核果类果树遗传转化及检测技术研究进展
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摘要：综述了近年来国内外常见核果类果树遗传转化的研究进展，概述了目前果树遗传转化的主要方法，阐述了核果类果树遗传转化植株的主要鉴定方法，指出了当前研究中存在的一些问题，探讨了转基因研究未来的发展方向。
关键词：核果类果树；遗传转化；检测技术；发展方向
中图分类号：S662；Q789文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）04-0130-07
核果类果树是指蔷薇科李属（Prunus）、果实为核果的一类果树，包括桃、杏、李和樱桃等，是我国落叶果树的重要种类。果树长期的育种实践表明，常规杂交育种方法对核果类果树种质改良有很大的局限性；基因工程育种周期短，基因资源丰富，能最大限度地克服物种生殖隔离的障碍，实现生物界遗传物质的自由交流。自1988年首例转基因核桃成功报道以来[1]，基因转化方面的研究在果树遗传转化研究上得到了广泛应用，其在果树遗传改良中的作用越来越受到重视。本文主要综述了近年来国内外在核果类果树遗传转化方面所取得的进展，为基因工程育种提供参考和借鉴。
1常见核果类果树遗传转化的研究现状
11桃
桃转基因难度较大，多数研究只获得了转基因的愈伤组织而未能获得转基因植株。1991年Smigocki和Hammerschlag[2]用未成熟桃胚为外植体，经过愈伤组织诱导和再分化，成功将细胞分裂素合成酶基因（IPT）导入了桃，这是世界上首例也是目前为止唯一公开报道的转基因桃实例。农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法在桃遗传转化研究中均有报道[3～6]。
Smigocki等[8]早期利用Ti质粒中含细胞分裂素合成酶基因和生长素酶突变基因的根癌农杆菌与桃的成熟细胞共培养进行感染，获得了桃转化细胞及愈伤组织。Martin[9]曾用2种发根农杆菌和8种根癌农杆菌感染桃，证明了以GUS基因作为桃遗传转化的报告基因和测试包含GUS基因标记系统的农杆菌的有用性。Ognjanow[10]用带有GUS基因的农杆菌感染桃子叶转化体，GUS荧光检测与阴性对照明显不同。Hammerschlag等[11]用农杆菌tma328∶tn5转化桃成年树离体茎段，均产生了肿瘤组织，并表现出不依赖细胞分裂素的特性，转化体DNA呈阳性，初次说明了成年桃树的细胞能够被转化及根癌菌具有转化重要基因到桃树上的潜能。1991年他们又用tma328∶tn5感染未成熟桃胚，将共培养后的外植体接种在无激素的MS培养基上，诱导产生愈伤组织，这些愈伤组织在分化培养基上分化产生了芽。Ye等[6]用基因枪法轰击桃未成熟胚、胚轴、子叶、茎尖、叶片和长期胚性愈伤组织转化GUS/NPTⅡ嵌合基因，所有类型的外植体均获得了GUS基因瞬时表达，并在长期胚性愈伤组织中得到稳定表达。他们筛选出了桃组织遗传转化的最优组合，并用微粒轰击法使外源基因成功导入桃胚愈伤组织并得到稳定表达。金勇丰等[12，13]已先后从桃品种“玉露”克隆了ACC氧化酶和ACC合酶的基因，且已构建其反义植物表达体系，若转化桃获得成功，可望阻抑果实软化期该基因的表达，从而提高果实的耐贮性。现已成功获得导入了ACC氧化酶反义基因的转基因桃植株[12]，目前正在培育以观察转基因果实的性状。
李曜东等[14]将肥城桃反义PG基因通过农杆菌介导转化组培苗，转化苗在含卡那霉素培养基上筛选，获得抗卡那霉素转基因苗。吴延军等[15]以桃幼胚作为根癌农杆菌介导转化的受体，通过GUS基因瞬时表达率的分析，研究出了该转化体系的最佳实验参数，GUS瞬时表达率最高。Pérez-Clemente等[3]2004年报道以GFP为内部标记鉴定转基因桃树。万春雁等[7]2009年对桃花粉管通道法转基因技术进行初步研究，探索一种建立于组织培养之外的转基因方法。
12李
