液相色谱串联质谱仪测定液体乳中雌二醇含量

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇液相色谱串联质谱仪测定液体乳中雌二醇含量范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要 以液体乳为试验材料，建立了液相色谱串联质谱法测定液体乳中雌二醇含量。样品经QuEChERS净化后，利用液相色谱串联质谱仪在多反应监测模式下检测液体乳中雌二醇含量。结果表明：本方法在0.4～10.0 μg/L范围内线性良好，线性相关系数为0.997，检出限为1.0 μg/kg，本方法在5 μg/kg添加范围浓度内，用空白添加标准校正，其平均回收率为87.9%。该方法比国标方法前处理过程简便快捷、回收率高，适合实验室大批量检测液体乳中雌二醇含量。

关键词 液体乳；雌二醇；液相色谱串联质谱

中图分类号 O657.72；TS252.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）17-0256-02

Abstract The method using of HPLC-ESI-MS/MS for the analysis of estradiol in liquid dairy products has been developed. The liquid dairy samples were cleaned up by QuEChERS and then determined by HPLC-MS/MS.Separated analytes were determined using multiple reaction monitoring（MRM）.The method showed good linear correlation in the range of 0.4-10.0 μg/L for estradiol，the linear correlation coefficient is 0.997，the quantitation limit was 1.0 μg/kg. This method within the add scope concentration of 5 μg/kg，with a blank to add standard calibration，the average recoveries of estradiol were 87.9%.This method showed advantages in both accuracy and sensitivity，and is suitable for determination of estradiol in liquid dairy products.

Key words liquid dairy；estradiol；LC-MS/MS

随着生活水平逐渐提高，乳制品进入到人们日常生活中，但是随之而来的乳制品食品质量安全也越来越受到人们关注，特别是自从2010年婴儿奶粉“激素门”事件后，乳制品中激素问题受到民众和国家政府部门的高度关注。

雌激素和孕激素是动物体内天然产生的2类甾体激素，它们是调节机体生理机能的重要信使物质，但是人体内激素含量过高会导致儿童性早熟、致畸致癌等一系列问题。雌二醇有α和β 2种构型，其中β-雌二醇为生物学效应最强的内源性雌激素，能够促进动物生长，并使动物单性化，降低繁殖率，提高产量；但同时雌二醇可在动物组织内残留，通过食物链进入人体，对民众特别是对婴幼儿造成危害。我国虽已经禁止在动物中使用雌二醇，但仍有养殖户可能会非法使用，因此有必要建立乳制品中雌二醇含量检测[1-3]。

目前，雌二醇的检验方法有液相、液质等，前处理方法也有很多种，但是都存在方法步骤多、操作过程繁琐等问题；而目前被广泛使用的QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）方法有很多优势：回收率高、精确度和准确度高、分析速度快、溶剂使用量少、污染小、操作简便。本文在参考其他文献的基础上建立了液体乳雌二醇含量检测方法，该方法比国标方法前处理过程简便快捷、回收率高，适合实验室大批量检测液体乳中雌二醇含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱串联质谱仪（Waters TQS，美国Waters公司）；去离子水发生器（Milli-Q型，美国Millipore公司）；QuEChERS净化管（Waters公司，150 mg MgSO4，25 mg PSA，25 mg C18，2 mL）。

甲醇、甲酸（色谱纯，TEDIA，USA）；试验用水为Milli-Q去离子高纯水；有机微孔过滤膜（孔径0.22 μm）；氯化钠（分析纯，国药公司）；雌二醇标准品购于Dr.Ehrenstorfer公司，纯度大于98.5%。

标准储备液：精确称取雌二醇10 mg于10 mL容量瓶，用甲醇配制成标准储备液（1 mg/mL），-20 ℃冰箱保存。根据实际需要用流动相将标准储备液稀释成适合浓度的标准工作溶液，现配现用。

