民族药刺齿凤尾蕨抑制人源结肠癌细胞活性成分研究

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[摘要] 目的 研究民族药刺齿凤尾蕨抑制人源结肠癌细胞活性成分。 方法 采用95%乙醇提取药材，聚酰胺色谱、葡聚糖凝胶色谱以及制备型高效液相色谱等技术获取化合物，磁共振波谱技术（NMR）对得到的化合物进行结构鉴定。磺酰罗丹明B比色法（SRB）对化合物进行体外抗肿瘤活性筛选。 结果 从刺齿凤尾蕨中分离得到5个二萜类化合物，分别鉴定为geopyxin A（1），geopyxin C（2），ent-11β-acetoxykaur-16-en-18-ol（3），7β，16α，17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid（4）和neolaxiflorin K（5）。活性筛选表明化合物1，2和5具有显著的抑制人源结肠癌细胞活性，IC50值分别为1.20、2.45和3.26 μmol/L。 结论 化合物1～5首次从刺齿凤尾蕨中分离得到。

[关键词] 刺齿凤尾蕨；化学成分；体外抗肿瘤活性

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（a）-0020-04

Study on chemical constituents and their inhibition of anthropogenic colon cancer cells bioactivity from ethnic medicine Pteris dispar

SUN Dan ZHANG Yan SUN Qiang PENG Yubo WANG Lei

Jiamusi College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Jiamusi 154007， China

[Abstract] Objective To study the inhibition of anthropogenic colon cancer cells activity constituents of Pteris dispar. Methods The medicinal materials were extracted by 95% ETOH. Compounds were obtained by kinds of chromatographies including polyamide， Sephadex LH-20 and pre-HPLC and the structures identified by NMR. In vitro antitumor activity was tested by SRB methods. Results 5 compounds were obtained from the plant and their structures were established as geopyxin A （1）， geopyxin C （2）， ent-11β-acetoxykaur-16-en-18-ol （3）， 7β， 16α， 17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid （4） and neolaxiflorin K （5）. Compounds 1， 2 and 5 showed strong in vitro antitumor activity against HCT-116， with IC50 values of 1.20， 2.45 and 3.26 μmol/L respectively. Conclusion Compounds 1-5 are obtained from Pteris dispar for the first time.

[Key words] Pteris dispar； Chemical component； In vitro antitumor activity

刺X凤尾蕨为凤尾蕨科（Pteridaceae）凤尾蕨属药用植物，具有清热解毒，凉血去痰的功效[1]，该药用植物含有凤尾蕨属植物特征性成分贝壳杉烷型二萜类化合物[2]，该类成分具有广谱的抗肿瘤活性[3]。国内外学者对该类化合物进行了大量的研究，发现了一些化合物具有显著抗肿瘤活性[3]。如我国天然药物学家孙汉董院士对该类成分进行了系统的研究[4-8]。其中冬凌草甲素具有疗效确切的抗肿瘤活性，是非常有希望成为新抗肿瘤制剂的先导化合物[9-12]。然而，刺齿凤尾蕨作为一种富含贝壳杉烷型二萜类成分的民族药，对其蕴含的大量二萜成分的结构和抗肿瘤活性没有得到深入研究。本课题组从该植物中分离得到5个二萜类成分，其中3个化合物具有显著的抗肿瘤活性。

1 仪器与试药

Varian VNS-400磁共振仪（Varian公司，美国），TMS为内标；Agilent 1200高效液相色谱仪（安捷伦科技公司，美国），连接DAD检测器；Agilent 1100制备型高效液相色谱仪（安捷伦科技公司，美国），YMC C18制备型色谱柱（250 mm × 20 mm，5 μm，YMC公司，日本）；聚酰胺树脂（60～90目，浙江台州市路桥四甲生化塑料厂，中国）；Sephadex LH-20（25～100 μm，Pharmacia Biotek公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher、Tedia公司，美国）；SRB（Sigma公司，美国）；人源结肠癌细胞HCT-116购自中国医学科学院药物研究所；Thermo热电FC酶标仪（热电公司，美国）。

药材采集于云南省西双版纳地区，经黑龙江中医药大学陈效忠副教授鉴定为刺齿凤尾蕨的全草。

2 方法与结果

2.1 化合物的分离和鉴定

95%乙醇提取刺齿凤尾蕨药材（10.0 kg）3次，每次1 h，得到浸膏（1.0 kg）。浸膏分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到相应的4个萃取部位。乙酸乙酯萃取物（200.0 g）过聚酰胺树脂柱色谱，分别用不同浓度乙醇洗脱，30%乙醇洗脱物（50.0 g）过sephadex LH-20柱色谱得到30个流份S1-S30。制备型HPLC（乙腈-水=30∶70，流速5.0 mL/min）对S10进行分离，得到化合物2（12.0 mg）和5（12.0 mg）。制备型HPLC（乙腈-水=40∶60，流速5.0 mL/min）对S11进行分离，得到化合物1（12.0 mg）和3（12.0 mg）。制备型TLC对S12（2.0 g）进行分离，得到化合物4（5.0 mg）。

