中药注射剂超分子“印迹模板”特征对其(类)致敏性影响的探讨

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[摘要]阐明中药注射剂超分子“印迹模板”特征的（类）致敏性机制，为构筑其安全性评价方法奠定基础。在前文超分子化学对中医药理论特殊影响的基础上，进一步运用超分子“印迹模板”理论分析中药注射剂产生（类）致敏性自然本源，结合鱼腥草注射剂的（类）致敏现象，阐述中药注射剂中超分子“印迹模板”结构特征对其（类）致敏性的影响。中药注射剂可自主产生超分子结构，呈现整体表观（类）致敏性，强度决定其结构特征，存在（类）致敏临界超分子结构。“注射”给药其结构难被破坏，易呈表观免疫原性；而“口服”给药，其结构将被胃肠道破坏，表观免疫原性弱或消失”，因此中药呈现“注射”与“口服”给药（类）致敏性的差异。中药注射剂“分子社会”间按“印迹模板”特征自主作用产生超分子，呈表观免疫应答，贯通识别、拷贝、贮存的免疫过程，单成分产生（类）致敏反应为其特例。中药注射剂（类）致敏原的筛查包括单成分及其形成的超分子，这是中药注射剂的安全性评价所特有的地方。

[关键词]中药注射剂；安全性；超分子药（毒）理学；超分子；印迹模板；分子社会

最早的中药注射剂是柴胡注射剂，诞生于20世纪40年代。中药注射剂正式收载于1963年版《中国药典》，2010年版《中国药典》收载7种注射剂品种。大部分以部颁标准的形式收载。目前具生产批文的中药注射剂共120种，主要品种有丹红注射剂、血栓通注射剂、参麦注射剂、双黄连注射剂、清开灵注射剂、鱼腥草注射剂等品种，市场销售额在1000亿元左右。这一批注射剂大多数是20世纪60年代开始研制，90年代前获批的一批中药注射剂。近年来由于中药现代化的力度加大，临床预警机制的不断完善，一批临床上长期应用的中药注射剂的不良反应事件频频曝光。最早有鱼腥草注射剂产生免疫毒性而撤市；再有刺五加注射剂出现质量污染问题；后又有双黄连注射剂致人死亡报道等等。中药注射剂安全性事件已成为广大人民群众使用中药防病治病的公共关心焦点问题，也是攸关中药行业兴衰，不得不解决的最基本问题。

1 中药注射剂毒性事件频发的原因及安全性评价问题

中药注射剂应用毒性事件频发的原因在于没有遵循传统的中药临床应用习惯，同时也欠缺现代毒理学的系统研究，特别是欠缺对中药注射剂特有超分子结构毒理学的研究。①受单成分研究模式影响，中药注射剂简单地看成为多个化学药物的堆集，导致与化学药物一样的毒性反应产生；②没有按中医的辨证施治用药，中药应用经常出现对病不对症，从而因方证不符而产生不良反应；③传统的给药途径改变，中药制成注射剂直接血管给药，中医药基本理论不能完全指导临床应用；④中药注射剂制备工艺不合理，质量不稳定；⑤没有完全建立起适用于中药注射剂的安全性评价理论与技术研究平台，欠缺安全性系统评价，防毒于未然。其中非常重要的地方之一就是缺乏对中药注射剂中超分子结构特征的认识，仍将其按单成分个体独立看待，当“口服”给药变为“注射”给药时，对“其超分子结构的改变所产生的免疫毒性”的规律就盲然无知。因此，仍然按传统方法评价中药注射剂用药的安全性必然导致其安全性问题层出不穷。

中药注射剂的毒性反应以（类）致敏性反应最为常见，包括急性、亚急性或慢性过敏反应，并以急性过敏反应居多，其中急性反应又分2个亚型，即Ⅰ型变态反应和类过敏反应。Ⅰ型变态反应由致敏原引起免疫应答反应；类过敏反应由药物与相似的生物活性介质引起非免疫反应，其发生机制与激活凝血或纤溶系统的激肽生成、补体系统的激活、花生四烯酸代谢和直接组胺释放等有关。

2 中药注射剂致敏的免疫学分子机制

中药所产生免疫毒性的Ⅰ型致敏反应机制研究透彻，按理中药注射剂中的小分子不产生免疫原性，但与体内的载体蛋白结合或聚合成大分子（超分子）直接作为抗原，在MHC-和Th及系列免疫因子的介导下引起机体的免疫应答，从而引起免疫毒性。本课题组前期实验证明鱼腥草注射剂具有免疫毒性，采用特异性的IgE介导的致敏原综合筛查技术初查出24种疑似成分（代谢产物）可能具有致敏原性，当与吐温生成超分子（胶束）后，其免疫毒性显著性地增加。其原理可通过聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）的免疫佐剂增效作用得到解释。

