丹参在大鼠恶性梗阻性黄疸时对肿瘤细胞凋亡的作用

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【关键词】 胆汁淤积；浸润和转移；增殖细胞核抗原；丹参；凋亡指数

【Abstract】 AIM： To establish malignant biliary obstruction models in SD rats, and to study the effects of Danshen injection on the growth of hepatocellular carcinoma, morphological change and PCNA expression and apoptosis index in carcinoma and pericarcinoma tissues. METHODS： ① Malignant biliary obstruction model in SD rats was made by vaccination of transplanted tumor in liver nearby the porta hepatis with Walker256 hepatocarcinoma cell line, which infiltrated proximal common bile duct to cause its narrowness and obstruction. ② The SD rats were divided into 4 groups that were treated ip by 0.9% normal saline (NS) (n=16), by inosine+vitamin C (n=26), by Danshen (n=34) and by 5FU (n=30) respectively. ③ The diameter of transplanted tumor, morphological change and the expression of PCNA and apoptosis index in carcinoma and pericarcinoma tissues were observed. ④ Statistical analysis was made in the experimental data. RESULTS: In Danshen group as compared with NS group and inosine+vitamin C group, the average size of hepatocarcinoma was reduced significantly, the tumor inhibitory rate and the metastasisinhibitory rate were higher obviously (P<0.01), PCNA expression was lower (P<0.01), apoptosis index was higher (P<0.01); while compared with 5FU group, the average size was significantly larger (P<0.05) but the metastasisinhibitory rate was lower evidently (P<0.05), apoptosis index was higher in carcinoma tissues (P<0.05). CONCLUSION： Danshen shows a protective effect against morphological change in SD rat models of malignant biliary obstruction, and exerts an inhibitory effect on the growth of hepatocarcinoma through suppressing the proliferation, increasing the apoptosis of the hepatocarcinoma cells.

【Keywords】 cholestasis; infiltration and metastasis; proliferating cell nuclear antigen; Danshen; apoptosis index

【摘要】 目的： 建立恶性梗阻性黄疸模型，通过对模型鼠腹腔内注射丹参注射液，观察其对肝癌瘤体大小、形态学改变和肝癌、癌周组织中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达和肿瘤细胞凋亡表现，评价其作用机制. 方法: ①用Walker256肝癌株近肝门部肝实质内种植致移植性肝癌侵袭高位胆管，造成胆道癌性狭窄，以建立SD大鼠恶性梗阻性黄疸模型. ②将模型鼠分成4组，并在腹腔内分别注射等量的生理盐水(n=16)、肌苷+维生素C (n=26)、丹参(n=34)和5FU(n=30). ③观察肝癌瘤体大小、形态学改变和肝癌、癌周PCNA的表达和肿瘤细胞凋亡情况. ④对其结果进行统计学分析. 结果: 丹参组肝癌平均瘤体较生理盐水组和肌苷+维生素C组明显减小、而抑癌率及抑转移率明显高于生理盐水组和肌苷+维生素C组(P<0.01). 丹参组平均瘤体大小明显大于5FU组，有显著性差异(P<0.05)；而肺抑转移率明显低于5FU组(P<0.05). PCNA的表达明显低于生理盐水组和肌苷+维生素C组（P<0.01）. 丹参组肿瘤细胞凋亡指数在肝癌组织和癌周组织中明显高于生理盐水组和肌苷+维生素C组（P<0.01)，在肝癌组织内高于5FU组（P<0.05）. 结论： 丹参在肝癌致梗阻性黄疸时，可促进肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞增殖，促进肿瘤细胞成熟分化，对肿瘤发展起抑制作用.

【关键词】 胆汁淤积；浸润和转移；增殖细胞核抗原；丹参；凋亡指数

0引言

采用Walker256肝癌株近肝门部肝实质内种植致移植性肝癌侵袭高位胆管，造成胆道癌性狭窄，建立SD大鼠恶性梗阻性黄疸模型［1］. 通过对模型鼠ip注射不同药物，观察肝癌瘤体大小、形态学改变、肝癌、癌周组织的肿瘤细胞凋亡指数和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，推断丹参在肝癌致梗阻性黄疸时对肿瘤细胞凋亡的作用.