化合物1白色不定型粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：3.52（1H，dd，J = 12.0、5.0 Hz，H-1），2.00（1H，m，H-2a），1.63（1H，m，H-2b），2.12（1H，m，H-3a），1.28（1H，m，H-3b），2.11（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5），1.96（1H，m，H-6），3.85（1H，d，J = 2.8 Hz，H-7），2.09（1H，m，H-9），3.00（1H，m，H-11a），1.48（1H，m，H-11b），2.00（1H，m，H-12a），1.63（1H，m，H-12b），3.06（1H，d，J = 2.5 Hz，H-13），2.28（1H，m，H-14a），1.48 （1H，m，H-14b），5.96（1H，s，H-17a），5.30（1H，s，H-17b），1.21（3H，s，H-18），1.11（3H，s，H-20）；13C NMR（CDCl3，100 MHz） δ：81.9（C-1），30.2（C-2），35.3（C-3），42.8（C-4），45.0（C-5），27.0（C-6），72.2（C-7），53.4（C-8），47.3（C-9），44.5（C-10），20.8（C-11），33.0（C-12），38.3（C-13），35.4（C-14），214.8（C-15），149.4（C-16），115.6（C-17），28.5（C-18），183.6（C-19），11.5（C-20）。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定化合物为geopyxin A，化学结构式见图1。

化合物2白色不定型粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：1.84（1H，m，H-1a），0.96（1H，m，H-1b），1.70（1H，m，H-2a），1.47（1H，m，H-2b），2.16（1H，m，H-3a），1.09（1H，td，J = 13.2、4.0 Hz，H-3b），2.05（1H，m，H-5），2.03（1H，m，H-6a），1.91（1H，m，H-6b），3.93（1H，m，H-7），1.84（1H，d，J = 8.0 Hz，H-9），1.86（1H，m，H-11a），1.48（1H，m，H-11b），1.92（1H，m，H-12a），1.70（1H，mz，H-12b），3.06（1H，s，H-13），2.30（1H，m，H-14a），1.48（1H，m，H-14b），6.00（1H，s，H-17a），5.31（1H，s，H-17b），1.25（3H，s，H-18），1.03（3H，s，H-20）；13C NMR（CDCl3，100 MHz） δ：39.8（C-1），18.5（C-2），37.5（C-3），43.3（C-4），46.5（C-5），27.4（C-6），72.4（C-7），53.1（C-8），46.3（C-9），40.1（C-10），18.9（C-11），32.7（C-12），38.1（C-13），34.7（C-14），214.3（C-15），149.2（C-16），116.0（C-17），28.7（C-18），184.1（C-19），15.8（C-20）。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定化合物为geopyxin C，化学结构式见图2。

化合物3白色不定型粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：1.98（1H，m，H-1a），0.95（1H，m，H-1b），1.64（1H，m，H-2a），1.55（1H，m，H-2b），1.46（1H，m，H-3a），1.29（1H，m，H-3b），1.22（1H，m，H-5），1.50（1H，m，H-6a），1.35（1H，m，H-6b），1.68（1H，m，H-7a），1.56（1H，m，H-7b），1.38（1H，m，H-9），5.08（1H，m，H-11），1.95（1H，m，H-12a），1.90（1H，m，H-12b），2.65（1H，s，H-13），2.00（1H，m，H-14a），1.18（1H，m，H-14b），2.50（1H，d，J = 16.8 Hz，H-15a），2.05（1H，m，H-15b），4.85（1H，s，H-17a），4.70（1H，s，H-17b），3.45（1H，d，J = 10.8 Hz，H-18a），3.12（1H，d，J = 10.8 Hz，H-18b），0.77（1H，s，H-19），1.03（1H，s，H-20），1.95（1H，s，11-OAc）；13C NMR（CDCl3，100 MHz） δ：39.5（C-1），17.8（C-2），35.2（C-3），37.7（C-4），49.4（C-5），19.9（C-6），40.7（C-7），43.0（C-8），62.0（C-9），38.0（C-10），69.3（C-11），39.8（C-12），42.5（C-13），39.5（C-14），48.0（C-15），155.5（C-16），103.2（C-17），72.0（C-18），17.7（C-19），18.0（C-20），170.3（11a-OAc），21.8（11b-OAc）。以上数据与文献[14]基本一致，故鉴定化合物为ent-11β-acetoxykaur-16-en-18-ol，化学结构式见图3。