免疫佐剂能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身无抗原性的物质。免疫佐剂通过“仓库”效应、提高递呈抗原的树突状细胞免疫应答和有效的记忆性、诱导机体不同类别细胞因子的分泌来控制或改变机体对该抗原的免疫反应类型等作用形式来增强抗原的特异性免疫应答能力。免疫佐剂有传统、细胞因子、天然来源、新型等类型免疫佐剂。其中传统免疫佐剂的油乳、弗氏等佐剂中就使用了吐温-80作乳化剂；天然来源免疫佐剂包括多糖、黄酮、皂苷、蜂胶等佐剂；新型免疫佐剂包括脂质体、纳米等佐剂。这些佐剂就是利用乳剂、脂质体、纳米粒等制剂手段形成超分子（胶束），增大微粒半径和面积，再在胶束中加入化学决定簇较复杂的成分，从而诱增了免疫应答。由于中药注射剂中往往含有多糖、黄酮、皂苷、植物油、挥发油等成分，若以吐温80为增溶剂，那它就是一种天然免疫佐剂，当遇到特定致敏原时，这种免疫毒性被快速放大。据此来理解鱼腥草等中药注射剂能产生免疫毒性是正常之事了。

3 中药注射剂的类致敏反应分子机制

中药注射剂除了产生Ⅰ型超敏反应外，其中大部分免疫毒性反应为类致敏反应。类致敏反应自20世纪80年代在造影剂和麻醉剂的使用中发现以来，其发生频率不断提高，尤其随着中药注射剂的广泛使用而越来越受到重视，到目前其确切机制还尚未得到阐明，但研究者们趋向于认为它是AHR的一个亚类。与Ⅰ型超敏反应一样，均与MC或嗜碱性粒细胞脱颗粒释放组胺等生物活性介质有关。但与Ⅰ型超敏反应不一样是类致敏反应无需IgE介导，首次接触药物即可出现致敏症状。其发生有多条途径，药物可通过非免疫机制的物理或化学性地直接刺激MC或嗜碱性粒细胞释放生物活性介质，也可通过免疫机制的激活补体系统或其他通路引起该细胞释放生物活性介质。研究表明，类过敏反应的发生与超分子的微胶束对补体系统激活相关；与血浆的SC5b-9，血清中CH50，致敏毒素C3a，C3b，C4a，CAd，C5a，Bb，嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的标志物CD63，CD203c，细胞分泌产物组胺，特异性IgE，纤维蛋白酶，类胰蛋白酶，花生四烯酸类物质，细胞因子等相关。

引起类致敏反应的药物包括：①造影剂；②麻醉剂；③基本药物，如阿司匹林、吗啡、哌替啶、阿曲库铵、氯化琥珀胆碱、三甲硫吩和万古霉素等；④增溶剂，扩充血容量的胶体药物；⑤肽类，如多粘霉素B、缓激肽、P物质和致敏毒素等；⑥脂质体，如紫杉醇、聚乙二醇脂质阿霉素硫酸盐；⑦中药注射剂的注射用双黄连、清开灵、鱼腥草、刺五加、复方丹参、脉络宁、黄芪、参麦、生脉、正清风通宁、肝炎灵、醒脑静注射剂有类致敏反应，涉及到的成分有绿原酸、黄芩苷、鱼腥草素、新鱼腥草素及清开灵注射液中的水牛角提取物（为水解蛋白）；⑧附加剂有吐温-80，羟丙基-β-环糊精，聚乙二醇和聚乳酸按40：60开环聚合形成的聚合物胶束，在一定范围发生类致敏反应，呈浓度依赖性。由上述的类致敏机制和药物信息可得出：①阳性物质C48/80（N-甲基-对-甲氧基苯胺和甲醛的聚合产物，聚合度在3～6）不管口服还是注射给药均出现类致敏反应，与给药途径无关；而中药注射剂却不然；②剂量使用较大，临床上用的造影剂、麻醉剂使用剂量较大，易出现类过敏；③胶束易类致敏，辅料、制剂方法增大胶束，类致敏性增强，凡含有吐温80等助溶剂的注射剂，都会对犬产生类过敏；④混合易类致敏，药物、辅料与制剂方法合用类致敏效应得到加强。由此可以推断出：凡能加强致敏反应的因素均有可能产生并加强类过敏反应，易形成超分子结构（胶束）就有可能产生并增强类致敏反应。只是类致敏反应是“自己”决定簇识别了“类己”的决定簇，或攻击了机体“潜在”免疫应答的某一段或某一部分而引发了非预期致敏反应，但先期潜在了“类己”决定簇于体内。

