荜茇中3种酰胺类生物碱在不同种属肝微粒体中代谢差异比较

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[摘要] 胡椒碱、荜茇明宁碱和墙草碱是荜茇中主要的酰胺类成分，具有多种药理活性，为了阐明这3种成分在5个不同种属肝微粒体中代谢差异，应用超高效液相色谱串联双压线性离子阱静电场轨道阱质谱（UHPLCLTQOrbitrap MS）采集这3种化合物的全扫描图谱及二级三级质谱图，获取碎片离子信息，结合其质谱裂解规律和代谢产物精确质谱数据，比较3种生物碱分别在人、恒河猴、比格犬、大鼠以及小鼠肝微粒体中的代谢差异，并快速鉴定出3个胡椒碱代谢产物、2个荜茇明宁碱代谢产物及1个墙草碱代谢产物。结果显示荜茇中酰胺类生物碱的主要代谢类型为苯环亚甲二氧基开环脱甲基和氧化反应，且在种属间存在代谢率差异，该研究为进一步阐明荜茇中胡椒碱类成分体内代谢途径提供了实验依据。

[关键词] 荜茇； 酰胺类生物碱； 肝微粒体； 超高效液相色谱双压线性离子阱静电场轨道阱质谱； 代谢产物

荜茇为胡椒科植物荜茇Piper longum L.的干燥近成熟或成熟果穗，收载于2015年版《中国药典》。荜茇中富含以胡椒碱为主的酰胺类生物碱，具有多种药理活性。胡椒碱（piperine）具有抗氧化、抗炎等作用[12]，荜茇明宁碱（piperlonguminine）具有神经保护及抑制SKNSH细胞amyloid β形成的作用[34]，墙草碱（pellitorine）具有血管保护等作用[5]。本课题组前期研究表明，荜茇总生物碱在多种诱导剂所致的帕金森病动物模型中具有一定的神经保护作用[68]，而胡椒碱、荜茇明宁碱和墙草碱是荜茇总生物碱中3种主要成分，其结构类型均为具有酰胺键的胡椒碱类似物，见图1，目前对其在体外不同种属肝微粒体孵育体系的代谢差异与代谢产物研究未见报道。本文首次报道了采用超高效液相色谱串联双压线性离子阱静电场轨道阱质谱（UHPLCLTQOrbitrap MS），根据ESI电离模式下的质谱裂解规律，比较胡椒碱、荜茇明宁碱和墙草碱在不同种属肝微粒体中的代谢差异及其代谢类型，并鉴定了代谢产物。为进一步阐明荜茇总生物碱中主要成分的体内代谢行为及其体内生物效应提供了实验依据。

1 材料

双压线性离子阱静电场轨道阱质谱仪（LTQ Orbitrap Velos pro，ESI电离源，美国Thermo Scientific公司）；Ultimate 3000 超高效液相色谱仪（美国Dionex公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo Scientific公司）；恒温摇床（天津市欧诺仪器仪表有限公司）。

胡椒碱、荜茇明宁碱和墙草碱均由本实验室分离得到，高效液相色谱法测其纯度均大于98%；βnicotinamide adenine dinucleotide 2′phosphate reduced tetrasodium salt hydrate （NADPH）购自Sigma （St. Louis， MO， USA）；0.1 mol・L-1 PBS缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；水为超纯水，乙腈为色谱级，其余试剂均为分析纯。

人、比格犬、SD大鼠、小鼠来源肝微粒体购自上海权阳贸易有限公司；恒河猴来源肝微粒体购自武汉普莱特生物医药技术有限公司。

2 方法

2.1 色谱条件 Thermo BDS Hypersil C18色谱柱 （2.1 mm×150 mm， 2.4 μm）；流动相0.1%甲酸水溶液（A）乙腈（B），梯度洗脱，0～5 min，10～20% B，5～15 min，20～60% B，15～20 min，60～95% B；柱温30 ℃；流速0.3 mL・min-1；进样体积2 μL。

2.2 质谱条件 采用ESI离子源，正离子扫描模式，扫描范围 m/z 50～800，离子喷雾电压为5.0 kV，碰撞能量30 eV，毛细管温度380 ℃， 鞘气流速40 arb， 辅助气流35 arb，二级质谱和三级质谱数据采集采用Datadependent scans（DDS）， 数据采集和处理采用Xcalibur软件。

2.3 肝微粒体孵育样品制备 孵育体系包括终浓度为1.0 g・L-1不同种属肝微粒体，5 mmol・L-1 MgCl2，2 mmol・L-1 NADPH和20 μmol・L-1药物（胡椒碱，荜茇明宁碱和墙草碱），0.1 mol・L -1PBS补足总体积至200 μL，反应体系有机溶剂比例不超过0.5%。肝微粒体和药物混合，涡旋1 min，37 ℃预孵育5 min，加入辅因子NADPH和MgCl2启动反应，涡旋2 min，37 ℃恒温孵育 2 h，加入200 μL冰乙腈终止反应体系，涡旋2 min，冰上放置10 min， 4 ℃下12 000 r・min-1离心 15 min，取上清液进样分析。阴性对照组不加入NADPH启动反应，加入等体积PBS缓冲液。