除了桃，其它核果类果树的遗传转化研究也得到广泛开展。1991年，Mante等[16]首先实现了西洋李转基因，目前已在波兰、罗马尼亚和西班牙等3个不同气候条件的国家进行了温室和大田试验。Scorza等[17，18]在李树上转化木瓜环斑病毒（PRV）外壳蛋白基因，并就转基因植株对李痘病毒（PPV）的反应进行了初步研究。1994年，Scorza等[19]成功利用带有重组质粒PGA482 gg/PPV-CP-33的致瘤农杆菌与下胚轴切段共培养获得了转PPV外壳蛋白基因的欧洲李转基因茎，在欧洲和地中海地区用于防治核果类重要病害的发生。Ravelonandro等[20～23]先后几年致力于利用转基因技术抵御李痘病侵染的研究；Yancheva等[24]利用农杆菌介导法进行了李树遗传转化的研究；Malinowski等[25]2006年成功进行了李树转PPV-CP基因的田间试验；2008年Urtubia等[26]在中国李子两个变种“Angeleno”和“Larry Anne”上用农杆菌GV3101介导转化NPTⅡ和GFP两种基因，并成功进行了检测；2011年，Ilardi等[27]研究并报道了利用转基因技术防止李痘病毒在草本寄主和核果类果树上侵染的相关研究成果。至今，转基因技术在李树上的应用已取得了一定成绩，并在一直不断地研究与进步。
13杏
1992年Machado等[28]首次通过致瘤农杆菌将PPV外壳蛋白基因成功转入杏的Kecskemeter品种，是杏转基因的首次成功。而后，Machado等[29]又进行了利用转基因技术在草本模式寄主以及杏、李上防治PPV的相关研究。2004年，Petri等[30]以杏树叶片为试材，对农杆菌介导的转基因技术的影响因素进行了优化研究，并成功筛选出最优因子。随后，有人对氨基糖苷类抗生素[31]、植物生长素、多胺与乙烯抑制剂等因素对转基因杏树叶组织选择及再生作用进行了研究报道[32]；也有研究表明，转化PRV外壳蛋白到杏树上会提高杏树对PPV的抗性 [17，18，33]。2007年，宫雪超等[34]报道了利用Southern杂交法对转基因杏和柑橘进行检测与鉴定。总之，杏树的遗传转化研究已在方法、效率以及检测等方面取得了巨大进步。
14扁桃
1995年，Archilleti等[35]报道了用含有NPTⅡ基因的致瘤农杆菌转化扁桃品种MN51和Supernova叶片，试验了不同的细菌浓度、共培养时间和卡那霉素选择前的培养时间，以期建立有效的转化和再生体系。Miguel等 [36]于1999年获得第一株转基因扁桃植株，他用离体培养的叶片外植体为起始材料首次建立了表达NPTⅡ和GUS基因的扁桃品种Boa Casta转基因克隆，有3个克隆是嵌合体；与带有相同质粒的菌株LBA4404相比，EHA105转化产生的转化子的GUS阳性频率和GUS表达单位更高。2000年，Ainsley [37]对扁桃基因转化技术的发展进行了论述；Ramesh等[38]于2006年对以扁桃为材料的农杆菌介导的遗传转化方法进行了部分改进，建立了优化的农杆菌介导转化体系，扁桃遗传转化取得了较快进展。
15樱桃
第一例转基因樱桃于1998年首次报道[39]，1999年Dolgov等[45]报道了酸樱桃的重组转化，我国科学家方宏筠等[40]也于1999年成功地将抗菌肽基因导入樱桃。Bhagwat等[41]2004年报道了甜樱桃拉宾斯和甜心的体外遗传重组；Song等[42]于2005年对酸樱桃农杆菌转化瞬时表达因素及芽再生条件进行了优化，遗传转化技术在樱桃上的应用获得了较快发展。张开春等[43]从圆叶樱桃中克隆了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）基因，为通过转基因技术操纵樱桃果实的成熟和软化奠定了良好的基础。Dolgov等[44，45]已获得7个含有抗冻基因的酸樱桃转化系，目的是为了防止春季霜冻时细胞内冰晶形成，但遗憾的是未在转化植物中表达出相应的蛋白质。
用6个不同的带有pBI121的野生型农杆菌菌株转化酸樱桃，获得了含有NPTⅡ和GUS基因的转基因茎[46]。在一种显著抗霜冻樱桃砧木（Psubhirtella cv.autumnorosa）中，用致瘤农杆菌介导的GUS基因转化实验测定了胚性培养物的转化效率[47]。用基因枪法和农杆菌介导法将35S启动子和CAM启动子引导的带有BAR和GUS基因的质粒转入樱桃矮化砧木Inmil（P incisa×P.serrulata GM9）和Damil（Pdawyckensis GM61/1）以及甜樱桃品种Summit（P avium L），在未加选择剂的情况下产生了嵌合的再生植株[48]。总之，遗传转化技术在樱桃育种方面取得了较快发展。
2核果类果树的遗传转化方法及影响因素
21农杆菌介导法
