表观遗传学的研究意义
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表观遗传学的研究意义范文第1篇
在Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后的50多年里，基因工程药物在治疗人类疾病中逐渐占据一席之地，人类基因组计划的完成为基因治疗开辟了更广阔的空间。近年来随着遗传学的新兴学科——表观遗传学在人类疾病治疗方面获得了越来越多的证据[1]。它从分子水平上揭示复杂的临床现象，为解开生命奥秘及征服疾病带来新希望。
表观遗传学是研究没有DNA序列变化的情况下，生物的表型发生了可遗传改变的一门学科[2]。表观遗传学即可遗传的基因组表观修饰，表观修饰包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、X染色体失活、基因组印记、非编码RNA调控等[3]，任何一方面的异常都可能导致疾病，包括癌症、染色体不稳定综合征和智力迟钝[4]等。表观遗传的改变是可逆的，这就为治疗人类疾病提供了乐观的前景。本文从表观遗传学与人类疾病、环境与表观遗传学的关系以及表观遗传治疗3个方面进行综述。
1 表观遗传学修饰与人类疾病
1.1 DNA甲基化相关疾病
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域，在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系，例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默，基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8]，都会导致细胞癌变。
1.2 组蛋白修饰相关疾病
组蛋白的修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等，组成各种组蛋白密码。其中，研究最多的是乙酰化、甲基化。一般来说，组蛋白乙酰化标志着其处于转录活性状态;反之，组蛋白低乙酰化或去乙酰化表明处于非转录活性的常染色质区域或异染色质区域。乙酰化修饰需要乙酰化转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)参与。组蛋白修饰酶异常可导致包括癌症在内的各种疾病，例如，H4K20的三甲基化是癌症中的一个普遍现象。甲基化CpG2结合蛋白2(MeCP2)可使组蛋白去乙酰化导致染色质浓缩而失活，其中Rett综合征就是MeCP2的突变所致。
1.3 染色质重塑相关疾病
染色质重塑是DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑复合物的共同作用。它通过影响核小体结构，为其他蛋白提供和DNA的结合位点[9]。其中染色质重塑因子复合物主要包括SWI/SNF复合物和ISW复合物。染色质重塑复合物如果发生突变，可导致染色质不能重塑，影响基因的正常表达，导致人类疾病。如果突变引起抑癌基因出现异常将导致癌症，例如：小儿科癌症中检测到SNF5的丢失。编码SWI/SNF复合物相关的ATP酶的基因ATRX、ERCC6、SMARCAL1的突变可导致B型Cockayne综合征、Schimke综合征甚至肿瘤。ATRX突变可引起DNA甲基化异常，从而导致数种遗传性的智力迟钝疾病如:X连锁α2地中海贫血综合征和SmithFinemanMyers综合征，这些疾病与核小体重新定位的异常引起的基因表达抑制有关[10]。
1.4 X染色体失活相关疾病
哺乳动物雌性个体不论有多少条X染色体，最终只能随机保留一条的活性。X染色体失活由X失活中心(Xic)调控，Xic调控X染色体失活特异性转录基因(Xist)的表达。X染色体的不对称失活可导致多种疾病，例如男性发病率较高的WiskottAldrich综合征是由于WASP基因突变所致。X染色体的PLP基因突变失活常导致PelizaeusMerzbacher病;X染色体的MeCP2基因突变失活导致Rett综合征[11]。在失活的X染色体中，有一部分基因因逃避失活而存在2个有活性的等位基因，使一些抑癌基因丧失功能，这是引发女性癌症的一个重要原因[12]。
1.5 基因组印记相关疾病
基因组印记是指二倍体细胞的一对等位基因(父本和母本)只有一个可以表达，另一个因表观遗传修饰而沉默。已知在人体中有80多种印记基因。印记丢失导致等位基因同时表达或有活性的等位基因突变，均可引起人类疾病。一些环境因素，如食物中的叶酸也会破坏印记。印记丢失不仅影响胚胎发育，并可诱发出生后的发育异常。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活可导致癌症的发生，如IGF2基因印记丢失导致的Wilms瘤[13]。15号染色体的表观遗传异常可导致PraderWilli综合征(PWS)和Angelman综合征(AS)，PWS是由于突变导致父本表达的基因簇沉默，印记基因(如SNURF/SNRPN)在大脑中高表达所致;AS是由于母本表达的UBE3A或ATP10C基因的缺失或受到抑制所致。Beckwithweideman综合征(BWS)是11号染色体表观遗传突变引起印迹控制区域甲基化的丢失，导致基因印记丢失引起[14]。
1.6 非编码RNA介导相关疾病
功能性非编码RNA分为长链非编码RNA和短链非编码RNA。长链RNA对染色质结构的改变起着重要的作用。短链RNA对外源的核酸序列有降解作用以保护自身的基因组。小干涉RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)都属于短链RNA，在人类细胞中小片段的siRNA也可以诱导基因沉默。miRNA能够促使与其序列同源的靶基因mRNA的降解或者抑制翻译，在发育的过程中起着关键性作用。转录的反义RNA可以导致基因的沉寂，引起多种疾病，如使地中海贫血病人的正常球蛋白基因发生甲基化。由于miRNA在肿瘤细胞中的表达显著下调，P53基因可通过调控miRNA34ac的表达治疗肿瘤。在细胞分裂时，短链RNA异常将导致细胞分裂异常，如果干细胞发生这种情况也可能导致癌症。
2 环境表观遗传学
对多基因复杂症状性疾病来说，单一的蛋白质编码基因研究远远不能解释疾病的发生机理，需要环境与外界因素的作用才会发病。疾病是外界因素与遗传因素共同作用的结果。流行病学研究已经证实，人类疾病与环境有明确的关系，高血压、中风、2型糖尿病、骨质疏松症等疾病的发病率与环境有着密切的关系[15]。特别是在发育初期，不利的环境、 营养的缺乏都有可能导致出生低体重、早产、胎儿发育不成熟等[16]。环境与DNA甲基化的关系一旦建立，将为环境射线暴露与癌症发生提供依据[17]。
环境污染等不利因素均有可能增加基因的不稳定性，每个人对环境和饮食的敏感性可因先天遗传不同而不同，环境因素与个体遗传共同作用，决定潜在表观遗传疾病的危险性。有人推测上述因素肯定会在我们基因组上遗留下微量的基因表遗传学痕迹[1]。随着年龄增长，DNA甲基化等化学修饰改变也在长时间中错误积累，这也有助于解释为什么很多疾病总是在人进入老年后才发生。由此可见，如果改变不良生活习惯、减少环境污染，都有可能降低表观遗传疾病的发病率。因此研究环境与表观遗传改变的关系对于预防和治疗人类疾病都有着重要的意义。
3 表观遗传学药物
人类许多疾病都可能具有表观遗传学的改变，表观遗传学治疗研究如火如荼。已经发现许多药物可以通过改变DNA甲基化模式或进行组蛋白的修饰等来治疗疾病。目前，很多药物处于研制阶段，尽管其有效性尚未得到充分证实，但给癌症、精神疾病以及其他复杂的疾病的治疗带来了希望。
3.1 组蛋白去乙酰化酶抑制剂
目前发现的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC Inhibitor)有近百种。其中FK228主要作用机制是抑制肿瘤细胞内组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性，引起乙酰化组蛋白的积聚，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡或分化等作用[18]。FK228单独用药或与其他药物或方法联合应用表现出良好的抗肿瘤作用，同时还可阻碍血管生成，具有抑制肿瘤转移、逆转耐药性、调节免疫力等作用。FK228还具有治疗炎症、免疫性疾病、视网膜新生血管疾病及神经系统等多种疾病的药理学作用。