1材料和方法

1.1材料雄性SD大鼠144只，体质量（225±25）g，另备雄性SD幼鼠10只，体质量（100±25）g，以供癌株传代用，均为华中科技大学同济医学院动物实验中心提供（大鼠和幼鼠均为近交系繁殖和封闭群体饲养）. Walker256肝癌细胞株用人乳腺癌肉瘤诱导传代培育而成的鼠肝癌株，由中国科学院上海细胞生物所提供，已稳定传代50次以上. 复方丹参注射液（上海第九制药厂,批号00124509）. 将Walker256瘤株从液氮中复苏，在传代鼠腹腔内进行癌株扩增后,注入传代SD幼鼠下肢内侧皮下. 5 d后，在无菌条件下摘出实体瘤，取边缘生长活跃的鱼肉样癌组织,切成1 mm×1 mm×1 mm瘤块，置于冰生理盐水中漂洗后备接种用. 将SD大鼠用20 g/L戊巴比妥（1.3 mL/kg） ip麻醉后，常规消毒，行腹正中切口进腹，充分显露肝门，置手术放大镜视野下，在肝右叶与肝中叶的交界部距肝门5 mm处，用眼科镊逆胆管走行方向潜行造隧深约3 mm，植入备用的瘤块后，用棉签压迫止血. 依次关腹，结束手术. 常规饲养7 d，即可完成恶性梗阻性黄疸模型鼠的复制［1］.

1.2方法将模型鼠随机分成4组：A组（生理盐水治疗组）16只，ip生理盐水，剂量为10 mL/kg×7 d. B组（肌苷+维生素C治疗组）26只，ip肌苷+维生素C各5 mL/kg×7 d. C组（丹参治疗组）34只，ip丹参10 mL/kg×7 d. D组（5FU组）30只，ip 300 mg/kg×7 d. ip药物7 d后，用乙醚开放吸入麻醉后，行正中十字切口入腹，沿胸骨正中打开胸腔，迅速剪开心包行左心室插管，先快后慢灌注生理盐水100 mL和40 g/L多聚甲醛（0.1 mol/L） PB固定液300 mL，剪开右心耳放血. 待全身灌注固定完全后，切取肝脏及肿瘤、肺脏标本. 将组织块放入40 g/L多聚甲醛溶液中，选材、脱水及石蜡包埋. 记录肿瘤体积、肝内转移灶数目及肺转移情况，并计算：肿瘤体积=长径×短径2÷2, 抑癌率=［（对照组平均瘤体?实验组平均瘤体）÷对照组平均瘤体］×100%，抑转移率=［（对照组平均转移率?实验组平均转移率）÷对照组平均转移率］×100%. 将选取肝瘤组织、瘤周组织行HE染色，进行组织病理学检查. 同时选取肝癌、癌周组织中PCNA表达的免疫组化检查（PCNA阳性计数：10个高倍视野下计数100个细胞所含PCNA阳性细胞数）. TUNEL法检测组织细胞凋亡，将石腊组织标本在石腊切片机上切成4 μm厚的连续切片，贴附于经脱片剂(APES)处理的洁净载玻片上，置烤箱烤3 h，使切片紧密贴附. 其步骤为①组织片常规脱蜡至水；②微波处理：0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，pH 6.0，至微波中加热92~98℃之间，持续10 min，微波功率为800 W；③封闭内源性DNA酶：DEPC (diethylpyrocarbonate)水洗，室温放置30 min；④加用荧光素(FITC)标记的核昔酸和脱氧核昔酸末端转移酶混合液，37℃, 60 min，在荧光显微镜下观察；⑥以滴加TBS缓冲液取代TUNEL反应液的组织切片作为阴性对照；阳性对照用DNA酶I(美国Sigma公司产品). TUNEL阳性信号为黄绿色或黄色荧光，位于胞核，呈小圆形、环行或颗粒状.有些阳性细胞出现于肝窦中，大约8 μm左右的小圆形颗粒. 对TUNEL染色阳性的细胞再结合凋亡细胞的形态学特征(如：染色质浓缩，细胞皱缩与周围分离，出现有膜包裹的核碎片，即凋亡小体等)进行判定. 每例选择5个高倍视野，计数1000个癌细胞，计算出凋亡细胞的百分率，即凋亡指数(apoptosis index).

