共固定化亚硝化―反硝化细菌工艺及特性研究

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摘要：以亚硝化细菌、反硝化细菌为研究对象，采用共固定化细胞技术，以海藻酸钠共固定化亚硝化-反硝化细菌，研究了共固定化工艺条件及其在模拟污水中的脱氮效果。结果表明，共固定化亚硝化-反硝化细菌最佳工艺条件为4.5%海藻酸钠和2.1%氯化钙共固定化细胞，接种量为3个/mL培养基，接种于装有140 mL模拟污水液体培养液的250 mL三角瓶中，最佳pH为8，最佳培养温度30 ℃，110～140 r/min培养。54 h时氨氮去除率为95.95%，78 h时亚硝态氮去除率为95.82%。共固定化小球可重复使用3次、低温对共固定化后菌种脱氮性能的影响较小。

关键词：亚硝化细菌；反硝化细菌；共固定化细胞；脱氮

中图分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）01-0170-06

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.01.045

近年来，许多大型企业、工厂大量地排放未经过处理的工业污水，比如焦化废水、煤加压气化废水、氮肥废水等，导致含氮化合物的急剧增加，造成了严重的氮污染现象，产生农业、生活及自然水体的富营养化以及水体生态系统紊乱等一系列生态环境问题，如影响鱼类养殖以及一些水生生物的氧传递，造成其血液结合氧能力降低，致使鱼类及一些水生生物死亡。因此，氮污染问题的解决刻不容缓[1-3]。固定化细胞技术在废水处理领域中具有巨大的优越性和发展潜力。以往的工作主要着重于对单菌株固定化的研究[4，5]，但在长期的试验和实际应用中发现，许多物质的降解是单株微生物所不能完成或者只能微弱进行，因此必须借助于两种或两种以上的微生物在同一环境中的相互作用来实现。这样混合菌中的一些菌种能提供重要的降解酶，而其他菌种能提供表面活性剂或生长因子，在生理特性上可以相互补充[6，7]。共固定化细胞即是将不同细胞同时固定于同一载体内形成共固定化系统的一种技术，综合了混合发酵和固定化技术的优点。这种系统稳定，可将几种不同功能的细胞和细胞器在同一系统内进行协同作用[8-10]。理论上由于亚硝化细菌的产物可作为反硝化细菌的底物，亚硝化和反硝化两阶段可在同一反应器中完成[11]。本试验将亚硝化细菌和反硝化细菌进行共固定化，研究共固定化条件及温度、pH、使用次数、保存时间对共固定化后细菌的影响，为后续工业化利用共固定化亚硝化-反硝化细菌改善生态环境提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：亚硝化细菌、反硝化细菌均从中国矿业大学环境与测绘学院实验室活性污泥中富集分离获得，经鉴定分别为亚硝化单胞菌Nitrosomonas sp.和铜绿假单胞菌Pseudomonas sp.，两种菌均由徐州工程学院食品微生物实验室保存。

1.2 药品与仪器

所用试剂均为分析纯。电热恒温培养箱（HH.B11.600-S-II 型），上海跃进医疗器械厂；数显恒温水浴锅 （XMTD-204型），上海梅香仪器有限公司；可见分光光度计 （W14546型），上海欣茂仪器有限公司；洁净工作台（ SW-CJ-1F型），苏州安泰空气技术有限公司；恒温培养摇床 （HZ150L型），武汉瑞华仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基

1）亚硝化细菌富集培养基：0.4%（NH4）2SO4、0.1%K2HPO4、0.05%MgSO4、0.2%NaCl、0.04%FeSO4、0.5% CaCO3混匀溶解，pH 8.0～8.2。

2）反硝化细菌富集培养基：0.2%KNO3、0.02%MgSO4、0.1%K2HPO4、0.1%KH2PO4、0.5%柠檬酸钠，pH 7.2～7.6。

3）模拟污水液体培养基：0.065%NH4Cl、0.5%柠檬酸钠（后加）、0.02%K2HPO4、0.01%MgSO4、0.008% FeSO4、0.2%CaCO3混匀溶解，pH 7.5，NH3-N浓度为206 mg/L[12]。