3.2 DNA甲基转移酶抑制剂
核苷类DNA甲基转移酶抑制剂作用机理是在体内通过代谢形成三磷酸脱氧核苷，在DNA复制过程中代替胞嘧啶，与DNMTs具有很强的结合力。核苷类似物5氮杂胞苷(5azacytidine)是第一个发现的甲基化抑制剂，最初被认为是细胞毒性物质，随后发现它可抑制DNA甲基化和使沉默基因获得转录性，用于治疗高甲基化的骨髓增生异常综合征，低剂量治疗白血病。其他核苷类DNA甲基转移酶抑制剂有5氮2脱氧核苷(5aza2′deoxycytidine)，Zebularine(5azacytidine的衍生物)[19]，5Fluoro2′deoxycytidine，RG108，Procainamide，Psammaplins(4aminobenzoic acid衍生物)，MG98(寡聚核苷酸)等。DNA甲基化抑制剂Procainamide可用于抗心律失常。另外在茶叶和海藻中提取的EGCG也显示具有体外活性。临床中应用反义寡核苷酸对DNA甲基转移酶进行抑制正在进行实验。
3.3 联合治疗
DNA甲基化抑制剂与HDAC抑制剂联合应用治疗疾病可能具有协同作用。进行表观修饰治疗后的细胞可能对于化疗、干扰素、免疫治疗更具有敏感性。在癌症的治疗方面，应当包括遗传治疗和表观遗传治疗两个方面，同时运用两种或两种以上表观修饰的方法对病人进行治疗对人类疾病意义重大。
3.4 其他方法
人胚胎干细胞保留有正常基因印记，这些干细胞可能具有治疗意义[20]。另外，在女性细胞中非活性的X染色体中存在正常的野生型基因，如果选择正确的靶点，就有可能激活这个正常但是未被利用的野生型基因，从而对其进行基因治疗。有报道[21]运用RNAi技术沉默胰岛β细胞相关基因，抑制胰岛淀粉样形成可能用来治疗糖尿病。短链脂肪酸(SCFAs)丙戊酸钠用于抗癫痫，丁酸可用来治疗结肠癌[22]等。siRNA可在外来核酸的诱导下产生，通过RNA干扰(RNAi)清除外来核酸，对预防传染病有重要作用。目前，RNA干扰已大量应用于包括肿瘤在内的疾病研究，为一些重大疾病的治疗带来了新的希望。
4 结 语
从表观遗传学提出到现在，人们对表观遗传学与人类疾病的发生有了更深入的认识。人类表观基因组计划(human epigenome proiect，HEP)已经于2003年开始实施，其目的是要绘制出不同组织类型和疾病状态下的人类基因组甲基化可变位点(methylation variable position ，MVP)图谱。这项计划可以进一步加深研究者对于人类基因组的认识，为表观遗传学方法治疗人类复杂疾病提供蓝图[1]。但是，表观遗传学与人类生物学行为(临床表型)有密切关系，人类对表观遗传学在疾病中的角色研究还处于初级阶段。应更进一步研究表观遗传学机制、基因表达以及与环境变化的关系，有效减少表观遗传疾病的发生风险，努力探索这片造福人类的前沿领域。
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表观遗传学的研究意义范文第2篇
心肌缺血时,有氧代谢发生障碍,葡萄糖利用减少,脂肪酸利用增多,使氧利用率下降,心脏供能不足;同时,无氧代谢导致的酸性代谢产物增加,引起细胞内酸中毒。此外,心肌缺血还能引起氧自由基及钙离子超载,诱导心肌细胞凋亡,导致严重的临床症状。因此,改善能量代谢,清除自由基,减轻钙超载,抵抗细胞凋亡,实现心肌保护作用成为改善心肌缺血的重要途径[10]。研究表明,针灸在实现心肌保护方面具有自身的优势。一方面,针灸可通过改善能量代谢,实现心肌保护。心肌缺血时,能量代谢相关酶发生改变,电针能提高心肌组织糖原、琥珀酸脱氢酶和三磷酸腺苷酶的活性,纠正心肌相关酶的异常,增强能量代谢,改善心肌缺血。另一方面,针灸可减少自由基,缓解心肌缺血症状。热休克蛋白(HSP)属应激蛋白,能减少氧自由基释放,减轻心肌缺血损伤,从而保护机体[11]。研究证明电针“内关”穴可以增强缺血心肌细胞HSP90和HSP70mRNA表达,以减少氧自由基的释放,从而缓解家兔心肌缺血症状[12-13];而且,针刺“内关”穴能抑制细胞内Ca2+超载,实现心肌细胞保护,电针“内关”通过上调心肌钙泵和钠泵基因表达,增强钙泵和钠泵活性,降低心肌细胞内Ca2+含量,从而达到抑制钙超载,实现对心肌组织的保护作用,表现为促进心电活动、改善心肌组织形态和超微结构[14]。大量研究表明,针刺可以调控凋亡基因的表达水平,延长细胞周期,减少细胞凋亡,保护缺血心肌细胞。有研究指出电针可以调节诱导细胞凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2在家兔缺血心肌中的表达,即抑制凋亡基因Bax和促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,抑制心肌细胞凋亡,从而达到保护心肌细胞的作用[15]。c-fos基因是一种原癌基因,参与调节体内许多过程,如细胞周期、细胞分化、肿瘤转化及细胞凋亡等,正常情况下细胞内c-fos表达呈低水平状态,心肌缺血可激活c-fos基因的表达从而启动心肌细胞凋亡。研究表明,电针可降低c-fos基因表达,改善急性心肌缺血的过程[16-17]。所以不难看出,针灸能通过多种途径实现心肌细胞保护。总之,针灸干预心肌缺血的疗效和机制已初步得到证实和揭示,但尚未完全阐明,在一定程度影响了针灸治疗心肌缺血在临床的应用和推广。因此,需要引进新的理念、新的方法技术进行深入探索。
2表观遗传调控在针灸治疗心肌缺血的机制研究中的应用
目前主要涉及的表观遗传调控包括CG辅酶甲基化、组蛋白转录后修饰、RNA干扰等,具体可分为DNA甲基化、蛋白质共价修饰、染色质重塑、微小RNA调控4个方面[18-19]。越来越多的研究表明,表观遗传调控在心肌缺血过程中扮演重要角色,参与了疾病的发生、发展及预后的全部过程,因此,我们探讨从该角度开展针灸治疗心肌缺血机制研究的新方向。2.1表观遗传调控与心肌缺血的相关性以动物和人为载体的研究都表明,心肌缺血与表观遗传调控密切相关。表观遗传标记物在心肌缺血发生发展过程中的变化,反映出DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及微小RNA是调控心肌缺血的关键因素。大鼠神经甲基化系统在心肌缺血中受到抑制,可导致缺血部位的儿茶酚胺浓度升高,作用于心脏,使心率加快,收缩力增强,心输出量增加;怀孕期间的营养不良会改变DNA甲基化,增加成年后患心血管病的风险,且DNA甲基化在6个特殊位点对产前环境很敏感,可能提高妇女患心肌缺血的风险[20-22]。同时,有研究认为,组蛋白H3赖氨酸4甲基化(H3K4me)转移酶和它们的辅助因子是调控胚胎发育及细胞特异性的重要因素[23];而Smyd2作为一种组蛋白甲基转移酶,介导H3K4甲基化,改变心肌细胞组蛋白甲基化修饰和心肌细胞靶基因的转录调控,促进心肌细胞分化和发育[24-25]。最新研究报道组蛋白H3赖氨酸27去甲基化酶赖氨酸K特异性脱甲基6A(UTX)可以促进心肌细胞生长发育,UTX基因敲除小鼠因心脏发育障碍死于胚胎发育早期[26]。除甲基化之外,组蛋白的乙酰化在心肌缺血中的作用受到广泛关注。发生心肌缺血后,心肌细胞蛋白发生了去乙酰化,抑制去乙酰化则能减少其损伤,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂通过组蛋白去乙酰化酶Sirt1介导,后者含量增加,能有效促进心肌缺血耐受,诱导心肌保护[27-29]。HDAC-7抑制剂可与缺氧诱导因子(HIF)结合影响基因转录,增强HIF活性,从而促进心脏血管新生[30-31]。同时,HDAC抑制剂曲古柳菌素A可降低缺血心肌凋亡基因Caspase3表达,抑制心肌细胞凋亡,也可促进干细胞向心肌细胞分化,介导心肌细胞再生[32-33]。进一步研究发现,组蛋白H3赖氨酸9乙酰化(H3K9ace)与缺血心肌保护密切相关,通过调节血管再生因子、细胞凋亡因子和HSP基因表达达到抗缺血性损伤效果。其中VEGF、Sirt1与组蛋白赖氨酸乙酰化关系最为密切[34-39]。除组蛋白修饰之外,microRNA上调或下调通过作用于靶基因激活相应的分子信号通路参与心肌保护,调控心肌缺血损伤。染色体重塑也被证明与心肌细胞生长发育相关[40-41]。