化合物4白色不定型粉末。1H NMR（MeOH，400 MHz） δ：1.88（1H，m，H-1a），0.95（1H，m，H-1b），2.00（1H，m，H-2a），1.43（1H，m，H-2b），2.18（1H，m，H-3a），1.09（1H，m，H-3b），1.77（1H，m，H-5），2.11（1H，m，H-6a），1.99（1H，m，H-6b），3.64（1H，s，H-7），1.43（1H，d，J = 7.8 Hz，H-9），1.65（1H，m，H-11a），1.58（1H，m，H-11b），1.68（1H，m，H-12a），1.59（1H，m，H-12b），2.09（1H，m，H-13），1.85（1H，d，m，H-14a），1.71（1H，m，H-14b），1.75（1H，d，J = 14.0 Hz，H-15a），1.56（1H，d，J = 14.0 Hz，H-15b），3.71（1H，d，J = 12.0 Hz，H-17a），3.65（1H，d，J = 12.0 Hz，H-17b），1.19（1H，s，H-18），1.04（1H，s，H-20）；13C NMR（MeOH，100 MHz） δ：41.7（C-1），20.4（C-2），39.3（C-3），44.3（C-4），48.1（C-5），30.4（C-6），78.0（C-7），49.1（C-8），51.1（C-9），40.5（C-10），19.2（C-11），27.7（C-12），46.2（C-13），37.5（C-14），50.2（C-15），82.8（C-16），66.8（C-17），29.2（C-18），182.5（C-19），16.1（C-20）。以上稻萦胛南[15]基本一致，故鉴定化合物为7β，16α，17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid，化学结构式见图4。

化合物5白色不定型粉末。1H NMR（Pyridine-d5，400 MHz） δ：6.26（1H，d，J = 10.5 Hz，H-2），6.72（1H，d，J = 10.5 Hz，H-3），2.38（1H，m，H-5），4.82（1H，m，H-6），2.05（1H，m，H-9），2.23（1H，m，H-11a），1.65（1H，m，H-11b），2.20（1H，m，H-12a），1.35（1H，m，H-12b），2.87（1H，m，H-13），2.56（1H，d，J = 12.5 Hz，H-14a），2.48（1H，dd，J = 12.5、4.6 Hz，H-14b），6.05（1H，s，H-17a），5.38（1H，s，H-17b），1.57（1H，s，H-18），4.09（1H，d，J = 12.0 Hz，H-19a），3.75（1H，d，J = 12.0 Hz，H-19b），5.05（1H，d，J = 9.6 Hz，H-20a），4.62（1H，d，J = 9.6 Hz，H-20b）；13C NMR（Pyridine-d5，100 MHz） δ：197.9（C-1），130.2（C-2），157.6（C-3），42.1（C-4），58.9（C-5），73.6（C-6），96.8（C-7），60.3（C-8），49.3（C-9），47.1（C-10），20.3（C-11），30.2（C-12），34.8（C-13），25.8（C-14），209.1（C-15），153.8（C-16），118.2（C-17），25.8（C-18），65.8（C-19），66.2（C-20）。以上稻萦胛南[16]基本一致，故鉴定化合物为neolaxiflorin K，化学结构式见图5。

2.2 体外抗肿瘤活性测试

处于对数生长期的肿瘤细胞置于96孔板内培养24 h，设置5个不同浓度梯度（分别为1.0、5.0、25.0、75.0、125.0 μmol/L）的待测化合物，加到细胞培养液继续培养72 h，加入SRB试剂，按照SRB方法[17]测定化合物抑制肿瘤细胞的IC50值。

以人源结肠癌细胞（HCT-116）为模型对化合物进行体外活性筛选，结果显示化合物1～5的IC50值分别为1.20、2.45、50.2、58.9和3.26 μmol/L。

3 讨论

体外抗肿瘤活性筛选表明化合物1、2和5具有显著的抗肿瘤活性，而化合物3和4没有抗肿瘤活性。通过比较化合物的结构特征和活关系可知化合物1、2和5具有α，β不饱和酮基团从而表现出抗肿瘤活性，而化合物3和4不具备上述基团从而活性消失，该结论与此类化合物的构效关系总结一致[3]，下一步工作将继续研究本属植物，期待发现活性更强的贝壳杉烷二萜类化合物。

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（收稿日期：2016-12-20 本文编辑：李亚聪）