3 结果

3.1 胡椒碱、荜茇明宁碱和墙草碱的质谱裂解规律 正离子模式下，胡椒碱m/z 286.143 4[M+H]+，分子式为C17H20O3N，二级质谱扫描中，得到离子[M+H-C5H11N]+，[M+H-C6H11ON]+和[M+H-C9H13ON]+分别为m/z 201.054 7，173.059 7，135.044 1。三级质谱中，[M+H-C5H11N]+碎片离子裂解失去苯环上CH2O得到[M+H-C5H11N-CH2O]+为m/z 171.044 0，该碎片离子继续失去CO得到离子[M+H-C5H11N-CH2O-CO]+和[M+H-C5H11N-CH2O-CO-CO]+为m/z 143.049 1和m/z 115.054 1，其质谱裂解见图2。荜茇明宁碱m/z 274.143 5[M+H]+，分子式为C16H20O3N，其质谱裂解规律与胡椒碱一致，二级质谱扫描得到[M+H-C4H11N]+，[M+H-C5H9NO]+，[M+H-C4H11N-CO]+和 [M+H-C8H13NO]+，其精确相对分子质量分别为m/z 201.054 8，175.075 4，173.059 8，135.044 2。三级质谱中，[M+H-C4H11N]+碎片离子的裂解与胡椒碱m/z 201.054 7碎片离子裂解途径相同。墙草碱m/z 224.200 7[M+H]+，分子式为C14H26ON，该离子的二级碎片离子m/z 168.138 3，151.111 8，133.101 3，123.116 8，95.049 0分别为[M+H-C4H8]+，[M+H-C4H11N]+，[M+H-C4H13NO]+，[M+H-C5H11NO]+和[M+H-C8H19N]+。三级质谱中，[M+H-C4H8]+碎片离子裂解得到离子m/z 151.111 8， 123.116 8， 112.075 5， 81.069 6，碎片离子m/z 151.111 8裂解得到m/z 133.101 3， 109.067 4， 95.049 0， 91.057 8，墙草碱质谱裂解规律见图3。由以上裂解途径可知，胡椒碱很容易失去C5H11N，荜茇明宁碱和墙草碱很容易失去C4H11N，酰胺键的断裂是胡椒碱类似物的主要质谱裂解途径。此外，胡椒碱和荜茇明宁碱可产生相同的碎片离子[M+H-C8H13NO]+ （m/z 135.044 1）。

3.2 5种种属肝微粒体代谢产物鉴定 以胡椒碱、荜茇明宁碱和墙草碱为底物与5种种属肝微粒体孵育2 h，经UHPLCMS/MS分析，共鉴定出3个胡椒碱代谢产物（M11，M12，M13），2个荜茇明宁碱代谢产物（M21，M22）和1个墙草碱代谢产物（M31），结构见图1，高分辨质谱数据见表1，其主要反应类型为开环脱甲基和氧化反应。

4 讨论

荜茇中含有以胡椒碱为主的酰胺生物碱，本课题组前期研究了大鼠口服荜茇总生物碱后血清中胡椒碱和荜茇明宁碱的药代动力学以及大鼠组织内生物碱分布[1112]，结果表明，胡椒碱和荜茇明宁碱吸收迅速，生物利用度高，且主要分布在肝脏组织。本实验选取荜茇中3种主要的生物碱，研究其在不同种属肝微粒体中的代谢差异，分析3种化合物的结构特点，胡椒碱酰胺键远端为苯环骈合亚甲二氧基，近端为哌啶环，荜茇明宁碱与胡椒碱的不同之处为酰胺键近端为异丁基，墙草碱与荜茇明宁碱相比，酰胺键远端为直链烷烃。基于精确的高分辨质谱数据以及质谱裂解规律的特征性分析，本实验共鉴定出胡椒碱代谢产物3个，荜茇明宁碱代谢产物2个，墙草碱代谢产物1个。从化合物结构差异来分析，在肝微粒体孵育体系中，胡椒碱与荜茇明宁碱的苯环上亚甲二氧基发生开环脱甲基反应，这3种化合物不论是哌啶环还是异丁基均可发生氧化，且哌啶环可发生二羟基氧化。同时，这3种化合物在人、比格犬、大鼠、小鼠和恒河猴肝微粒体中的代谢产物一致，提示开环脱甲基和氧化是5种种属肝微粒体共有的I相代谢途径，但从各代谢产物代谢产率来分析，5个种属间对胡椒碱类似物的代谢存在一定差异。本实验表明，在设计和分析胡椒碱类化合物的药物代谢动力学研究中，应充分考虑这些化合物在种属间的代谢异同。

基于实验结果可以推测，荜茇中酰胺类生物碱在生物转化过程中亚甲二氧基易发生开环脱甲基反应，转化为2个羟基，增加药物溶解性，且哌啶环和异丁基易发生氧化反应，但其代谢酶CYP450酶亚型需要进一步研究确认，为下一步荜茇总生物碱体内代谢研究提供了实验依据。

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