总之,DNA甲基化、组蛋白修饰、微小RNA等表观遗传调控在心肌缺血过程中具有重要意义。2.2表观遗传调控与针灸防治心肌缺血机制研究从上述表观遗传调控与心肌缺血的相关研究成果可知,表观遗传调控介导细胞凋亡、心肌细胞保护和心脏血管再生,在心肌缺血发生发展过程中具有特殊地位,是目前医学研究的热点。从该角度切入进行针灸防治心肌缺血研究,必然是今后研究的一个新方向。同时,结合表观遗传调控自身特性,即强调除了DNA和RNA序列以外,还有许多调控基因信息,虽然本身不改变基因的序列,但其通过基因修饰、蛋白质与蛋白质、DNA和其它分子的相互作用,多层次、多途径影响和调节遗传基因的功能和特性,这些调节同时存在可逆性。这与针灸作用整体性、综合性、双向性、多靶点的特点具有一定的相似性。因此,将表观遗传学的理念和技术引入针灸抗心肌缺血机制研究,乃至整个针灸研究领域,都具有较强的可行性。结合针灸自身优势特点,以及其抗心肌缺血研究现状,融合上述表观遗传调控在心肌缺血发生发展过程的作用特点,我们认为,今后的研究可从两个方面进行,一是针灸对心肌缺血疾病的预防。治未病思想历来是中医理论的核心,早在《黄帝内经》中就强调“不治已病治未病”。现代研究证实,针刺具有提高机体机能的作用,如实施心肌缺血再灌注手术前针灸“内关”穴,能提高心肌细胞耐缺血能力,延长动物生存期,这无疑为心肌缺血患者赢得了宝贵的抢救时间[42]。而表观遗传调控与之密切相关,HDAC直接参与耐缺血,如果以此进行深入研究,一旦得以证实,将为临床进行再通手术前实施针灸干预的应用提供科学依据[43]。另一方面,则是在现有的研究基础上,继续深入探讨针灸抗心脏缺血机制研究。根据心肌缺血的不同阶段,有重点地开展相应研究。如急性期、亚急性期,主要围绕针灸促心肌细胞存活、抑制细胞凋亡,以及改善能量代谢,从而实现心肌细胞保护进行研究。针灸能有效调控心肌组织中Sirt1、HSP70、Caspase3、c-fos、Bcl-2等物质的表达,实现保护心肌目的,但其背后的调控机制如何,尚未得到证明。研究表明,HDAC能有效调控Caspase3表达,H3K9ace能影响HSP70水平等,从这些角度深入揭示针灸促心肌保护机制,将为针灸的更广泛应用提供基础。在慢性期,则主要围绕促进血管新生开展。已有的研究证实针灸能促缺血区域的血管新生,且与VEGF密切相关,但调控VEGF表达发生改变的机制并未得到证明。肿瘤存在大量的新生血管,研究中发现,H3K9ace在此过程中扮演重要角色,我们可以推测,在针灸促VEGF表达,介导血管新生过程中,H3K9ace可能具有重要意义。同时,也可以充分结合针灸抗心肌缺血机制研究成果,着重筛选出相应优势靶点,进行新药开发,或许可能成为新药开发的新靶点。除此之外,还可进行相应的拓展。研究表明,心脏中存在心肌干细胞,在某些影响因素干预下,能不断增殖、分化形成新的心肌干细胞。这个过程中表观遗传调控发挥重要作用[44]。针灸有促体内干细胞增殖、分化的能力,比如促脑内神经发生,实现脑保护[44-45]。那么针灸是否也能促进心脏干细胞增殖、分化,实现心肌保护?从表观遗传学的角度研究,也将成为我们关注的方向。
表观遗传学的研究意义范文第3篇
【关键词】同性恋；基因；表观遗传
【Abstract】The reasons of homosexuality are complex. With the development of science and technology， the reasons of homosexuality are increasingly clearly understood， which mainly involve in physiological factors and social psychological factors. This paper reviews the reasons of homosexuality， like genetic factor， biological factor， endocrine factor， Social psychological factors， as well as the recent research achievement of epigenetic factors.
【Key words】Homosexuality； Genetic； Epigenetic
【中图分类号】C913.14【文献标志码】A
自同性恋产生以来人们就没有停止对其成因的探究，随着科学技术的快速发展，生物医学和分子流行病学的不断进步，以及生理学和心理学的发展都对探究工作提供了更多的理论依据，人们对同性恋有了更清晰的认识。男男者已成为我国艾滋病流行的三大高危人群之一，同时也是性病的高危人群。其形成原因是十分复杂的，涉及生物、遗传、心理、社会文化等多重因素。本文就针对男性同性恋成因的研究进行综述。
同性恋又称同，是人际间性取向的一种。性取向指个体或群体的持续地指向何方。同性恋现象自古就有， 并一直存在， 在任何历史时期，任何文化背景下，不管社会主流支持还是反对，它都在人类社会中保持相当的比例。同性恋 （ homosexuality） 一词最早是由一名德国医生Benkert Kertbeny于1869年提出的。这个词的意思是指对异性不能做出性反应，却被同性别的人所吸引[1，2]。《生命伦理学百科全书》对同性恋的描述为：同性恋者是一个有着持久、显著、唯一的受同性性别吸引，对同性有性渴望和性反应，寻求同性并从中得到性满足的人。我国有学者将同性恋定义为：这种关系可存在于内在的心理上或外在的行为之中，如果某个人一生或一生中大部分时间都和同性别的人建立心理或者行为上的这种关系，就可称为同性恋者。男性同性恋或称男男者（men who have sex with men，MSM）指性取向为男性，且生理性别为男性者。
近年来，对于男男者的形成有先天说（生物因素）和后天说（环境因素）两种说法，前者称为素质性同性恋，后者称为境遇性同性恋[3]。但更普遍认为是由生物因素和环境因素共同决定的。其中生物因素的研究主要集中在与遗传学、神经生物学及性激素水平的相关范畴。环境因素主要在社会因素和心理因素两方面。最近，有学者还提出了同性恋的表观遗传学说，研究显示表观遗传学可能是导致同性恋的一个关键因素，从而扩大了同性恋成因的研究范围。
加州大学圣巴巴拉分校进化遗传学家William Rice[4，5]认为，同性恋会随后代遗传，这必然存在某种原因。研究估计有8%的人群是同性恋，且众所周知同性恋在家族中流行。如果一对双胞胎中有一人是同性恋者，另一个有20%的概率也是同性恋。
Mustanski等[6]利用10cm距离上的403个微卫星标记测定其基因型，分别计算母系的、父系的和联合遗传的最大可能连锁值，发现了连锁值最高的3个区域：7q36、8p12和母源的10q26。而另一项针对男同性恋全基因组扫描的分析也发现这3个区域与性取向的联系，并且发现了1个新的可能与MSM行为发生相关的14q32区[7]。
Camperio-Ciani等[8]比较了男性同性恋者和异性恋者的家系，结果显示同性恋者母系女性亲属的生育能力显著偏高，平均多生育33%的子女，父系女性亲属却没有，提示人类性取向相关的遗传因素有可能位于X染色体上，这些遗传因素未被逐步消除的原因在于携带该基因的女性生育能力较强。此外，男性同性恋的母系亲属中同性恋数目多于父系亲属，而且男性同性恋者多不是长子，有较多的哥哥或姐姐。其他几位学者的研究也报道多项家族性研究均证实男性同性恋具有遗传特征，且其相关影响因素可能位于X染色体上[9-11]。携带有同性恋基因的个体细胞，在适宜的条件下，易于发展成同性恋细胞。这就说明，同性恋的性取向有70% 是遗传基因所产生的结果[12]。Hamer等[13]对114个家庭中男性同性恋者的舅舅和表兄弟的性取向进行家系和连锁分析，并通过DNA连锁分析了兄弟均为同性恋的40个家庭的X染色体的基因多态性，发现Xq28区域可能有决定性取向的基因。
“男性基因”SRY（性别决定基因）的发现也从另外一个角度佐证了男性同性恋和变性者的生物医学基础。SRY基因在哺乳动物性别决定中起关键作用，它是决定因子（ TDF），启动分化， 是发育负调节的抑制因子[13]。表现为XY的男性核型却在性染色体中查不到SRY，或SRY发生了突变， 因此可能表现为女性化，即所谓“性反转”[14]。迄今为止还没有明确证据证实染色体上某一区域或基因与男性性取向相关，但似乎可以推测遗传基因在性取向的决定上具有重要的作用，这还有待于进一步的研究。
澳大利亚学者对112 名男性同性恋和258 名男性异性恋的基因进行了比对，发现554%的男性同性恋的雄激素受体基因较长，476%的男性异性恋雄激素受体基因较长。研究人员说，雄激素受体基因较长可能导致激素信号传输弱，而激素是决定早期发育过程中大脑性别认知雄性化的关键因素。该研究认为，激素水平较低可能导致男性在大脑发育期时雄性化的过程不完整，造成性别认知方面倾向于女性[15]。