4 鱼腥草注射剂产生免疫毒性的机制

鱼腥草含挥发油0.049%，油中主要成分为鱼腥草素，即癸酰乙醛（decanovlacetaldehvde），还包括癸醛（capricalde-hyde）、月桂醛（lauric aldehyde）及甲壬酮（methvl-n-nonvlke-tone）等61种成分。用水蒸气蒸馏法制得鱼腥草注射剂；由癸酰乙醛与亚硫酸氢钠可加成生成十二酰乙醛亚硫酸氢钠，可制成新鱼腥草素钠氯化钠注射液、新鱼腥草素钠注射液、注射用新鱼腥草素钠3种；与其他药物合用制得复方蒲公英注射液、鱼金注射液、炎毒清注射液等复方制剂注射液。该类产品曾广泛应用于临床，国内外市场销售额达80亿元，所涉及的种植、加工、医疗等相关行业价值近200亿元。由于出现免疫毒性而于2006年撤市，导致对行业的重大冲击。其临床（类）致敏的表现为：①大量食用并无致敏反应，而总挥发油类成分的注射剂却产生（类）致敏反应；⑦小剂量注射剂较少产生致敏反应，而大量滴注产生（类）致敏反应；③单独应用少产生（类）致敏反应，与其他抗生素、葡萄糖输液合用产生（类）致敏反应；④单成分新鱼腥草钠注射液也有（类）致敏反应；⑤女性致敏反应多于男性，并呈明显的个体差异；⑥（类）致敏反应较快，多数较严重，致敏性休克居多，但及时停药能快速缓解，没有后遗症；⑦（类）致敏反应与厂家、批号无明显的相关性，与此类产品所合成分直接相关；⑧已有体内外实验证明鱼腥草注射剂中的吐温为主要（类）致敏原，但改用其他辅料仍不能满意解决（类）致敏问题，本产品还没有完全恢复临床使用。

综合以上信息，结合免疫学及免疫佐剂增效原理、制剂原理与超分子化学，鱼腥草注射剂产生（类）致敏机制应是：鱼腥草的挥发油被吐温-80增溶后形成超分子结构（胶束），挥发油成分分散在其之内，镶嵌在其之中，吸附在其之外，增加了鱼腥草挥发油的表观相对分子质量和决定簇，增强了表观免疫原性而产生免疫毒性。这如同吐温-80在MF-59TM佐剂（以吐温-80为表面活性剂制成的乳剂）作用一样，免疫原性被增强。因此，鱼腥草注射剂的（类）致敏性，既与单成分的（类）致敏性相关，更与其形成的超分子结构特征攸关，其强度决定于超分子结构特征，包括大小、表面积及鱼腥草挥发油成分基团在表面分布情况等。这一现象可用超分子化学的“印迹模板”自主作用机制进行解释。

5 超分子化学为解释中药注射剂（类）致敏的特殊机制提供了理论基础

超分子化学根源于配位化学，有人称之为广义配位化学，是30多年来迅猛发展起来的一门交叉学科，它与材料科学、信息科学、生命科学等学科紧密相关，是当代最前沿的化学研究领域之一。“基于共价键存在着分子化学领域，基于分子组装体和分子间键而存在着超分子化学”是对分子与超分子化学的中肯诠释。自从1987年Pederson，Cram和Lehn因为对超分子化学领域的杰出贡献而获得该年度的诺贝尔化学奖以来，超分子化学便蜚声世界，受到了科学界和大众的广泛关注。

基于超分子化学，人体与中药可以看成是一个由单分子、超分子、聚合超分子及巨复超分子构成的复杂体系。其中免疫应答为人体重要的超分子化学“印迹模板”识别、拷贝、贮存与复制的过程“印迹模板”决定于“决定簇”化学特征。带有“决定簇”（印迹模板）特征的中药注射剂中致敏原，经免疫识别，拷贝致敏原的“印迹模板”（决定簇）而产生抗体，并贮存致敏原的“印迹模板”被再次识别，当遇到相同的“印迹模板”产生识别，亦致敏反应；但也可能是中药注射剂中的致敏原“印迹模板”误识了另外记忆的潜在类似的“印迹模板”（这一“印迹模板”拷贝到了免疫应答多个环节，其中抗体为最明显产物），或直接攻击“潜在”免疫应答各个环节一段或一部分而引起类致敏反应。因此，可以洞悉出：中药注射剂中的单成分与超分子结构，在产生致敏与类致敏反应过程中所呈现的超分子“印迹模板”结构特征是阐明其免疫毒性的关键共性问题之所在，两者贯通。