统计学处理： 计量数据以x±s表示，多组间比较采用非参数统计分析方法秩和检验（KruskalWallis H检验）；两两比较采用Wilcoxon秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1肝癌生长转移A组肝癌细胞生长良好，异型性高，瘤体大于1 cm3时可见瘤体中心部干酪样坏死；癌周组织中血管丰富，管径大小不一，分布密集. B组肝癌细胞生长良好，异型性高，瘤体体积大于1 cm3时可见瘤体中心部干酪样坏死；癌周组织中血管丰富，管径大小不一，分布密集. C组肝癌细胞生长不良，异型性低，成熟分化比率高，肝癌组织中癌细胞呈片状病变区，周边部以细胞凋亡为主，而中心部以细胞坏死为主. 瘤体体积小于1 cm3时就可见瘤体中心部干酪样坏死；癌周组织中血管稀少，管径大小均匀，散在分布. D组肝癌细胞生长不良，但异型性高. 瘤体体积大于1 cm3时才可见瘤体中心部干酪样坏死；癌周组织中血管稀少，管径大小不一，分布集中. C组的抑瘤率明显高于B组(P<0.01)；而与D组的抑瘤率相比，虽数值上较低，但无统计学意义. C组抑制肝内转移率和抑制肺部转移率明显高于B组(P<0.01）；与D组相比，在抑制肝内转移率方面数值相近；而在抑制肺部转移率方面，数值上高于D组，但差异无统计学意义（表1）.

2．2肝癌、癌周组织中PCNA的表达和凋亡指数C组在肝癌、癌周组织中阳性细胞数明显低于A组和B组（P＜0.01)；与D组阳性细胞数相比，作用效果相近. C组在肝癌、癌周组织中阳性细胞数明显高于A组和B组（P＜0.01)；C组在肝癌组织肿瘤细胞凋亡指数高于D组（P<0.05，表2).表1各组模型鼠腹腔内药物注射对肝癌生长转移的影响表2各组模型鼠肝癌、癌周组织中PCNA的表达和凋亡指数

3讨论

浸润和转移是肝癌发展的基本特征［2］. 胆管浸润造成胆管狭窄梗阻，临床表现为AKP增高及梗阻性黄疸. 丹参为唇形科鼠尾草属植物（Salvia miltiorhiza Bge.），其根入药. 近半个世纪国内外学者对丹参进行大量研究,先后从中分离得到15种成分，其主要有效化学成分为脂溶性的丹参酮和水溶性的丹参素. 丹参素具有抗血小板聚集、改善微循环、调节血液流变学、增强机体免疫、逆转慢性肝病纤维化作用、抗脂质过氧化作用及对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用［3］，并在临床得到广泛应用. 随着抗癌中药研究的日益深入，丹参酮的抗肿瘤的基础和临床研究得以重视［4］. 本结果显示丹参用于肝癌致梗阻性黄疸实验模型中，C组肝癌平均瘤体较A组和B组减小,而抑癌率和抑转移率明显高于A组和B组，C组平均瘤体大小在数值虽然大于D组，但无显著性差异，提示丹参抑制肝癌生长方面与5FU抗癌药作用效果相近. 在抑转移率方面，丹参有明显抑制肝癌的肝内外转移，尤其在抑制肝癌的肺部转移方面明显优于抗癌药5FU. 在形态病理方面，D组的结果显示肝癌细胞增殖虽然受限，但异性型较高、分化不良，肿瘤血管形成虽然减少，但仍有向周围血管化浸润表现，肝内外转移倾向明显. C组的结果显示肝癌细胞增殖受限，异型性较低，肿瘤血管形成减少；特别是肝癌瘤体细胞形态表现为大量分化成熟肝癌细胞，提示丹参抗癌、抑制肿瘤转移机制可能更多地借助于促进肝癌细胞的成熟分化特性作用. 丹参用于肝癌致梗阻性黄疸时，PCNA的表达明显低于A组和B组，有显著性差异. C组肿瘤细胞凋亡指数在肝癌组织和癌周组织的表达率明显高于A组和B组，有显著性差异；即使与D组相比，C组在肝癌细胞内肿瘤细胞凋亡指数高于D组，有显著性差异， 提示丹参促进肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞的增殖.

总之，丹参在肝癌致梗阻性黄疸时，能够促进肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞增殖，促进肿瘤细胞成熟分化，对肿瘤发展起抑制作用.

【参考文献】

［1］ 夏荣龙，刘青光，潘承恩，等. 恶性梗阻性黄疸模型的建立及评价［J］. 西安医科大学学报，2001，22（5）：350-351.

［2］ 汤钊猷. 临床肝癌学［M］. 上海:上海科技教育出版社，2001：4-9.

［3］ 郭海平，吴乃峰. 复方丹参临床药理研究新进展［J］. 药学学报，2000，16（2）：105-106.

［4］ 袁淑兰，王修杰，魏于全. 丹参酮抗肿瘤作用及其机制的研究［J］. 癌症，2003，22（12）：1363-1366.