瑞典研究人员发现，男性同性恋者和女性异性恋者的大脑结构上存在某些相似特点，他们对一些志愿者进行了对比试验，脑部核磁共振成像显示，女性同性恋者和男性异性恋者都拥有不对称的大脑，左侧脑半球比右侧脑半球略小；而男性同性恋者和女性异性恋者的左右脑半球是对称的。研究人员还应用相关检测设备对志愿者脑部杏仁核区域做了分析，结果显示，男性同性恋者和女性异性恋者的杏仁核结构存在着相似性，而男性异性恋者和女性同性恋者的杏仁核结构更为相似。
科学家从脑和内分泌的研究出发，认为下丘脑是大脑负责调节包括性活动在内的身体功能的器官，同性恋可能与下丘脑有关。发现同性恋男性的下丘脑前部神经元的密度只是异性恋男性的一半，而下丘脑前角是大脑中能影响的部分，提出同性恋男性下丘脑前核神经元解剖学的差异可能导致促性腺激素释放激素释放频率的改变，这可能会成为性倾向起因的生物学基础。另外，Levay等比较了同性恋男性和异性恋男性的4种下丘脑前部间质核（interstitial nuclei of the anterior hypothalamus，INAH）的数量，其中INAHl-3是决定人类性别二态性的主要区域，结果显示异性恋男性INAH-3的数量是男性同性恋者的两倍。人体解剖发现男性同性恋INAH-3的体积与男性异性恋相比较小，但女性中却未显示出这种差异，提示了INAH-3与男性性取向的关系[16]。但目前尚未找到造成同性恋者大脑具有独特性的原因，要深入了解与同性恋相关的神经生物学机制需要进行更大规模的研究。
一些研究者考虑到激素可能会导致同性恋。胎儿的大脑受何种性激素的影响，决定了个体细胞未来的性取向。如果男性胎儿未得到激素的影响，而是受到母亲卵巢的雌激素影响，男性胎儿大脑就会女性化；女性胎儿如果受到激素的影响，女性胎儿大脑就会雄性化[13]。有学者推测异性性取向的男性的雄激素暴露水平在一个很小的范围内，不足或超过此范围都可能增加男性成为同性恋的可能性 [17]。也有学者研究发现孕期暴露于乙醇与压力应激的联合作用引发导致雄性后代的性取向的改变[18]。
一直以来也没有任何的“同性恋基因”（gay genes）被确定。根据最新的一种假说，答案或许并不在于DNA本身，而是，随着胚胎发育，子宫中母亲和胎儿两者生成的激素水平发生波动，性相关基因对此做出了反应性开启和关闭。这样的调节机制可使未出生的胎儿受益，即便是在激素处于顶峰时，也可以维持稳定的雄性或雌性发育。然而如果到孩子出生或孩子拥有自己的表观遗传学标记时，这些所谓的表观遗传改变仍然存留，那些后代其中的一些人就可能变成同性恋。在Rice[4，5]的研究中，显示男性和女性胎儿对于它们周围的激素反应并不相同，甚至当一种激素暂时性增高时，这种差异并非是基因的结构，而是基因激活的程度，以及蛋白修饰的方式及程度，如DNA甲基化与剪切、多聚尾修饰等。如在睾酮对胎儿发挥作用的信号通路中，几个关键点的表观遗传改变有可能根据需要钝化或增进了激素的活性。研究中还提到，这些表观遗传学变化在父母处于早期发育时保护了他们，而早期对父母有利的表观遗传改变可解释同性恋在进化中遗留下来。Rice等[19]最近还建立并发表了针对同性恋发展的表观模型，该模型是基于胚胎干细胞的XX与XY核型的表观遗传标记。这些标记提高了XY胎儿中睾酮的灵敏度，降低了XX胎儿睾酮的灵敏度，从而性发展得以进行。该模型预测，这些表观遗传标记的子集进行了跨代遗传，建立了同性恋的表型。Ngun TC等[20]综合相关证据认为性取向是生物学的基础并且认为涉及表观遗传学机制，最近的研究表明，性倾向在同卵双胞胎中比在异卵双胞胎中更为一致，因此认为，男性的性倾向与基因组中的一些区域相关联，该研究惊喜的发现性取向与表观遗传机制有着重要的联系。值得一提的是，在一些先天性肾上腺增生的女性病例中，由于其子宫内高水平的睾酮激素以至于其后代中非异性恋的比例高于哪些非先天性肾上腺增生的女性。同时动物模型研究有力的证明，激素暴露的长期效应是由表观遗传机制介导的，该文章通过描述的假说框架得出结论，遗传和表观遗传共同解释了性取向的有关成因问题并愈发的接近事实，但有关性取向的研究还仍然面临很多挑战。
到目前还没有有力的证据能说明同性恋是由于生理因素导致的，而对于同性恋的形成机制的第二方面，主要包括社会因素和心理因素，其中比较有影响力的观点主要有精神分析学说和行为主义学说。
关于童年早期性心理发展，弗洛伊德认为个体在幼儿时都具有两性素质及双性恋特性，到底发展成同性恋还是异性恋是与个体在成长中的个人经历有关的。他认为在人的个体发展过程当中，4 至6 岁是儿童性别认同、性别角色发展的关键时期，在此期间儿童有着强烈的“恋父情结”或“恋母情结”，对异性的父母有着本能、强烈的依恋情感，而对同性别的父母则产生敌对情绪。父母如果在此期间对儿童的这种性本能不过分刺激也不过分抑制，儿童就会顺利通过这一时期而随后逐渐对同性父母认同。反之，如果在此期间儿童遭受心理创伤，就可能隐藏在潜意识里，并且在青春期时表现出来，可能发展为同性恋[21]。家庭环境对MSM的影响很大，1962 年，贝博提出的“家庭动力是同性恋主因”认为同性恋根源于早期家庭经验。他们大多数来自单亲家庭，从小缺乏父母一方的关爱；或是父母关系很差，经常争吵，长期分居两地；还有的是个体所处的家庭结构是由他/她和多个异性姐妹组成的，或者个体从小被父母当女儿养，从小和女孩子一起玩，产生了性倒错[21，22]，将会导致个体对其性别的自我认同产生影响， 并影响以后所形成的性取向。在家庭关系中，通常是母亲的形象和影响远远大过父亲，所以儿子在青春期后会寻找一个具有父亲身上没有的“男性力量”的人作为伴侣。
行为主义者认为，同性恋由环境影响形成。一个人在青少年时期如果在与异往中受挫或有过不快的经历，异性情感没得到正常的发展而与此同时又受到了同性方面的引诱，就可能产生同性恋倾向[23，24]，特别的，第一次性经历对个体性取向的影响很大，许多同性恋者第一次受人引诱或者在其他情况下发生同性，从而“欲罢不能”。有学者认为同性恋的形成是极度压抑的结果，如果一个人对性的需求无法通过正常的异性途径获得满足，便会压抑它，压抑的结果便是性需求更大，而为了消除性需求所带来的压抑，个体就会另寻出路去放松这种压抑，一旦个体以同性的方式缓解了压力，就有可能经过多次该行为的强化而形成同性恋。
学校是儿童接受教育的地方，同时也是孩子的主要活动场所，孩子的大部分时间都要在学校这个微缩型社会环境中度过，尤其是初中和高中正值学生性心理迅速发展成熟的时期，其间发生的任何事情如学校和老师对学生的性教育方式和力度、关切程度，以及同伴之间的相互影响等都会给孩子造成很大的影响。
李玉玲等[25]提出同性恋发生的原因在于性情绪的作用，男女同性恋的发生原因是相同的，同性恋与异性恋发生的原因也是相同的，都是由于性情绪的作用。当个体在中体验到喜欢、兴奋、冲动、渴望等积极情绪时，则将带来这些体验的人当恋对象。若此人为同性，则产生同性恋；反之则为异性恋。此外，恋母情结对同性恋者的情绪的产生也有重要作用，有研究表明，同性恋者的父母不鼓励男孩表现出男性特征，有统治欲的母亲不允许儿子对除她自己之外的异性产生兴趣[26]，因此产生变得胆小，甚至产生恐惧、偏执的心态，从而影响其未来性取向。
此外，从中医的阴阳角度来看，人体内阴阳互藏，阴阳转化。若男子，阳火不生，或阳刚之气受挫，众阴聚合，则易变主动为主静。阳中阴气愈聚，阴阳失调，则为男子中的女性。相对而言，男子中的女性，为阴，而男子为阳，阴阳的相吸作用，促使他们的自然吸引从而在一起，使得他们相互补足依靠，相互需要，从对方身上获得快乐，实现阴阳的互根交感作用[27]。
社会学的研究个案表明，同性恋个体之间在成因上是不完全相同的，单纯从一种理论出发分析他们的成因是不科学的。比如说素质性的同性恋即绝对同性恋和境遇性同性恋的成因有可能不同。境遇性同性恋更多地受环境的影响，如单性性环境的军队、监狱等，他们中有些人在改变了环境之后，又恢复到异性恋的状态。
综上所述，目前研究男性同性恋成因的领域主要包括社会学、心理学、医学、法学、哲学等多个不同的学科，男性同性恋成因十分复杂，主要涉及遗传因素、表观遗传学、神经生物因素、发育及内分泌因素、社会及心理因素等诸多方面，彼此之间的因果关系不明，尽管相关方面研究均取得了一定的进展，但尚待解决。探索男性同性恋形成原因的道路还很长，但是意义重大。
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表观遗传学的研究意义范文第4篇
【关键词】 分子诊断;肿瘤;个体化治疗
恶性肿瘤严重影响人们的健康和生命，其发病率呈增高趋势，中国目前每年新发病例270万，死亡约190万，每4～5个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因之首。