1.3.2 海藻酸钠共固定化亚硝化-反硝化细菌 选取在富集培养基中长势较好的亚硝化细菌和反硝化细菌，离心后弃上清液，按照亚硝化细菌∶反硝化细菌=3∶1（m/m）的比例取菌体，与海藻酸钠溶液混匀，用5号注射器吸取混合液滴入到CaCl2溶液中，形成小球，4 ℃固定6 h。去离子水冲洗2～3遍后，按照接种量每毫升培养基放2～3个共固定化小球，加入到盛有40 mL模拟污水液体培养基的100 mL摇瓶中，30 ℃，110～140 r/min摇床培养。每6 h取0.2 mL培养液加格里斯试剂，若为深红色，加入柠檬酸钠至终浓度为0.5%，若红色消失说明亚硝酸盐被利用，可进行扩大培养。

1.3.3 共固定化亚硝化-反硝化细菌的液体扩大培养 将共固定化小球接入140 mL培养液的250 mL培养瓶中，接种量为每毫升培养基2个，pH 8.0， 30 ℃，110～140 r/min摇床培养，每6 h测定氮元素含量，当亚硝态氮含量较高时，加入柠檬酸钠至终浓度为0.5%。

1.3.4 不同因素对共固定化亚硝化-反硝化细菌的影响

1）不同CaCl2浓度下共固定化小球的形态。以4%海藻酸钠在不同CaCl2浓度（1.9%、2.1%、2.3%）下共固定化细菌。

2）不同海藻酸钠浓度下共固定化小球的形态。以2.1%CaCl2在不同海藻酸钠浓度（4.0%、4.5%、5.0%）下共固定化细菌。

3）CaCl2浓度对共固定化细菌脱氮性能的影响。在4%海藻酸钠浓度下分别以1.9%、2.1%、2.3%氯化钙共固定化细菌，250 mL摇瓶140 mL模拟污水液体培养基，30 ℃，110～140 r/min摇床培养，测定氮元素含量和亚硝酸盐的含量。

4）海藻酸钠浓度对共固定化细菌脱氮性能的影响。以4.0%、4.5%、5.0%海藻酸钠与2.1% CaCl2共固定化细菌，其余培养条件同上，测定氮元素含量和亚硝酸盐的含量。

5）pH对共固定化细菌生长的影响。最佳海藻酸钠和CaCl2浓度下，接种量为1个/mL培养基，250 mL培养瓶中加入140 mL模拟污水液体培养基，pH分别为6、7、8、9、10，25 ℃，110～140 r/min摇床液体培养，测定条件同“1.3.3”。

6）温度对共固定化细菌生长的影响。最佳海藻酸钠和CaCl2浓度下，接种量为1个/mL培养基，250 mL培养瓶中加入140 mL模拟污水液体培养基，pH 8.0，分别在15、20、25、30、35 ℃下，110～140 r/min摇床液体培养，测定条件同“1.3.3”。

7）接种量对共固定化细菌生长的影响。按照接种量依次为1、2、3、4个/mL培养液，加入盛有140 mL pH 7.5模拟污水液体培养基250 mL培养瓶中，在30 ℃，110～140 r/min的条件下摇床培养，测定条件同“1.3.3”。

8）低温保存对共固定化细菌生长的影响。将共固定化小球制备好后保存在4 ℃ 7 d，之后小球用去离子水冲洗2～3遍后，加入盛有140 mL pH 8.0模拟污水液体培养基的250 mL培养瓶中，30 ℃，110～140 r/min条件下摇床培养，测定条件同“1.3.3”。

9）最佳共固定化条件对细菌生长的影响。在最适海藻酸钠、CaCl2浓度、pH、温度、接种量条件下，110～140 r/min摇床培养，测定条件同“1.3.3”。

10）重复使用次数对共固定化细菌生长的影响。最佳工艺条件下，当亚硝态氮含量降低到较低值时将培养液倒掉，重新加入新的等量的模拟污水液体培养基培养。当共固定化细胞有2/3融化时，记录更换培养液的次数。

