镉胁迫对生菜种子萌发及幼苗生理特性的影响
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摘要：水培条件下，以生菜（Lactuca sativa L.）种子为供试材料，研究0、5、10、20、40 mg/L镉（Cd2+）处理对生菜种子萌发及幼苗生理特性的影响。结果表明，低浓度Cd2+（5 mg/L）胁迫对生菜种子萌发具有明显的刺激作用，其中种子的发芽势较没有Cd2+胁迫处理的增加63.64%;发芽指数和活力指数均达到最大值，分别为40.30和119.29;而随着营养液中Cd2+浓度的进一步升高，种子的萌发表现出明显的抑制作用，发芽势、发芽率显著降低，发芽指数和活力指数逐步减小，且处理浓度越高种子发芽的抑制作用越明显。与没有Cd2+胁迫的处理相比，低浓度Cd2+（5 mg/L）胁迫对生菜幼苗生长也具有促进作用，根长、芽长、鲜质量增幅分别为16.04%、11.61%和11.59%，且生菜幼苗叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量以及叶绿素总量的水平均显著升高;当Cd2+浓度>10 mg/L时，生菜幼苗生长明显受到抑制，且叶绿素a含量、叶绿素b含量以及叶绿素总量的水平均显著降低。相比较而言，Cd2+胁迫对生菜幼苗根生长的抑制作用大于对地上部的抑制作用，Cd2+胁迫对生菜幼苗叶片叶绿素a的影响作用小于对叶绿素b的影响。此外生菜幼苗根组织中丙二醛含量随Cd2+浓度的增大而显著增加。
关键词：镉胁迫;生菜（Lactuca sativa L.）;种子萌发;叶绿素;丙二醛
中图分类号：S604;S636.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4892-05
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.20.031
Effects of Cadmium Stress on Seed Germination and Physiological
Characteristics of Lettuce Seedling
XU Jie， HU Bo-hua， GE Tao， CHEN Qin
（College of Biological， Chemical Sciences and Engineering， Jiaxing University， Jiaxing 314001， Zhejiang， China）
Abstract： Effects of cadmium stress on seed germination and physiological characteristics of lettuce seedling were studied under five Cd2+ concentrations （0， 5， 10， 20， 40 mg/L） with solution culture. The results showed that low Cd2+ concentration stress（5 mg/L）significantly promoted the seed germination. The germination energy was increased by 63.64 % compared with the treatment with no Cd2+. Both the germination index and the vigor index reached the maximum of 40.30 and 119.29， respectively. The seed germination was significantly inhibited with the increase of Cd2+ concentration. The germination energy and the germination rate significantly decreased. The germination index and vigor index decreased gradually. The higher Cd2+ concentration， the more obvious inhibition of seed germination. The growth of lettuce seedling was promoted over 5 mg/L Cd2+ concentration compared with the treatment with no Cd2+. The increasing amplitude of root length， bud length and fresh weight was in the order of 16.04%， 11.61% and 11.59%. The contents of chlorophyll a， the chlorophyll b and the total chlorophyll increased significantly. With increase of Cd2+ concentration （Cd2+>10 mg/L） in nutrient solution， the seedling growth was depressed greatly. The contents of chlorophyll a， the chlorophyll b and the total chlorophyll decreased dramatically. Cd2+ had a stronger inhibiting effect on the growth of root than on the aerial part of seedling. The effects of Cd2+ on chlorophyll was lower than that on chlorophyll b. The content of MDA of seedling roots increased significantly with the increase of Cd2+ concentration.