农杆菌的体内含有一些很大的质粒，在原质粒上有一段DNA称为T-DNA，在土壤农杆菌侵入细胞时，T-DNA能够插入植物细胞的基因组并稳定遗传给新分裂的细胞。人们利用T-DNA的这一特点，将其中能导致植物形成肿瘤的基因全部切除，换上需要的目的基因，就组成了一个可将目的基因带进植物细胞中去的载体。目前，核果类转基因最常用的方法是农杆菌介导的转化法。农杆菌介导的转化过程是把Ti质粒的T-DN段转移到植物的核基因组。此方法的转化效率受以下几方面因素的影响：（1）细菌的菌株对转化频率影响很大。在核果类果树上最常用的Ti质粒菌株为LBA4404、EHA105和EHA101，而常用的发根农杆菌菌株则是1855NCPPB和ATCC15834，外植体和农杆菌共培养时间一般为24～36 h，向培养基中加入抗生素（如：羧苄青霉素）来抑制细菌的生长，共培养后，除菌十分关键；（2）转化细胞的选择。常用卡那霉素，因为核果类的大多数种质对卡那霉素高度敏感，卡那霉素的浓度和加入时间根据外植体和物种的不同进行预先实验；（3）转化细胞能否高效地再生是转化的主要问题，核果类果树再生困难；（4）导入的外源DNA在植物基因组中的稳定性，避免外源基因的瞬时表达和形成嵌合体。
22基因枪法
基因枪是1987年美国康奈尔大学Sanford等人首先发明的，是凭借高速运动的金属微粒将附着其表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质转化技术[49]。基因枪法也常用于果树的遗传转化，基因枪微弹轰方法可用于任何植物组织的转化，而且报告基因的瞬时表达便于分析基因表达的组织特异性，但获得稳定转化的频率较低。Ye等[6]用基因枪轰击桃外植体
转化GUS/NPTⅡ嵌合基因，并在长期胚性愈伤组织中得到GUS基因的固定表达。此方法的转化效率受以下几方面因素的影响：（1）基因枪轰击参数：DNA 包裹和射击过程中的各种物理参数因基因枪类型不同而有所差别。以PDS-1000/He 型基因枪为例，金粒形状较均匀，对受体细胞没有太大的损伤，转化效果较好。氦气的压力是决定金属粒子飞行速度的主要因素，压力过大会对植物细胞造成伤害，压力过小，金属粒子不能进入细胞。此外，金属粒子大小、载体膜的位置和靶材料的位置等参数，也与其他射击参数相互联系，应根据实验具体设置。（2）微弹射程：微弹射程指基因枪挡板与靶细胞间的距离，它是影响基因转化率的重要因素，植物组织中只有特定的细胞具有再生能力，需根据受体材料选择合适的距离；转化率与弹膛内的真空度呈正相关关系，但要考虑靶细胞对真空度的耐受性；适当的轰击次数有利于目的基因的表达，轰击次数过多往往会使轰击细胞损伤严重，降低转化率；DNA 的纯度和浓度均会影响转化率，目前普遍采用的DNA 浓度为1 g/L；氯化钙与亚精胺常用作DNA 的沉淀剂，其浓度对转化率也有影响。Klein 报道氯化钙的最适宜浓度为19～24 mol/L，亚精胺的最适宜浓度为769×10-3～769×10-3 mol/L[49]。（3）受体的生理因素：受体的生理因素主要指受体细胞或组织的生理状态。一般认为，生理活性高的组织或细胞有利于外源DNA 的摄入与整合，选用再生能力强的外植体作为转化受体，提高转化率。
主要的基因转化方法除了上述两种方法外，还有微注射法、电击法和花粉管通道法[7]。如Vardi等[50]用PEG法将CAT基因和NPTⅡ基因导入柠檬原生质体获得再生植株；Oliveira[51]用电击法及PEG法转化猕猴桃原生质体获得成功。木本果树遗传转化上应用的方法还有DNA直接摄取法[52]、碳化硅法[53]、电泳法[54]等。
3转基因植株的检测鉴定
遗传转化后，先通过抗性筛选获得抗性芽后生成植株，再对抗性植株进行检测，检测阳性的植株才是真正的转基因植株。常用的检测方法有GUS活性检测、PCR技术杂交检测、免疫学检测。
31GUS活性检测
GUS基因是研究外源基因瞬时表达转化试验中的报告基因。GUS 基因3′端与其他结构形成的融合基因能正常表达，所产生的融合蛋白仍具有GUS 活性，这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件，这是它的一大优点。在实验过程中要设定严格的阴性对照，GUS 活性的检测方法有很多，包括组织化学法、色谱法、荧光法等。GUS活性检测多采用组织化学染色法，转化组织与对照组织相比呈可区分的蓝色。GUS活性检测是柑橘[55]转基因植株检测的一种常规方法，在转基因植株鉴定中有着广泛应用。