1.3.5 检测方法 采用α-萘胺分光光度法测定亚硝态氮，采用纳氏试剂分光光度法测定氨氮，采用酚二磺酸分光光度法测定硝态氮[13]。

1.4 数据分析

采用Origin Pro 8.1软件对数据进行作图和分析，所有数据用平均数±标准差（x±s）表示。

2 结果与分析

由于整个共固定化细胞反应阶段硝态氮含量都维持在1～4 mg/L，说明试验中硝化细菌数量较少，亚硝化细菌未被污染，并且少量的硝态氮不会对反硝化细菌产生影响。

2.1 不同CaCl2浓度下共固定化小球的形态

以4%海藻酸钠在不同CaCl2浓度下共固定化细菌，当CaCl2浓度低于1.9%时，共固定化小球透明，较软，有塌陷，多不能形成球形；当CaCl2浓度大于2.3%时，共固定化小球透明度增大，硬度较高。当CaCl2浓度为2.1%时，共固定化小球硬度适中，呈半透明，球形略带拖尾。因此，2.1%CaCl2时小球形态较好。

2.2 不同海藻酸钠浓度下共固定化小球的形态

以2.1% CaCl2在不同海藻酸钠浓度下共固定化细菌，当海藻酸钠浓度高于4.5%时，共固定化小球透明度降低，硬度较大，不能形成球形；当海藻酸钠浓度低于4.0%时，共固定化小球透明度增大，较软；当浓度为4.5%时，共固定化小球硬度适中，呈半透明，球形略带拖尾。因此，4.5%海藻酸钠时小球形态较好。

2.3 CaCl2浓度对共固定化细菌脱氮性能的影响

从图1可知，当CaCl2浓度为2.1%时，前期亚硝化反应时氨氮含量降解速度最快且亚硝态氮含量富集最高，60 h时氨氮含量已降至10.32 mg/L；后期反硝化反应时亚硝态氮去除情况也较好，84 h时亚硝态氮已降至23.64 mg/L，说明当CaCl2浓度为2.1%时共固定化亚硝化-反硝化细菌生长情况最好。

2.4 海藻酸钠浓度对共固定化细菌脱氮性能的影响

从图2可知，当海藻酸钠浓度为4.5%时，前期亚硝化反应时氨氮含量降解速度最快且亚硝态氮含量富集最高，48 h时氨氮含量已降至8.33 mg/L；后期反硝化反应时亚硝态氮去除速度最快，78 h时亚硝态氮已降至10.43 mg/L，说明当海藻酸钠浓度为4.5%时共固定化细菌生长最好。

2.5 pH对共固定化细菌脱氮性能的影响

采用4.5%海藻酸钠和2.1% CaCl2，不同pH条件下培养共固定化细菌，氨氮含量和亚硝酸盐氮含量测定结果见图3。从图3可知，当pH为8时，前期亚硝化反应时氨氮含量降解速度最快且亚硝态氮含量富集最高，60 h时氨氮含量已降至12.45 mg/L，54 h时亚硝态氮含量达到147.34 mg/L；后期反硝化反应时亚硝态氮去除速度最快，78 h时亚硝态氮已降至10.94 mg/L，说明当pH为8时共固定化亚硝化-反硝化细菌生长情况最好。

2.6 温度对共固定化细菌脱氮性能的影响

采用4.5%海藻酸钠和2.1% CaCl2共固定化细菌，不同温度下培养，测定氨氮含量和亚硝酸盐氮含量，结果见图4。从图4可知，当温度为30 ℃时，前期亚硝化反应时氨氮含量降解速度最快且亚硝态氮含量富集最高，54 h时氨氮含量已降至10.45 mg/L，48 h时亚硝态氮含量达到155.43 mg/L；后期反硝化反应时亚硝态氮去除速度最快，78 h时亚硝态氮已降至10.34 mg/L，说明当温度为30 ℃时共固定化细菌生长最好。