Key words： Cd2+ stress; lettuce（Lactuca sativa L.）; seed germination; chlorophyll;MDA
生菜（Lactuca sativa L.）又称叶用莴苣，属于1～2年生菊科莴苣属草本植物[1]。生菜作为一种富含矿物质和维生素的蔬菜，由于其具有较高的营养价值而被大众广泛食用。由于消费量的逐年增加，其种植面积也在不断扩大[2]。
镉（Cd2+）作为有机体的非需元素， 属于环境中具有较高毒性的污染物并具有强烈的“三致”效应[3]，其存在不仅会影响农作物的生长[4]，而且最终会通过食物链对人体健康构成潜在威胁。环境中过量Cd2+的存在主要源于冶金、电镀等行业“三废”物质的无序排放、不合理处置，以及污水灌溉和含Cd2+肥料的施用等[5]。据文献报道，我国农田Cd2+污染面积已经达到2.8×105 hm2，涉及11个省市的25个地区，而由此产生的Cd2+含量超标农产品每年可达1.46×1010 kg[6，7]。
目前有关Cd2+胁迫对油菜[8]、小白菜[9]、黄瓜[10]、丝瓜[11]等蔬菜、农作物生长发育的影响已有不少报道，但关于对生菜Cd2+胁迫的试验研究甚少。种子萌发期生长状况条件的变化将会直接影响作物后期的生长，尤其是重金属污染物所产生的胁迫作用。为此笔者研究了Cd2+胁迫对生菜种子萌发及幼苗部分生理特性的影响，研究结论对生菜抗Cd2+栽培、控制Cd2+对生菜的污染具有一定的理论和现实意义，也能为明晰Cd2+污染对农业和生态安全的影响提供必要的基础资料，并为Cd2+污染治理提供相关的理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试生菜（Lactuca sativa L.）品种为玻璃生菜。
1.2 试验设计
选择大小均匀一致、子粒饱满的生菜种子，先用5 g/L的K2MnO4溶液浸泡10 min进行消毒处理，随后用去离子水冲洗干净， 用滤纸将种子表面的水分吸干。将每份43粒种子置于垫有纱布的玻璃培养皿中，每个培养皿中加入含不同浓度Cd2+的营养液15 mL（营养液浸透纱布并完全浸润种子）。试验所用的营养液为改良的Hogland营养液，营养液组分如下（μmol/L）：1 000 Ca（NO3）2， 500 KH2PO4， 500 MgSO4， 23 H3BO3， 45 MnSO4， 0.8 CuSO4， 0.5 ZnSO4， 0.5 Na2MoO4， 5 Fe-EDTA。将CdSO4・ 8H2O加入营养液配制成含5、10、20、40 mg/L Cd2+的营养液，将溶液pH调至6.0， 以不含Cd2+的营养液为空白对照（CK）。每个处理3个重复， 每个重复一个培养皿。最后将培养皿放入恒温光照培养箱培养， 培养箱温度控制在25 ℃， 光周期为10 h（昼）/14 h（夜）。培养期间每隔2 d更换1次营养液。试验期间对种子的发芽情况及幼苗生长情况进行观测，培养第七天对幼苗叶片的叶绿素含量及根组织中的丙二醛含量进行测定。
1.3 测定项目与方法
1.3.1 种子活力的测定 处理24 h后开始统计种子的发芽数（以胚根长度为种子纵径长度一半为标准），发芽情况每隔1 d记录1次。第三天统计发芽势、第五天统计发芽率并计算发芽指数和活力指数。发芽势=发芽初期正常发芽粒数（本试验为3d）/供试种子数×100%;发芽率=发芽终期全部正常发芽粒数（本试验为5 d）/供试种子数×100%;发芽指数（Gi）=Σ（Gt/Dt），式中Gt为Dt相对应的每天的发芽种子数，Dt为发芽时间;活力指数（Vi）=发芽指数（Gi）×S，式中S为发芽终期幼苗根的长度加上芽的长度。
1.3.2 其他测定方法 生长量的测定：种子发芽后（培养第七天），对幼苗的根长、芽长进行测量，按常规方法测定幼苗根长、芽长和植株鲜质量。采用邹琦[12]的方法对生菜幼苗叶片的叶绿素含量进行测定;采用硫代巴比妥酸比色法测定生菜幼苗根组织中的丙二醛（MDA）含量[13]。
1.4 数据分析
数据结果均为3次重复试验的平均值，采用SPSS 13.0统计分析软件进行相关数据的分析及差异显著性检验，采用Excel软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 镉胁迫对生菜种子活力的影响
种子活力属于复合概念，包括发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数等，能反映出种子对外界不良环境的耐受力和生产潜力等[14]。不同浓度的Cd2+对生菜种子活力的影响见表1。