1.2 样品前处理

称取约2.0 g样品（精确至0.01 g）于10 mL具塞离心管中，加入2 mL乙腈涡旋1 min后，5 000 r/min离心3 min，将上清液转移至另一离心管中，加入2 g氯化钠，涡旋静置分层。取乙腈层放入QuEChERS净化管中涡旋1 min后10 000 r/min离心3 min，取乙腈层于50 ℃水浴中氮吹至近干，并用初始流动相定容1 mL，供LC-MS/MS测定。

1.3 色谱、质谱条件

1.3.1 色谱条件。色谱柱：Eclipse Plus C18 RRHD（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）或柱效相当的色谱柱；流动相：流动相A（水），流动相B（乙腈），梯度洗脱程序见表1；流速：0.4 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

1.3.2 质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；喷雾电压、去溶剂温度、气体流量、碰撞能等值应优化至最优灵敏度；定性离子对、定量离子对、碰撞电压和碰撞能量等参数见表2。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂及净化方式的选择

在查阅文献资料[4-13]的基础上分析出，乳制品中雌二醇的检测方法中提取溶剂多为甲醇、乙腈、乙腈中碱性溶液（例如添加氢氧化钠溶液）等，净化方式有直接提取浓缩进样、利用固相萃取柱或自填充柱净化后分析，目前利用QuEChERS净化法测定乳制品中雌二醇含量的报道较少。

在提取溶剂的选择上，比较了甲醇、乙腈净化效果，最终选择乙腈作为提取溶剂。乳制品基质比较复杂，主要由蛋白质（以酪蛋白为主）、脂肪（甘油三酯）、糖类（乳糖）以及一些无机盐、维生素和酶类（过氧化物酶、脂肪酶等）等组成的一种复杂体系。在前处理条件的选择上要尽可能除去蛋白质、脂肪等干扰，乙腈比甲醇有很好的蛋白沉淀作用而且脂类溶解度较小，因此最终选择乙腈作为提取溶剂。

在净化条件的选择上，目前多为固相萃取柱净化，但是该类方法操作步骤多，例如在GB/T21981―2008中需要石墨化炭黑和氨基柱串接使用，操作时间长，回收率低。本文最终选择了QuEChERS净化管（其填料和规格型号见1.1），可满足实验室快速检验要求，且添加回收率达到80%以上，操作过程方便快捷，适合实验室大批量检测液体乳中雌二醇含量。

2.2 液相质谱条件优化

液相条件的选择方面，比较了甲醇-水、甲醇-乙酸铵、乙腈-水和乙腈-乙酸铵等几种流动相，最终选择了乙腈和水作为流动相，在此条件下，雌二醇峰形尖锐且对称性较好。乙腈具有较好的清洗杂质效果，选择乙腈体系在防止蛋白质等杂质在色谱柱上累积比甲醇-水等体系较好，不会产生长期大批量进样后标准物质的响应值发生下降的现象（图1）。

质谱条件的优化方面，根据雌二醇结构特征比较容易失去一个质子形成带负电离子，因此选择负离子模式。根据仪器条件，配制合适浓度的雌二醇标准溶液，通过软件自动优化得到雌二醇子离子、传输电压及碰撞电压，比较了不同去溶剂温度（450、500、550、600 ℃）、不同去溶剂流速（600、700、800 L/min）及不同电离电压（1.0、2.0、3.0 kV），最终优化选择出本去溶剂温度、去溶剂气体流速及合适电离电压的最优条件分别为450 ℃、800 L/min及3.0 kV。

在质谱条件的优化过程中结合实际加标样品检测，最终选择了145.2和239.3作为监测子离子。进行加标回收试验检测过程中，若不选择净化方法直接进样，按照国家标准选择的183离子时干扰峰较大，干扰定量结果。用QuEChERS净化后选择145.2和183监测时离子比率与标准品比较明显偏离且峰形对称性差，若选择239.3作为监测子离子后，峰形对称，无背景干扰，与标准物质比较定量准确度达到101.3%，且添加浓度为5.0 μg/kg时平均回收率达到87.9%，完全满足试验要求。