6 中药成分为天然的超分子库

中药及复方成分来源于原动植物生命体，必然是一个巨大的超分子体系。与中药注射剂相关的重要超分子类型如下。①糖类：可通过氢键缔合形成超分子，可通过高聚糖类的螺旋结构，可与小分子形成超分子，为良好的免疫佐剂。②苷类：可通过糖、糖的衍生物及苷元组合形成超分子。③醌类化合物：为缺π芳环类化合物，可与供电子基团，如酚、苯胺形成传荷络合物。④香豆素、木脂素、黄酮类：为电子供体，与缺电子物质形成超分子，为免疫佐剂。⑤萜类和挥发油：大多可作客体分子与大分子孔穴分子形成包合分子；也可自身聚合成树脂；也可形成超分子，还可形成低共熔物、氢健复合物与传荷络合物。⑥生物碱：在酸性条件下可与重金属，缺电子基团形成复合物；环肽类大分子可作为主体分子包合其他成分形成超分子，也可作客分子被包裹形成超分子。⑦甾体类：可作为客分子形成包合物；与β-甾醇类的分子形成复合物。⑧三萜类：可作为客分子、氢或电子供受体形式分子复合物；具有表面活性剂作用，可与其他物质形式胶束，皂苷为免疫佐剂。⑨鞣质：自身聚合生成鞣红形成超分子；可与生物碱复合生成超分子；还可与重金属盐如醋酸铅、醋酸铜等产生超分子沉淀。

因此，中药成分为天然的超分子物质库，而常见的中药多糖具免疫原性，黄酮、皂苷、植物油类又为天然免疫佐剂，因此当中药注射剂中存在的“决定簇”（印迹模板）被人体“己-己”与“己-类”的直接与间接识别（攻击）而产生（类）致敏反应就不难理解了。由于这种免疫反应与超分子结构特征有关，而超分子结构特征又受制剂工艺、给药途径的影响，其作用还要受到人体潜在“类己”的“印迹模板”拷贝状态影响，表现出更隐弊性、随机性，更难发现和研究，这正是制约中药注射剂安全性研究的困难之所在。故展开中药注射剂超分子结构特征对其（类）致敏性影响的研究正切中中药注射剂安全性研究要害。

7 中药注射剂中超分子结构特征及其（类）致敏反应的研究方法

对于单成分的（类）致敏反应研究方法成熟，致敏反应可采用特异性抗体IgE实验进行研究；类致敏反应可采用体外实验与体内实验测定，体外实验有肥大细胞脱颗粒实验与体外补体激活实验，肥大细胞脱颗粒实验可采用RBL-2H3细胞体外模拟类致敏过程进行测定，体外补体激活实验可采用血清药物孵育方法进行测定，体内实验可采用梁爱华等所建立的耳廓与背部蓝染法进行测定。对于多成分超分子的致敏反应可在单成分的基础上进行研究，首先应建立中药注射剂致敏原的综合筛查方法，确定致敏原群，再用免疫IgE抗体捕获法与超分子化学分析法相结合进行研究；也可以建立网络毒理学（当与指纹图谱关联构成网络谱毒效动力学）相关联的筛查方法，以免疫IgE为指标建立多成分代谢网络，采用前期AUC法求网络平衡常数方法关联成拓扑网络，并对其网络特征进行分析，找出与IRE为指标关联最为密切的成分群（网络平衡常数较大者）来确定成分群可能的超分子结构存在形式。在筛查过程中保持超分子结构的完整性至关重要。对于超分子类致敏反应，可采用体内外实验进行网络谱毒效学研究。采用前期AUC法求算致敏原与类致敏网络靶点的平衡常数，再关联成拓扑网络，并分析拓扑网络特征，再由平衡常数大小确定类致敏成分，再结合超分子化学分析方法确定超分子结构特征。

本文是在前期对中医药超分子化学的研究基础上，根据中药“口服”难而“注射”易产生免疫毒性的临床现象；结合中药注射剂（类）致敏性与超分子作用的关系，首次完整提出了药物表观免疫学概念：药物的免疫原性既与特定的单成分结构有关，也与其存在的形式攸关，各成分可以按“印迹模板”的特征自主形成超分子而呈现整体免疫原性。中药注射剂的（类）致敏原筛查包括单成分及其超分子结构。