槲皮素—7—硫酸酯钠体外抗氧化作用
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[摘要] 目的 探讨槲皮素-7-硫酸酯钠（SQMS）的体外抗氧化活性。 方法 取小鼠肝组织，匀浆，体外孵育，分光光度法检测不同浓度SQMS（0.10、0.25、0.50 mmol/L）对肝组织中丙二醛（MDA）含量、总抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响。 结果 与空白组相比，不同浓度SQMS（0.10、0.25、0.50 mmol/L）均能显著降低肝组织中MDA的含量；中、高浓度SQMS（0.25、0.50 mmol/L）能显著升高肝组织T-AOC；低、中浓度SQMS（0.10、0.25 mmol/L）对肝组织SOD活力有显著升高作用。 结论 SQMS具有较强的体外抗脂质过氧化作用及抗氧化能力，其抗氧化可能与提高SOD活力有关。
[关键词] 槲皮素-7-硫酸酯钠；肝组织匀浆；体外；抗氧化
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（c）-0014-03
活性氧所引起的氧化应激参与了很多疾病的病理生理过程，氧自由基是机体组织多种疾病的发病源，例如缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、帕金森症等。活性氧包括过氧化氢、超氧阴离子和羟基自由基等。活性氧的过度产生会损伤机体脂类、蛋白质和DNA等[1]。药用植物的抗氧化等性质在人类的健康研究中体现出重要的作用[2]。植物提取的黄酮类显示出抗氧化等性质[3]。大量研究表明，黄酮类化合物（如槲皮素、芦丁和柚木素等）有抗氧化和清除自由基的作用，改善氧自由基对组织的损伤，因而表现有抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤和防治心血管疾病等多种药理作用[4]。有研究证明黄酮类体内抗氧化作用不显著[5]，这与体内的代谢酶有关，在一定程度上受到年龄、性别和疾病等的影响[6]。槲皮素是黄酮类家族中的一员，但难溶于水，生物利用度低，这些都限制了槲皮素的给药途径和临床应用。槲皮素-7-硫酸酯钠（SQMS）是人工半合成的槲皮素水溶性衍生物，刘文等[7]实验证明SQMS具有抗血小板凝聚，进而起到抑制血栓形成的作用。笔者前期研究发现SQMS在体外有较强的清除氧自由基、羟自由基和DPPH的作用，并对大剂量维生素C所致的DNA氧化损伤有保护作用[8]。本文进一步探讨SQMS对小鼠体外肝组织匀浆自氧化的作用。
1 仪器与试药
1.1 仪器
二列机智能水浴 ZKSY-1（巩义市予华仪器有限责任公司）；恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司）；离心机（江苏正基仪器有限公司）；VORTEX-GENIE（Scientific Industries INS.）；BioTek酶标仪（美国）；电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；NanoDrop spectrophotometer（NanoDrop 1000；NanoDrop Technology）。
1.2 试药
SQMS（由广东医学院生化教研室提供）；维生素C（Amreso，usp grade）；丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所，其余试剂为分析纯。
1.3 动物
昆明小鼠由广东医学院动物中心提供。
2 方法
2.1 小鼠肝匀浆制备
小鼠禁食12 h后，脱颈椎处死，快速取出小鼠的肝脏，在冷生理盐水中反复漂洗，洗净肝组织上的残血和结缔组织，并用滤纸吸干组织表面的水分，称重，在冰浴上剪碎组织，加冷的生理盐水配置10%（W/V）的组织匀浆，4℃保存待用。
2.2 药物配置
SQMS配置成三个浓度，分别为0.10、0.25、0.5 mmol/L，维生素C浓度为0.25 mmol/L，空白组加等量的生理盐水。
2.3 MDA含量的测定
根据Su等[9]的实验方法，分别取1 mL肝组织匀浆，空白组加0.1 mL生理盐水，实验组分别向其中加入维生素C和不同摩尔浓度的SQMS溶液0.1 mL，振荡混均后置于37℃恒温水浴孵育1 h，取上清液按照MDA试剂盒说明书进行操作。
2.4 T-AOC的测定
分别取1 mL肝组织匀浆，空白组加0.1 mL生理盐水，实验组分别向其中加入维生素C和不同摩尔浓度的SQMS溶液0.1 mL，振荡混均后置于37℃恒温水浴孵育1 h，取上清液按照T-AOC试剂盒说明书进行操作。