尽管以手术、化疗、放疗为主的综合治疗在肿瘤治疗上取得了一定进展，但肿瘤预后仍不理想，不同个体间存在着显著的治疗敏感性和不良反应的差异。由于遗传学特性存在差异，相同或有着类似病理组织学的肿瘤患者，使用相同的抗肿瘤药物会产生完全不同的治疗效果和毒副反应。遗传基因多态性是造成个体差异的决定因素。因此，必须对肿瘤患者采取个体化治疗才能提高疗效，减少不良反应。
1 个体化治疗的概念及意义
个体化治疗是指根据患者的个体差异采取合适的治疗方法，而不是按照病种来决定治疗方法。随着基因组学和遗传学的发展，基于个体基因多态性的“个体化医学”模式逐步被医生所接受，对患者的治疗正在进入个体化医疗的全新时代。以抗肿瘤药物为例，传统的用药模式主要依靠客观因素进行临床治疗。通常是一药通用或一剂通用。其结果是不同抗癌药物的总体有效率仅徘徊在25%～50%，抗癌药物不良反应率较高。肿瘤及绝大多数疾病并不是由某个单独的基因变异造成的，而是由很多遗传因素合力造成的。同一种癌症可能有着截然不同的表达基因，个体的遗传特征具有唯一性和独特性。不同的表达基因可导致编码基因产物的显著性差异。这些表达的差异对药物的吸收、代谢、分布和排泄都有影响，可导致同种肿瘤的不同个体之间对同种药物存在有效性、安全性、耐受性的差异。
肿瘤的个体化治疗，做到“因人而异、量体裁衣式”的方式，可以减少医疗资源的浪费，避免过度治疗，减轻患者的经济负担并且提高疗效，提高患者生存期，减少毒副作用[1]。
为了达到个体化治疗，分子诊断技术成为共同的关注点。分子诊断技术利用转录组学、蛋白质组学及高通量等技术，研究肿瘤基因突变，从个体基因组中分析和鉴别患者之间存在的疾病相关的个体差异，并利用这些差异来合理地指导临床治疗。肿瘤患者在接受抗肿瘤药物治疗前进行基因分子检测，根据检测结果选择合适的个体化治疗方案将成为标准治疗流程。
2 肿瘤分子检测方法和意义
2.1 肿瘤分子检测方法 肿瘤的分子诊断是以DNA、RNA或蛋白质分子为诊断材料，对肿瘤细胞的基因缺陷或表达异常作出特异性诊断方法。通过检测肿瘤患者体内遗传物质的结构、表达水平的变化、表观遗传学改变，再与抗肿瘤药物作用靶点、代谢相关基因改变来预测药物敏感性、有效性、副作用，有助于临床医师拟定最有利于患者的个体化治疗方案。
主要方法：染色体分析、基因缺失、移位或重排检测主要有染色体原位杂交、比较基因组杂交（CGH）、荧光原位杂交（FISH）技术。基因及蛋白检测技术主要有原位杂交、荧光原位杂交、原位聚合酶链反应、RNA印迹、反转录原位聚合酶链反应、免疫组织化学、蛋白印迹、流式细胞术、基因芯片、蛋白芯片等。甲基化检测主要有限制性酶切结合电泳分析方法、核酸酶切割等方法。分析点突变的检测技术主要有等位基因特异性寡核苷酸分析、等位基因特异扩增技术、单链构象多态性、杂合双链分析法、限制性内切酶片段长度多态性、变性梯度凝胶电泳法、突变体富集PCR、DNA测序、基因芯片等。微卫星不稳定性检测主要有PCR扩增凝胶电泳分析。端粒酶活性检测主要有端粒重复片段扩增、ELISA、接近闪烁分析法、原位杂交法。
2.2 血液样本在分子检测中的应用 肿瘤组织及血液标本为肿瘤分子检测常用的两种途径。肿瘤组织的检测比较常见，但一部分肿瘤患者发现时已属晚期或不适合采取手术等方法取得肿瘤组织标本，在这种情况下，患者外周血作为靶标检测的理想样本越来越受重视。研究发现，血液标本与肿瘤组织一样有效。Farzadnia等[2]检测发现乳腺癌患者血液中与肿瘤标本中HER-2的表达符合率达75%～90%，可以方便预测患者化疗的效果及预后，提示血液标本同样可以作为潜在的评价疗效的指标。随着研究的不断深入和检测技术的进步，血液样本由于其获取方便、符合率高、应用广，将有望成为晚期肿瘤患者分子检测的理想替代样本。
3 总结及展望
随着人们对肿瘤多态性的深入研究，肿瘤诊疗正向个体化的新时展。美国在2005年就开展了肿瘤基因检测计划，建立了样本资源中心和临床遗传信息处理中心。通过基因组分析技术，包括大规模的基因测序技术的应用，建立肿瘤病理学分子诊断标准。而我国直到2011年才启动了“肿瘤早期诊断、药物选择和疗效监测体外诊断试剂的研制”的专项课题，存在一定的差距。
在肿瘤个体化治疗检测中存在一些问题：肿瘤相关基因之间的关联以及在肿瘤发展中如何相互影响;脱离了体内微环境的影响而仅对肿瘤及血液标本检测是否有缺陷;如何筛选靶基因。分子检测技术需要进一步规范化、标准化。
虽然实现肿瘤患者个体化治疗的目标任重道远，但是相信随着肿瘤基因学、药物作用机制的深入研究，通过不断的总结和完善，必将实现真正的肿瘤个体化治疗。
参考文献
表观遗传学的研究意义范文第5篇
[关键词]桔梗；同源四倍体；DNA甲基化；MSAP
[Abstract]In order to investigate the epigenetic variations between diploid and autotetraploid of Platycodon grandiflorus.the diploid buds of P. grandiflorus were soaked in the mixture of different concentration colchicines and 0.002 g・mL-1 dimethyl sulphoxide （DMSO）.The identification of autotetraploid plants were based on morphological characteristics，chromosome number and flow cytometry. And then the level and pattern of DNA methylation explored by using the technology of methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP）.The result demonstrated that the buds soaked in 0.2% colchicines and 0.002 g・mL-1 DMSO solution for 12 h was ideal conditions to induce autotetraploid of P. grandiflorus，with induction rate of 32.0%.The diploid and tetraploid plants existed distinctly differences in morphological indexes.Totally，1 586 bands were amplified by 20 pairs of selective primers，of which 764 and 822 bands were detected in diploid and autotetraploid respectively.The total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio were 91.25%，61.25% and 30.65% in diploid of P. grandiflorus，respectively.However，the total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio of autotetraploid of P. grandiflorus were 86.13%，54.38% and 31.75%， respectively. Compared with diploid，the genomic DNA total methylate ratio and full methylation ratio of autotetration plants decreased by 6.02% and 7.14%.But the hemimethylated ratio of autotetraploid was higher than that of diploid，which more than 1.6%.All this results indicated that DNA methylation patterns have adjusted during the polyploidy process.