2.3 方法的线性范围与检出限

按照已经优化好的实验条件，配制一系列合适浓度的雌二醇标准溶液供液质进行分析检测，以雌二醇定量离子的峰面积为y轴，分析浓度为x轴，软件自动计算出标准曲线（图2）。试验数据表明，在0.4～10.0 μg/L范围内，雌二醇定量离子的峰面积与相对应的浓度线性关系良好，线性相关系数均为0.999。雌二醇的线性方程为y=382.647x；相关系数为0.997。方法检出限（LOD）是以空白样品添加标准溶液，采用优化条件经过前处理后上机测定，以信噪比S/N=3时最低的出峰浓度为检出浓度，得出检出限为1.0 μg/kg。

2.4 方法的回收率与精密度

分别准确称取6组不同液体乳样品，添加5.0 μg/kg雌二醇标准品，按上述方法进行添加回收率试验，结果表明，实测浓度分别为4.51、4.40、4.62、4.34、4.06、4.45 μg/kg，平均回收率达87.9%，精密度达4.34%。

3 结论

本试验建立了利用QuEChERS净化法测定液体乳中雌二醇含量，具有操作简便，定性、定量准确，重复性好和灵敏度高的特点。方法检出限为1.0 μg/kg，该方法前处理过程简便快捷、回收率高，可满足实验室大量、快速分析的需求。

4 参考文献

[1] 王全林，张爱芝，陈立仁.超高效液相色谱-串联质谱法对奶制品中苯甲酸雌二醇残留的测定[J].分析测试学报，2019，28（9）：1069-1073.

[2] 邹龙，林洪，江洁.氘代同位素内标气相色谱-质谱法测定鱼贝类肌肉中β-雌二醇残留[J].分析化学，2007，35（7）：983-987.

[3] 尹江伟，刘红河，刘祖强，等.高效液相色谱-质谱联用测定肉类食品和饲料中雌二醇和雌三醇[J].现代预防医学，2010，37（10）：1928-1930.

[4] 刘勇军，吴银良，单吉浩，等.固相萃取气相色谱-质谱联用法测定牛奶中的雌二醇[J].畜牧与兽医，2006，38（7）：37-39.

[5] 杜赛，王若燕.液相色谱-串联质谱法检测牛奶中的雌二醇[J].中国卫生检验杂志，2014，24（11）：1550-1552.

[6] 肖付刚，郭卫芸，刘燕，等.奶粉中雌二醇的高效液相色谱法检测[J].食品研究与开发，2011，32（8）：81-83.

[7] 肖全伟，吴文林，杨万林，等.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中3种雌激素[J].色谱，2014，32（11）：1209-1213.

[8] 罗金凤，张迪，丁晓雯，等.辣椒中辣椒素类物质的检测方法及稳定性研究[J].食品工业科技，2012，33（11）：38-40.

[9] 王建华，丁宁，李杰，等.气相色谱-负化学电离质谱法检测牛尿中雌二醇的残留量[J].化学分析计量，2007，16（3）：17-19.

[10] 刘泳麟，田成新，闫天文，等.气相色谱-质谱法检测牛初乳中β-雌二醇的研究[J].中国乳品工业，2014，42（7）：53-55.

[11] 刘洪斌，姚喜梅，蔡英华，等.应用QuEChERS检测鸡蛋中16种磺胺类药物残留UPLC-MS/SM方法的建立[J].畜牧与兽医，2016，48（2）：7-12.

[12] 陈小军，王萌，范淑琴，等.QuEChERS前处理结合HPLC-MS/MS法分析氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的残留[J].中国农业科学，2012， 45（13）：2636-2647.

[13] 陈慧华，应永飞，杜旭奕，等.QuEChERS样品前处理-高效液相色谱法测定动物组织中那西肽残留量[J].中国兽药杂志，2014，48（2）：50-53.