由表1可知，不同浓度的Cd2+胁迫处理对生菜种子的活力存在不同的影响。低浓度Cd2+（5、10 mg/L）对生菜种子萌发具有显著的刺激作用，当Cd2+浓度为5 mg/L时，生菜种子的发芽势较对照增加63.64%;当Cd2+浓度为10 mg/L时，生菜种子的发芽势较对照增加了36.36%。而随着营养液中Cd2+浓度的继续升高，生菜种子的萌发表现出明显的抑制作用。
种子发芽率反映了种子发芽的多少，发芽势则能反映出种子发芽的速度和整齐度。由表1可知，与空白对照相比，低浓度Cd2+胁迫（5、10 mg/L）对生菜种子的发芽率不存在影响;而当Cd2+的浓度达到20 和40 mg/L时，种子的发芽率显著降低，且胁迫浓度越高种子发芽的抑制作用越明显，与空白对照相比发芽率分别降低了17.07%和24.39%。
种子的活力指数和发芽指数是反映种子品质的另外2个重要指标。其中活力指数既能反映发芽率、发芽速度，又能反映生长势及生长活力;而发芽指数则能够反映种子的综合活力[15]。由表1可知，低浓度Cd2+胁迫可以显著增加种子的发芽指数和活力指数，当Cd2+浓度为5 mg/L时，生菜种子的发芽指数和活力指数均达到最大值，分别为40.30和119.29;随着Cd2+浓度的升高，生菜种子的发芽指数和活力指数逐步减小。说明生菜种子对低浓度Cd2+（≤5 mg/L）具有一定的耐性;但随着Cd2+胁迫的增强，当Cd2+浓度≥10 mg/L时，Cd2+胁迫对生菜种子的品质会产生一定程度的影响。
2.2 镉胁迫对生菜幼苗生长的影响
幼苗生长是检测土壤等环境污染的重要指标之一[16]。不同浓度Cd2+胁迫对生菜幼苗生长的影响结果见图1和表2。
由图1可知，与空白对照相比，当水培液中Cd2+浓度为20和40 mg/L时，生菜幼苗叶片出现黄化现象，且幼苗植株矮小，根系末端局部枯焦;而低Cd2+浓度（5 mg/L和10 mg/L）胁迫处理与空白对照相比幼苗生长则未出现明显的受抑制现象。
由表2可知，当Cd2+浓度为5 mg/L时，与对照处理相比，根长和芽长显著升高（根长增幅为16.04%，芽长增幅为11.61%，鲜质量增幅为11.59%）。随着Cd2+浓度（10～40 mg/L）的升高，与对照相比，根长和芽长显著降低，且浓度越高生长抑制作用越大。当Cd2+浓度为10 mg/L时，与对照相比，根长、芽长和鲜质量的抑制幅度分别为23.58%、46.45%和10.78%;当Cd2+浓度为20 mg/L时，与对照相比，根长、芽长和鲜质量的抑制幅度分别为60.38%、54.84%和21.29%;当Cd2+浓度为40 mg/L时，与对照相比，根长、芽长和鲜质量的抑制幅度分别为81.13%、62.58%和43.80%。相比较而言，Cd2+胁迫对生菜幼苗根生长的抑制作用大于对地上部的抑制作用。
2.3 镉胁迫对生菜幼苗叶片叶绿素合成的影响
在重金属胁迫环境下，植物的光合作用一般会受到抑制，其主要原因是叶绿素含量有所下降。生菜幼苗生长到第七天时，利用分光光度计测定各处理组幼苗叶片叶绿素的含量，不同浓度Cd2+胁迫对生菜幼苗叶片叶绿素含量的影响结果见表3。
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素物质，植物叶绿体中的叶绿素包括叶绿素a和叶绿素b，其含量的高低可以反映出植物光合作用的强弱[17]。由表3可知，当水培营养液中Cd2+浓度较低（5 mg/L和10 mg/L）时，与空白对照相比，生菜幼苗叶片中叶绿素a含量、叶绿素总量的水平均显著升高，这也进一步说明低Cd2+胁迫促进生菜幼苗的生长;而当水培营养液中Cd2+浓度较高（20 mg/L和40 mg/L）时，与空白对照相比，生菜幼苗叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量以及叶绿素总量的水平均显著降低，且浓度越高抑制作用越明显。而幼苗叶片叶绿素a/叶绿素b比值则随着Cd2+浓度的升高呈上升趋势。
2.4 镉胁迫对生菜幼苗根组织丙二醛含量变化的影响
不同浓度Cd2+胁迫对生菜幼苗根组织中MDA含量变化的影响结果图2。
由图2可知，与空白对照相比，Cd2+胁迫处理均导致幼苗根组织中的MDA含量显著增加，当Cd2+浓度≥10 mg/L时，随着营养液中Cd2+浓度的增大，MDA含量显著增加，且各处理间均存在显著差异;而当Cd2+浓度为5、10 mg/L时，两处理之间不存在显著差异。这些结果表明，高浓度Cd2+胁迫处理诱导生菜幼苗根细胞发生膜脂过氧化，对根细胞造成了明显的毒害作用，且毒害作用与根细胞内活性氧自由基的过剩累积有关。