[Key words]Platycodon grandiflorus； autotetraploid； DNA methylation； MSAP
多倍体是指含有3套或3套以上完整染色体组的生物体[1]。由于多倍体将1个或多个整套染色体累加到基因组上，对生物体的基因组产生了一定冲击，这种“基因组冲击”使生物体的新陈代谢和基因调控等发生改变，从而使植株的形态器官、生理指标、遗传特性等产生变异[2-5]，这些变异会增强植株的生态适应性和环境的抗逆性，降低蒸腾作用，提高光合效率等，对植株的生物量和某些次生代谢产物含量及品质有促进作用[6]。因此多倍体植物具有更大的生存潜能和更强的选择优势。研究表明，多倍化不仅能导致植物的基因组结构改变、碱基序列消除、转座子激活等，还能影响表观遗传调控模式[7-8]。表观遗传变异是指不改变DNA碱基序的一种可遗传的基因表达变化，包括DNA甲基化修饰、组蛋白的各种修饰等[9]，其中DNA甲基化修饰是研究多倍体表观遗传变异的最佳途径之一[10]。DNA甲基化能在分子水平上对基因的表达进行调控，保护基因组结构的完整性，并控制冗余基因的表达，保持多倍体植物基因组的稳定性 [11-12]。多倍化能够诱导DNA甲基化的改变，而DNA甲基化又在基因组调控和基因表达上起到一个枢纽的作用，因而用甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）研究不同倍性植株基因组DNA甲基化的表达水平及模式变化，在一定程度上对解释多倍体植株出现的新的表型具有重要的意义。
目前多倍体方面的研究主要集中于异源多倍体的物种[13-16]，而对同源多倍体化后所产生的一系列变化方面的相关文章较少，这是因为异源多倍体化后较同源多倍体化后引起的变化更为明显[17-18]。但是，异源多倍体带来的杂交效应将混淆于倍性引起的后果[19]，因此，仅依赖于倍性调控变化方面的研究应通过同源多倍体来体现，揭示仅由基因组加倍而不涉及杂交等其他因素所造成的基因组冲击以及随后多个基因组趋于稳定的内在机制也需通过同源多倍体的研究来阐明。
桔梗为常用大宗药材，具有开宣肺气，祛痰排脓的功效[20]，在我国南北各地大面积栽培。但长期以来只种不选，导致品种退化，药材产量和品质下降[21]。本研究在采用生物技术离体诱导并鉴定获得桔梗同源四倍体的基础上，采用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术对二倍体和四倍体基因组DNA的甲基化变化情况进行分析，一方面为桔梗的品种选育提供材料，另一方面从表观遗传学的角度探讨桔梗四倍体表型变化的分子机制，为多倍体育种提供一定的理论依据。
1材料
挑选籽粒饱满的桔梗种子，经流水冲洗40 min后置于超净工作台，用75%乙醇消毒30 s后转入0.1%升汞（HgCl2）中灭菌6 min，无菌水清洗3～5次，接入MS培养基，25～30 d后获得桔梗无菌系。
2方法
2.1桔梗无菌快繁体系的建立和优化
以桔梗幼芽为材料，接种到增殖和生根培养基上，增殖培养基以MS为基本培养基，分别添加不同浓度6-BA（6-苄氨基嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）和2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）；生根培养基以1/2MS为基本培养基，并添加不同浓度NAA（α-萘乙酸）和IBA（吲哚丁酸）进行生根培养，试验设计见表1，2。每个处理15个幼芽，5瓶重复，培养30 d后分别统计增殖系数和生根率。
2.2桔梗同源四倍体的离体诱导及鉴定
2.2.1桔梗同源四倍体的离体诱导具体方法参照王红娟等[22]，并作适当调整。质量分数为0.05%，0.1%，0.2%的秋水仙素（加0.02 g・mL-1二甲亚砜）混合液经20 mL的注射器和0.22 μm的水系滤头抽滤灭菌后将桔梗不定芽浸泡在其中，置于震动摇床内处理12，24，36，48，60 h，然后用无菌水冲洗3次后接种到MS培养基中进行培养。以清水浸泡作为对照，共15个处理，每个处理15个幼芽，做5次重复。
2.2.2桔梗同源四倍体的鉴定采用形态鉴别、流式细胞仪分析和根尖染色体鉴定相结合的方法来确定倍性株系。先将形态变异明显的植株进行流式细胞仪分析，具体方法参照张俊娥等[23]，称取0.5 g组培苗叶片，用滤纸吸干水分后置于干净培养皿中，加入2 mL预冷的组织解离液（80 mmol・L-1KCl，20 mmol・L-1NaCl，15 mmol・L-1Tris-HCl，20 mmol・L-1Na2EDTA，0.1% TritonX-100，2.0% PVP-K30，pH 7.5），用刀片一次性快速切碎叶片，过滤后于4 ℃环境下2 000 r・min-1离心5 min，漂洗2～3次，加入2 mL DAPI染液室温下反应1 h后即可上样测定。流式细胞仪鉴定的株系进一步采用根尖压片法确定植株染色体数目。具体方法参照张振超等[24]，早上9：00～11：00点取幼苗根尖（0.5～1 cm），在0.002 mol・L-1的八羟基喹啉预处理2～3 h，于4 ℃冰箱中卡诺固定液（乙醇-冰醋酸 3∶1）处理24 h，在60 ℃的1 mol・L-1 HCL中解离8 min，卡宝品红染色10 min，然后制片、镜检。
2.3总DNA提取
称取0.5 g二倍体和四倍体桔梗试管苗幼叶，采用改良的CTAB法进行DNA提取，具体方法参照陈昆松等[25]，提取的DNA经紫外-可见分光光度计测定浓度和纯度后用并1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，总DNA 置于-20 ℃冰箱待用。
2.4MSAP分析及聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.4.1酶切、链接反应MSAP试验步骤参照Portis等[26]方法，用双切酶组合EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoR Ⅰ/ MspⅠ对基因组DNA进行酶切，在酶切片段的两端加上人工设计的与EcoRⅠ和Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ酶切位点互补的人工接头，然后用AFLP扩增体系进行扩增，接头和引物序列见表3。引物由北京博友顺生物科技有限公司合成。
2.4.2预扩增、选择性扩增和电脉预扩增反应体系为20 μL，其中含有10 mmol・L-1 dNTPs 0.4 μL，10×Buffer 2 μL，5 U・μL-1Taq酶0.2 μL，10 μmol・L-1 E00-primer 0.5 μL，10 μmol・L-1 M00-primer 0.5 μL，其余用水补齐。反应条件为：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，26个循环，72 ℃延伸10 min。预扩增产物稀释20倍，供选择扩增用。
选择扩增体系同预扩增体系，条件为：94 ℃ 30 s，65 ℃至56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13个循环，每个循环降0.7 ℃进行降式PCR 扩增；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23个循环，72 ℃延伸10 min。
选择性扩增完成后在扩增PCR产物中加入上样缓冲液，94 ℃变性10 min 后然后立即转移到冰上冷却防止复性，取5 μL变性产物于6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，银染后观察。
2.5条带统计与数据处理
由于甲基敏感扩增多态性技术中分别用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ双切酶对基因组DNA进行酶切。因此每个样品同时拥有2条泳道：第1条泳带采用EcoRⅠ/HpaⅡ进行酶切，记为H，第2条泳带采用EcoRⅠ/ MspⅠ进行酶切，记为M。同一位点有条带的记为“1”，无带的记为“0”。
3结果与分析
3.1增殖及生根培养基优化
将长1.5～2 cm的桔梗不定芽接到7种增殖培养基中，经30 d培养后均出现不定芽增殖的现象，具体结果见表4，在4号培养基中，分化的芽数最多，增殖系数平均达9.3±0.24，且出芽整齐，生长健壮，叶色浓绿。因此，桔梗无菌苗增殖的最适培养基为MS+6-BA 1.5 mg・L-1+ NAA 0.3 mg・L-1。
生根培养基优化结果见表5，不同浓度的NAA和IBA对桔梗试管苗生根率、根生长状况均有影响，随着NAA和IBA浓度的增大，生根率逐渐降低，且出根不整齐，根细短。当培养基蔗糖含量为28 g・L-1，NAA质量浓度为0.6 mg・L-1时，平均生根率高达82.6±3.8，且根粗壮，整齐。由此可见，桔梗的最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.6 mg・L-1。
