPs和PCBs的含量，进一步降低了生物基质的干扰。本方法具有良好的加标回收率和较好的重复性，适合于实际母乳样品中HBCDs、PBDEs、PCBs和OCPs等多种POPs的联合分析检测。
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AbstractAmethodwasdevelopedforsimultaneousdeterminationofmultiplepersistentorganicpollutants（POPs）suchashexabromocyclododecanes（HBCDs），polybrominateddiphenylethers（PBDEs），polychlorinatedbiphenyls（PCBs），andorganochlorinepesticides（OCPs）inhumanbreastmilk.Thesamplepretreatmentproceduresincludedliquidliquidextraction，gelpermeationchromatography（GPC），andsolidphaseextraction（SPE）cleanup.Gaschromatographycoupledwithmassspectrometry（GCMS），liquidchromatographycoupledwithtandemmassspectrometry（LCMS/MS），andgaschromatographycoupledtotandemmassspectrometry（GCMS/MS）wereappliedinanalysisofthetargetcompounds.ByusingGPCtoremovehighmolecularmasslipidsandSPEforfurthercleanupandseparationoftargetcompounds，theinterferencesofbiologicalmatrixweregreatlyreduced.ThedevelopedsamplepretreatmentprocedurewassuitableforthemulticomponentanalysisofPOPsinhumansampleswhichhadverylowerPOPsconcentrationsandsmallersamplevolumes.ThesimultaneousdeterminationofPCBsandOCPsbyGCMS/MSexhibitedexcellentsensitivityandselectivity.Themethodrecoveriesweretestedbyspikedtargetcompoundsintofetalbovineserumsamples.Therecoverieswere88.7%-98.8%forPBDEs，88.5%-92.5%forHBCDs，67.9%-82.3%forPCBs，and81.7%-116.1%forOCPs，respectively.Limitsofdetectionofthemethodwereintherangeof0.13-1.8ng/LforPBDEs，0.31-1.2ng/LforHBCDs，0.22-1.4ng/LforPCBs，and0.20-1.5ng/LforOCPs，respectively.Finally，thedevelopedmethodwasappliedinPOPsanalysisof20humanbreastmilksamplesfromWeifangcity.TheresultsshowedthatthemedianconcentrationsofHBCDs，PBDEs，PCB，HCHSandDDTswere2.86，7.76，8.84，140and503ng/glipidweight，respectively.LevelsofthetargetcompoundswerecomparabletothosereportedinhumanbreastmilkforgeneralpopulationfromotherregionsinChina.
KeywordsHexabromocyclododecanes；Polybrominateddiphenylethers；Polychlorinatedbiphenyls；Organochlorinepesticides；Humanbreastmilk
（Received30September2016；accepted11January2017）
ThisworkwassupportedbytheNationalScienceFoundationforDistinguishedYoungScholarsofChina（No.41225013）andthestrategicpriorityResearchProgramoftheChineseAcademyofSciences（No.XDB14010202）