3 小结与讨论
种子萌发阶段属于植物对外界环境因子最为敏感的阶段[18]。通过观察逆境胁迫下植物种子的萌发状态，可以较为系统地认识该逆境环境对植物的伤害作用机理。研究发现低浓度的Cd2+胁迫能促进野茼蒿种子的萌发，而高浓度的Cd2+胁迫则对其种子萌发产生明显的抑制作用[19]。吴鹏等[20]的研究结果也表明，低浓度Cd2+对大豆种子的发芽率、发芽势、活力指数均有促进作用， 而Cd2+浓度增大则出现明显的抑制作用。这些结论与本试验的研究结果相一致。本研究的结果表明， 生菜种子对低浓度Cd2+（≤5 mg/L）具有一定的耐性;但随着Cd2+胁迫的增强，当Cd2+浓度≥10 mg/L时对生菜种子的品质会产生一定程度的影响。段昌群等[21]认为之所以低剂量、短时间的重金属胁迫会促进植物种子的萌发，主要是因为低剂量、短时间的重金属胁迫可以提高或加速植物的某些生理生化反应。比如低浓度的Cd2+胁迫有可能在短时间内促进生菜种子萌发初期的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等相关酶的活性，加速种子胚乳中营养物质的降解，促进其萌发代谢，从而提高生菜种子的发芽率;而过高浓度的Cd2+由于会影响淀粉酶、蛋白酶的活性使得种子内贮藏的淀粉和蛋白质的分解减弱，导致生菜种子萌发所需要的物质和能量获取不足，因而对其萌发产生抑制作用。
种皮是种子抵抗外界逆境的一道有效屏障，当胚根萌动导致种皮破裂时，外界环境中的重金属离子就会直接进入从而降低胚芽组织相关水解酶的活性，影响幼苗萌发时对营养物质的获取，使得幼苗由于早期生长供能不足而发育迟缓[22]。本研究发现，与空白对照相比，低浓度Cd2+（5 mg/L）胁迫对生菜幼苗生长具有促进作用，根长、芽长、鲜质量增幅分别为16.04%、11.61%和11.59%;而当水培液中Cd2+浓度为20和40 mg/L时，生菜幼苗植株矮小（根长、芽长和鲜质量均受到明显抑制）、根系末端局部枯焦，叶片出现黄化现象。研究认为，Cd2+胁迫造成植物幼苗生长发育迟缓的主要原因在于Cd2+能导致植物细胞染色体出现断裂、黏连、畸变甚至液化的现象，同时通过影响钙调蛋白（CaM）参与纺锤丝微管蛋白的组装拆卸而导致细胞分裂周期延长，进一步抑制细胞分裂并最终导致幼苗根系生长受阻[23，24]。
在大多数情况下，叶片叶绿素含量降低意味着植物光合作用减弱，而光合作用减弱则会进一步影响到植物的新陈代谢活动。本研究结果表明，当Cd2+浓度>10 mg/L时，与空白对照相比，生菜幼苗叶片中叶绿素a、叶绿素b含量以及叶绿素总量的水平均显著降低，且浓度越高抑制作用越明显。究其原因，有研究认为Cd2+胁迫会导致植物叶片细胞的叶绿体结构受损，因而导致叶绿素的生物合成受阻[25]。也有研究认为Cd2+胁迫会同时抑制植物叶片细胞中δ-氨基-γ-酮戊二酸的合成和叶绿素酸酯还原酶的活性，而这两者是叶绿素合成的关键因子，因此导致叶细胞中叶绿素的合成受阻[26]。此外，还有研究认为Cd2+可以与酶蛋白的-SH基或其他活性基团结合，影响植物对营养元素Zn、Fe等的吸收和转移而导致叶绿素降解[27]。在植物光合作用的过程中，叶绿素b主要负责光能的收集，叶绿素a则主要负责光能的转化， 叶绿素a/叶绿素b则是表征植物受逆境胁迫损害程度大小的生理指标之一[28，29]。研究发现，在Cd2+胁迫条件下， 黄菖蒲叶片的叶绿素a/叶绿素b的比值有增大趋势[30];而番茄叶片的叶绿素a/叶绿素b比值则出现降低趋势[31]。本研究发现生菜幼苗叶片叶绿素a/叶绿素b比值随着Cd2+浓度的升高呈上升趋势，说明Cd2+胁迫对生菜幼苗叶片叶绿素a的影响小于对叶绿素b的影响。研究结论的差异可能是因为不同种类植物叶片中的光合色素对Cd2+胁迫的敏感程度存在一定差异。
植物在逆境环境下，细胞膜中的不饱和脂肪酸会在活性氧自由基的攻击下发生过氧化作用而生成MDA，从而造成细胞质膜受到损伤，导致细胞质膜的选择受到破坏，并最终导致细胞内电解质大量外渗。因此植物不同组织器官MDA含量的高低变化可以反映细胞膜脂过氧化作用的强弱及细胞质膜的变性程度[32]。本研究结果表明，生菜幼苗根组织中内膜脂过氧化的程度受Cd2+胁迫浓度的影响非常明显，水培液中Cd2+浓度越高，幼苗根组织中的MDA含量越高，细胞膜脂过氧化作用越强，幼苗受到的毒害作用越大。
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