3.2桔梗同源四倍体的诱导结果
将桔梗不定芽用抽滤灭菌的秋水仙素（加0.02 g・mL-1二甲亚砜）混合液浸泡处理后，成功得到了桔梗同源四倍体植株。诱导结果见表6，不同的质量浓度和处理时间对不定芽的诱导效果不同，低浓度和短时间处理下诱导率低，但成活率高，随着质量浓度和处理时间的增加，诱导率逐渐提高，但不定芽成活率降低。根据四倍体植株的诱导率和成活率，筛选出最佳处理浓度和时间，即用0.1%的秋水仙素溶液处理48 h或0.2%的秋水仙素溶液处理12 h为桔梗同源四倍体诱导的最佳条件。
3.3桔梗同源四倍体的鉴定
一般而言，四倍体植株具有巨型化特征，将形态变异明显的植株先经流式细胞仪分析后，再用根尖压片法鉴定，见图1。结果表明，桔梗二倍体植株根尖染色体数为2n=2x=18，DNA相对含量在100处有1个单峰；同源四倍体植株染色体数为2n=4x=36，DNA相对含量在200处有1个单峰，见图2。
3.4桔梗二倍体和同源四倍体基因组DNA甲基化水平差异
MSAP技术中同裂酶HpaⅡ和MspⅠ都能识别并切割CCGG序列，但二者识别甲基化的位点不同，HpaⅡ能切割无甲基化和单链甲基化位点而不能切割双链甲基化位点；MspⅠ能切割无甲基化和内甲基化位点而不能切割外甲基化位点，因此经HpaⅡ和MspⅠ切割后在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胶上能检测出4种条带类型，即：Ⅰ型，H，M都有带，说明CCGG位点无甲基化；Ⅱ型，H有带，M无带，说明CCGG位点发生单链外甲基化，即半甲基化；Ⅲ，H无带，M有带，说明CCGG位点发生双链内甲基化，即全甲基化；Ⅳ，H，M都无带，说明CCGG位点有双链内外侧甲基化、双链外甲基化或无CCGG序列[16]。桔梗二倍体和同源四倍体DNA经MSAP扩增的条带数及甲基化水平见表7，用20对引物组合共扩增后共有1 586条条带，其中二倍体764条，四倍体822条。二倍体总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分别为92.15%，61.52%，30.65%，而四倍体的为86.13%，54.38%，31.75%，与桔梗二倍体相比，其同源四倍体总甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，而半甲基化率升高1.6%，这说明染色体加倍后其DNA甲基化水平发生了变化。
3.5桔梗二倍体和同源四倍体基因组DNA甲基化类型
二倍体和同源四倍体桔梗基因组DNA甲基化类型见表8，二倍体和四倍体共有15种条带，见图3。其中A型为单态性位点，包括3个亚类，表示二倍体与四倍体甲基化状态相同；B型为去甲基化位点，包括5个亚类，说明在该位点二倍体存在甲基化，而四倍体发生了去甲基化；C型为过或超甲基化类型，也有5个亚类，即与二倍体相比，四倍体甲基化升高；D型为次甲基类型，有2个亚类，表示相比于二倍体来说，四倍体甲基化降低，但仍有甲基化现象[17]。与二倍体相比，桔梗试管苗染色体加倍后，其基因组DNA有23.54%发生了去甲基化现象，29.07%发生了过或超甲基化现象，2.97%发生了次甲基化现象，只有44.42%的基因组DNA未发生任何改变。
4讨论与结论
4.1桔梗同源四倍体的离体诱导及鉴定
本研究中采0.2%抽滤灭菌的秋水仙素溶液浸P11～P20.其中的10对引物，每对引物下有4条泳道，从左往右依次为2H，2M，4H，4M；2H和4H分别表示二倍体和四倍体桔梗EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ酶切的扩增结果；2M和4M表示二倍体和四倍体桔梗EcoR Ⅰ/Msp Ⅱ酶切的扩增结果。
泡桔梗顶芽12 h，获得了诱导率为32.0%的四倍体植株。高山林等[27]采用培养基中添加40 mg・L-1秋水仙素的方法诱导桔梗四倍体，诱导率达到37.5%；王小华等[28]采用0.1%秋水仙素处理桔梗嫩茎40 h，诱导率达到50%。前人诱导率较高的原因可能是在鉴定过程中仅用形态学和细胞学的方法鉴定倍性，并没有排除嵌合体的干扰，从而将嵌合率也计算到诱导率中，出现诱导率较高的现象，本研究采用了形态鉴别、流式细胞仪分析和根尖染色体鉴定相结合的方法进行倍性鉴定，排除了嵌合体的干扰，提高了结果的可靠性，为进一步研究桔梗同源四倍体的遗传稳定性和农艺性状评价提供可靠的材料。
4.2桔梗二倍体与四倍体基因组DNA甲基化水平差异及模式变化
多倍体植物具有器官巨大、活性成分含量高、抗逆性强等优点，这可能是多倍化后植物体内基因组结构和表观遗传修饰发生了广泛变化[3]，进而导致植物出现新的性状。但在对拟南芥[5]、水稻[29]、白菜[18]的同源多倍体及二倍体的比较研究中发现这些植物同源多倍化后基因组结构并没有发生明显改变，且多倍化后多倍体的基因表达谱也与二倍体十分相似。表明同源多倍化后基因组并没有同异源多倍化一样发生大规模的基因组结构调整事件。本研究中，从图1可以明显看出桔梗同源四倍体比二倍体植株粗大，叶片增厚增大，叶柄叶脉粗大等现象，同源多倍体桔梗新出现的区别于亲本的性状则可能与表观遗传调控密切相关。
甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，在基因表达中起着重要的调节作用，同源多倍化过程中，DNA甲基化会参与多倍体的适应性调整，并发生特异性的变化以调控基因表达和转座子的活性等，所以不同倍性材料中DNA甲基化水平会发生一定程度的改变[29]。杨岚等[30]采用MSAP技术对甜叶菊同源四倍体与二倍体的表观遗传进行研究后发现四倍体基因组DNA的总甲基化率和全甲基化率略有所降低，甲基化模式主要以过和超甲基化为主；长春花[31]多倍化后基因组CCGG位点的 DNA的总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率较二倍体植株均有所提高，甲基化类型以C型即过或超甲基化类型最多。本研究中，桔梗同源四倍化后基因组DNA的总甲基化率和全甲基化率有所降低，其中总甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，且甲基化模式主要以过或超甲基化类型（C型）为主，占29.07%，其次是去甲基化（B型），占23.54%，最少的是次甲基化（D型），占2.97%。由此可推测同源四倍体出现新的表型与DNA甲基化模式的重新调整尤其是大量过或超甲基化变异有关，过或超甲基化就可能导致相应位点所在基因表达的关闭或抑制，进而维持四倍体植株这自身基因组的稳定性。有关染色体加倍后DNA甲基化模式调整的程度对多倍体性状和表型改变的机制还有待进一步的研究。
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表观遗传学的研究意义范文第6篇
关键词：生物信息学 教学模式 创新
中图分类号：G420 文献标识码：A 文章编号：1009-5349（2017）08-0009-02
近些年，随着人类基因组测序完成，有关核酸、蛋白质等的分子生物学数据迅速增长。同时，计算机技术的发展也为生物数据的处理提供了有力支持[1]，促进了生物信息学的产生及发展。许多高校相继开设了生物信息学课程。生物信息学课程对培养创新型人才具有重要意义。[2]生物信息学是多领域融合的学科，对理论知识及实践的要求较高，因此如何提高生物信息学的教学质量及完善教学模式尤为重要。本文根据生物信息学的特点及目前发展现状，提出“教学-科研-创业”一体化的教学模式。并在实施过程中不断优化，为完善生物信息学的教学模式提供依据。
一、生物信息学课程的概述
生物信息学作为近些年新发展的学科。具有以下特征：第一，多学科融合。它将数学、计算机科学与生物学有机地结合在一起。[3]第二，数据的复杂性。目前国际上著名的数据库有GenBank、DDBJ和PIR等。[4]这些资源具有开放性，大部分数据库可免费下载。第三，学科知识的前沿性，生物信息学的发展和更新较其他学科更为迅速。[5]教师在教学过程中要不断地吸取新的知识以补充教材中的不足。[6]生物信息学的价值不仅体现在科学研究领域，同时对经济的发展也有影响。[6]所以，各高校设置生物信息学课程是必要的。
二、生物信息学教学现状
无论国外或国内对生物信息学的发展都是高度重视的。笔者在针对生物信息学本科教学过程进行调查中发现，生物信息学教学过程存在以下不足：
（一）专业型人才稀少
生物信息学所涉及的领域较广，它将数学、计算机科学和生物学相结合。[7]这一特点，要求从事生物信息学教学的教师自身知识背景要深厚，同时兼备生物学及信息技术的专业知识。由于各专业之间的交叉联系较少，导致相关生物信息学的专业人才稀少。这对于生物信息学教学是不利的。