2.5 SOD的测定
分别取1 mL肝组织匀浆，空白组加0.1 mL生理盐水，实验组分别向其中加入维生素C和不同摩尔浓度的SQMS溶液0.1 mL，振荡混均后置于37℃恒温水浴孵育1 h，取上清液按照SOD试剂盒说明书进行操作。
2.6 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 相同浓度的维生素C和SQMS对体外肝匀浆MDA含量、T-AOC、SOD活力的影响
与空白组比较，维生素C（0.25 mmol/L）极显著降低肝组织中MDA的含量（P < 0.001），SQMS（0.25 mmol/L）亦显著降低肝组织MDA的含量（P < 0.05）；维生素C（0.25 mmol/L）和SQMS（0.25 mmol/L）显著升高肝组织T-AOC（P < 0.01）；维生素C（0.25 mmol/L）和SQMS（0.25 mmol/L）升高SOD活力，但差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
3.2 不同浓度SQMS对体外肝匀浆MDA含量、T-AOC、SOD活力的影响
与空白组比较，不同的浓度的SQMS都能显著降低MDA含量（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001）；SQMS（0.10 mmol/L）能提高T-AOC，但结果无差异（P > 0.05），SQMS（0.25 mmol/L）能显著提高T-AOC（P < 0.01），SQMS（0.50 mmol/L）能极显著提高T-AOC（P < 0.001）；SQMS（0.10 mmol/L）能显著提高SOD活力（P < 0.05），SQMS（0.25 mmol/L）能极显著提高SOD活力（P < 0.01），SQMS（0.50 mmol/L）能稍微提高SOD活力，但结果无差异（P > 0.05）。见表2。
4 讨论
氧自由基的水平可引起机体氧化应激，影响机体内氧化和抗氧化系统的平衡，引起炎症等反应，损伤细胞膜，导致细胞凋亡等，结果会产生疾病和衰老，包括糖尿病、动脉粥样硬化等多种疾病的发生发展。近年来，有关黄酮类化合物抗氧化性质的研究已越来越受到重视，黄酮类化合物能够清除活性氧对机体所产生的氧化应激，保护和维持机体氧化与抗氧化的平衡[10]。
槲皮素（quercetin，3，3'，4，5，7-五羟基黄酮）是一种广泛存在于各种天然植物中的常见的类黄酮化合物，是近百种中草药的有效成分之一，也是人类膳食中常见的类黄酮化合物之一。已有研究证实，槲皮素具有抗氧化、降血压、舒张激动剂诱导的主动脉收缩、扩张冠脉、抑制血小板聚集和抗心律失常等多方面药理活性[11]。由于槲皮素不溶于水、口服吸收少、生物利用度低、代谢快，难以在组织中达到有效的治疗浓度，限制了槲皮素的应用研究[12]。有实验通过对槲皮素衍生物的抗氧化等性质进行了研究（如槲皮素3位羟基衍生物）[13-14]。有关槲皮素的化学修饰开展较早，大多以槲皮素为先导化合物加以结构修饰，以改善其药效学性质，但迄今还未找到活性更强的槲皮素衍生物。通过合成修饰成新的衍生物进行抗衰老和抗炎症等的研究为临床的应用提供新的思路[15]。近来有研究显示，提高槲皮素水溶性有助于提高其药理活性和降低毒性[16]。SQMS是近来通过磺化反应人工半合成的槲皮素水溶性衍生物，笔者前期研究发现SQMS在体外有较强的清除氧自由基、羟自由基和DPPH的作用，并对大剂量维生素C所致的DNA氧化损伤有保护作用[8]。本文研究结果显示，SQMS能降低体外肝组织匀浆自氧化所产生的MDA含量，并能提高肝组织T-AOC，进一步提示SQMS体外有强的抗氧化活性，可通过抑制氧自由基生成减轻活性氧对机体组织造成的损伤，从而维持肝组织氧化还原系统的平衡。此外，本文研究结果还显示，SQMS对体外肝组织匀浆SOD活力有提高作用，提示SQMS在一定程度上可能通过提高此酶活性而发挥清除氧自由基的作用，但SQMS还有可能通过其他抗氧化酶，如谷胱甘肽过氧化物酶，或是非抗氧化酶如谷胱甘肽而发挥抗氧化活性，从而减少MDA的生成，降低氧自由基所带来的危害和避免氧自由基对DNA的损伤。
综上所述，SQMS体外有抑制肝组织MDA生成、提高T-AOC和SOD活力的作用，体现了较强的抗氧化活性，但其具体抗氧化机制还有待进一步研究证实。
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（收稿日期：2013-01-22 本文编辑：卫 轲）