2.7 接种量对共固定化细菌脱氮性能的影响

在4.5%海藻酸钠和2.1% CaCl2条件下，按照不同接种量培养共固定化细菌，测定结果见图5。从图5可知，当接种量为3个/mL时，前期亚硝化反应时氨氮含量降解速度最快且亚硝态氮含量富集最高，54 h时氨氮含量已降至8.34 mg/L；后期反硝化反应时亚硝态氮去除速度最快，78 h时亚硝态氮已降至7.45 mg/L，说明当接种量为3个/mL时共固定化细菌生长最好。因此，最佳共固定化工艺及培养条件为4.5%海藻酸钠和2.1% CaCl2，接种量为3个/mL培养基，pH为8，30 ℃，110～140 r/min培养。

2.8 最佳共固定化条件和低温保存对共固定化细菌的影响

分别测定低温4 ℃保存7 d及最佳共固定化条件下的细菌的脱氮性能，结果见图6。由图6可以看出，低温保存对共固定化细菌活性影响较小，海藻酸钙外膜对细菌具有一定保护能力，可以用于工业化生产的低温保存。共固定化小球在最佳条件下培养，前期亚硝化反应54 h时氨氮含量已降至8.34 mg/L，氨氮去除率为95.95%，48 h时亚硝态氮含量达到178.23 mg/L；后期78 h时亚硝态氮已降至7.45 mg/L，去除率为95.82%，说明共固定化小球脱氮性能良好。

2.9 重复使用次数对共固定化细菌脱氮性能的影响

采用最适工艺共固定细菌，重复使用次数对共固定化细菌脱氮性能的影响见图7。从图7可知，随着重复使用次数增加，共固定化小球颜色变透明，黏度增加，活性降低。第三次更换培养基后，小球数量减少了3/4，剩余小球形态变差，已不具备继续培养的条件，因此重复使用次数为3次。

3 小结与讨论

3.1 海藻酸钠共固定化亚硝化-反硝化细菌的特点

本试验中，共固定化小球在最适海藻酸钠浓度和CaCl2浓度下，其形态都为圆球形，且略带非常小的丝状拖尾，说明此时海藻酸钙外膜黏度适中。碱性较酸性对共固定化细菌生长影响较大，当pH为10时，亚硝化、反硝化细菌生长均受到很大抑制，亚硝化细菌生长pH偏碱性，反硝化细菌偏中性，且亚硝化细菌在反应中pH会降低，因此前期偏碱性pH有利于两种菌的生长。亚硝化细菌和反硝化细菌最适生长温度范围相近，因此温度在25～30 ℃时，脱氮结果差异不大；④接种量较低时（1个/mL），菌种浓度较低，会影响脱氮性能，较高时（4个/mL），会阻碍底物、产物、氧气的正常输送，考虑到原料成本，接种量选择2～3个/mL最适宜。由于载体属性的原因造成共固定化小球在培养时直径会增大，颜色更透明，重复利用时这一现象更加明显，同时反硝化阶段会产生N2，不利于氧气的输送，影响共固定化细菌的重复使用。

3.2 共固定化亚硝化-反硝化细菌培养方式的改进

由于大量的钠离子和硫酸铵会溶解海藻酸钙外膜[14]，因此在模拟污水培养基中以氯化铵替代硫酸铵，但由于后期加入柠檬酸钠作为碳源，钠离子仍会对海藻酸钙外膜产生一定溶解效应，尤其在考察重复使用次数时，发现重复使用后共固定化小球破裂数量较多，今后可加入稳定性更好的其他载体，如聚乙烯醇进行固定。亚硝化细菌较反硝化细菌生长速度慢，因此亚硝化细菌接种比例较多，有利于缩短前期亚硝化反应时间，防止反硝化细菌由于缺少碳源而影响其生长。由于筛选出的反硝化细菌属于好氧型，因此在培养后期采用增加摇床转速使共固定化小球易于分散，有利于保证氧气的传递。亚硝化细菌和反硝化细菌的菌种比例、共固定化细胞的扩大培养对脱氮效果的影响还需进一步研究。

致谢：感谢徐州工程学院食品（生物）工程学院肖杰、朱雯雯两名同学对本试验作出的贡献。

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