32PCR技术
转基因植物核酸水平上的检测实质是检测插入的外源基因，主要的检测方法是多聚酶链反应（PCR）技术。PCR技术是近几年发展起来的一种体外扩增特异性DN段的技术，主要有常规定性PCR技术、多重PCR技术（MPCR）、PCR-GeneScan、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、电化学发光PCR （ECL-PCR）、PCR-ELISA法。其中，PCR-ELISA 法能半定量检测转基因成分含量；qRT-PCR 能定量检测转基因含量，且采用闭管分析，有效消除了核酸的交叉污染，是适合植物转基因检测鉴定的一种快速、灵敏、准确、实用的方法。总体来说，PCR 反应灵敏度较高，但易出现假阳性结果，常采用Southern 杂交、酶切、测序等进一步验证其结果。PCR已成功用于柑橘转基因植株的检测[55]；杨东燕等[56]采用PCR技术建立了对抗环斑病毒转基因番木瓜55-1进行品系鉴定的检验方法。
33杂交检测
外源基因导入植物后，转基因植株在DNA、RNA及蛋白质水平上均与对照存在差异，这三种水平的差异可分别通过Southern杂交、Northern杂交和Western杂交得到检测。核酸分子杂交是根据外源基因序列设计探针，将探针与待测核苷酸序列杂交，由杂交结果判断待测基因片段是否与已知外源基因同源。核酸分子杂交检测转基因成分具有灵敏度高、特异性强的特点，但杂交程序复杂，对实验技术要求较高，用于检测所转化植株中外源基因的整合（Southern 杂交）和表达（Northern杂交），有时也用来验证PCR产物的准确性。大多数转基因植株都采用Southern杂交检测基因是否整合，在柑橘、杏的转基因检测中得到广泛应用[34]。而通过Northern或Western杂交则可以检测基因是否表达，Northern杂交于草莓中得到广泛应用[34]。
34免疫学检测
免疫学检测是蛋白质水平的一种检测方法，主要的方法是免疫酶联吸附法（ELISA）。ELISA原理是利用抗原和抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。陈松等[57]和秦崇涛等[58] 研究表明双抗夹心ELISA 法能对转基因含量进行定量检测。基于ELISA 法的改进方法还有试纸检测，与常规ELISA相比，不同之处是以硝化纤维代替聚苯乙烯反应板为固相载体，外源蛋白特异结合的抗体上联结了显色剂被固定在试纸条内，检测时只需将试纸条插入待测样品的提取物中，就可以快速测定被测样品中是否含有被检测的转基因蛋白。目前国内已有用一张试纸检测转基因番茄[59]的报道。应用ELISA 法和试纸条检测转基因产品，只限于几个种类，主要是因为有些插入的外源基因本身不表达蛋白质或表达量很低或表达量变化很大，很容易出现假阴性结果，而且制备特异的酶标抗体较为复杂。
综合目前的转基因检测手段，虽然检测方法丰富，但都有其优势和不足。目前国内已经建立了大豆、油菜、玉米、蔬菜、烟草、饲料、食品等的转基因检测体系，但尚未建立有效的水果转基因检测体系，因此，完善转基因检测体系和建立果树转基因体系意义深远。
4果树转基因研究存在的问题和展望
果树转基因虽然取得了较快的发展，但研究中还存有一些潜在问题：食品安全性问题、病虫的抗性问题、环境生态平衡问题等。另外，转基因技术方面也存在一些问题：转基因尚未能定点、定量导入受体基因组中并获得稳定、高效的表达和遗传，且又不影响受体生物原有优良性状的表达。如：AC/DS转座系统建立的载体，其宿主范围广，提高了转化效率，并能有效地将大片段DNA以完整的单拷贝方式整合到宿主染色体上。再如：利用核基质附着区序列，将转基因与周围染色质分离开来，使转基因表达不受染色体上整合位点的影响，形成一个独立调节的染色质区域，这样转基因表达水平就会随拷贝数增加而明显增强。
展望果树遗传转化工程，未来的研究应集中在下列几个方面：（1）进一步建立完善高效稳定的果树目的基因的转化体系；（2）加快果树目的基因的分离与克隆。除利用模式植物中已转化成功的目的基因外，加快果树本身基因的分离已成当务之急；（3）开展果树转基因植株的产业化发展；（4）加大对果树基因工程生物安全性及生态问题的关注。
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