（二）教学理念陈旧
生物信息学是将信息技术和生物课程有机结合。目前，在国内，生物信息学教学思想还比较落后，大部分还处于对构建完善的教学模式初步探索阶段。[8]由于不能将信息技术的优势极大地发挥，以至于生物信息学教学过程中存在一定的弊端。在教学设计中还沿用传统的教授法，使得学生对于学习生物信息学的兴趣减少，同时，忽略信息技术的应用对于培养和拓展学生思维方式的作用。
（三）实践教学存在不足
实践教学是生物信息学教学过程中必要的部分。生物信息学实践环节方面较为薄弱。一方面，课时安排不合理。大部分时间分配于理论课，而实践课的时间相对较少。另一方面，在硬件设施上，也不能满足实际需求。在很多高校中并没有独立的计算机机房以保障学生能够进行具体的操作。并且，在国内，虽然生物信息学的研究发展迅速，但所涉及的资源并不能共享，交流较少。
（三）“教-学-研”模式的构建
针对生物信息学课程自身特点及在教学过程中发现的问题，提出“教学-科研-创业”一体化教学模式。
1.教学理念的改革
从上述的分析中，针对教学理念落后问题，需要从生物信息学的教学要求与特点出发，改变常规的教学模式，采用“自主式、探究式”学习的思想，通过小组合作的学习方式，让学生主动学习。[9]根据生物信息学的课程内容可将其分为几个模块。例如：数据库介绍及应用、常用统计学方法、基因组学、蛋白质组学等。学生以小组为单位，对每一个模块进行探讨研究。学生可以通过上网查找资料，与老师进行交流及在课堂上展示成果并且小组间进行探讨等方式对该模块所涉及的相关知识进行学习。这样使得学生能够按照自己的要求扩展和交流生物信息学知识，丰富生物信息学的学习途径，并且师生之间建立平等和谐的关系。
2.理论联系实践，锻炼学生科研能力
教学是科研的前提条件，科研使教学内容多样化。[10]因此，在教学过程中，根据课程的特色，可将教学与科研彼此联系起来。首先，组建跨学科的教师团队。生物信息学是多学科交叉的课程，该领域的专业型人才稀少。解决这一问题是保障学生在科研过程中随时了解相关知识的关键。我们可以在教学过程中组建跨学科的教学团队。教师间可彼此沟通交流，针对学生们在科研过程中遇到的问题，能够提供专业性的建议，为科研提供强有力的理论基础。其次，教师积极鼓励学生参加科研项目。教师可根据教学内容与当下生物信息学领域中的研究热点方向，提出研究问题，使学生积极参加其中。在科研过程中，培养学生独立思考及动手操作能力，同时，增强团队合作意识。对生物信息学有进一步了解。最后，为了创造一个良好的科研条件，学校应提供一些硬件设施。例如：多媒体网络教室、与生物信息学相关的软件等。将教学与科研联系在一起，可有效地提高生物信息学教学质量。
3.教学与创业相结合，培养学生创新精神及创业能力
创业教育是一种实践，以学生为主体，将“教、学、做”三者合一。[11]所以在“教学-科研-创业”一体化教学模式中，创业与教学、科研相互联系，科研成果具体化，提高学生的创新创业能力。以吉林师范大学为例。教师在授n过程中，与学生一起对表观遗传学药物进行分析，并以此为研究课题，参加“第二届吉林省‘互联网+’大学生创新创业大赛”。项目中拟建一家有限责任公司，它将通过差异化的运营模式，以互联网为媒介，运用现代生物科技和计算机技术实现对表观遗传学药物信息的整合及数据的分析，并对药物靶点进行更深层次的挖掘。为特定的顾客提供个性化的服务，并以此获取利润。实例表明，在项目进行过程中，培养了学生科学严谨的思维方式及团结协作的精神。创业与教学、科研的有效结合，极大地调动了学生学习的积极性，并充分发挥了理论知识与实践结合的优势。
四、结语
总之，生物信息学教学应适当地将理论与实践结合。通过“教-研-创”一体化教学模式的尝试，不仅激发了学生学习的积极性，同时锻炼学生发现问题并且能够及时解决问题的能力。因此，该模式在生物信息W教学过程中具有一定的可操作性。随着生物信息学的发展，该模式将进一步完善，以期培养出综合型、创新型人才。
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表观遗传学的研究意义范文第7篇
【关键词】 杀伤细胞抑制性受体 基因表达调控 DNA甲基 组蛋白乙酰化
HLA半相合异基因造血干细胞移植具有广泛的临床应用前景， 但伴随的问题是移植物抗宿主病发生率高， 免疫重建缓慢， 感染机会增加， 如何克服这些问题是目前造血干细胞移植领域的研究热点。近年来一系列重要的临床研究发现， 在去除T细胞的HLA半相合异基因造血干细胞移植中， 杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immnoglobulinlike receptor， KIR）表型不合（移植物抗宿主方向）是对预后有利的因素[1-4]。KIR基因家族是表达在人自然杀伤（nature killer， NK）细胞和部分T细胞表面的具有调节功能的细胞表面分子家族， 它通过与靶细胞表面相应的HLA I类分子结合， 传导激活或抑制信号， 调节NK细胞功能[5]。KIR基因在NK细胞表面呈随机性、 多样性的表达模式， 由此形成了多种多样的能够特异性的识别、 清除异常细胞的NK细胞群[6]。因此， 只有了解KIR基因表达调控机制， 才能进一步明确NK细胞的生物学特性， 才能使人为调控NK细胞活性为临床应用成为可能。但是， 目前关于KIR的表达调控机制尚不完全清楚。本研究旨在从表观遗传学的角度对KIR3DL1基因的表达调控机制进行深入研究。
1 材料和方法
1.1 材料 人NK细胞系NK92MI购自美国ATCC细胞库; 5氮胞苷（5azacytidine， Aza）、 曲古抑菌素A（trichostatin A， TSA）、 肌醇、 巯基乙醇、 叶酸均购自Sigma公司; 氢醌和亚硫酸氢钠由上海生化试剂公司生产; αMEM培养基、 TRIzol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司; 马血清、 胎牛血清购自Hyclone公司; DNA提取试剂盒（Wizard Genomic DNA Purification Kit）、 MMLV逆转录酶、 dNTPs、 oligo(dT)18、 pGEMT easy载体、 T4 DNA连接酶、 感受态大肠杆菌JM109均购自Promega公司; Taq酶购自TaKaRa公司; PCR产物回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）购自Qiagen公司; PCR引物合成及测序均由北京奥科生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 NK92MI细胞用含2 mmol/L左旋谷氨酰胺、 1.5 g/L NaHCO3、 0.2 mmol/L肌醇、 0.1 mmol/L巯基乙醇、 0.02 mmol/L叶酸、 125 mL/L马血清、 125 mL/L胎牛血清的αMEM培养基， 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度条件下培养、 传代。
1.2.2 总RNA及DNA的提取 采用TRIzol RNA提取试剂盒按说明书步骤提取细胞总RNA， 采用Wizard Genomic DNA Purification Kit按说明书步骤提取细胞基因组DNA， 紫外分光光度计定量。
1.2.3 DNA的亚硫酸氢盐修饰 参照文献[7]的方法， 取1 μg经1 mL注射器抽吸剪切后的基因组DNA， 加入去离子水稀释至50 μL， 向其中加入3 mol/L NaOH 5 μL， 37℃孵育25 min使DNA解开双链; 然后加入新鲜配制的10 mmol/L氢醌30 μL及3 mol/L亚硫酸氢钠520 μL（其内已加3 mol/L NaOH 370 μL）， 混匀后于50℃孵育16 h; 用QIAquick Gel Extraction Kit纯化修饰后的DNA， 加入3 mol/L NaOH 5 μL， 37℃孵育20 min终止硫化修饰， 最后经3倍体积的无水乙醇沉淀后溶于20 μL去离子水， 修饰后的DNA于-20℃贮存备用。
1.2.4 PCR扩增及测序检测启动子甲基化状态 按照完全修饰后的KIR3DL1基因DNA序列设计特异性引物， 采用半巢式PCR扩增KIR3DL1基因启动子。第1轮PCR反应的上游引物: 5′GAAGAAGAGTTTGAATTTTAG3′， 下游引物: 5′CCATATCTTTACCTCCAAATC3′。以经亚硫酸氢钠修饰后的DNA为模板， 采用25μL的体系行PCR扩增， 体系包含2.5μL 10×PCR缓冲液、 1.5 mmol/L MgCl2、 200 μmol/L dNTPs、 上下游引物各10 pmol/L和1.25 U Taq酶。扩增条件: 95℃预变性10 min， 然后95℃ 90 s， 48℃ 1 min， 72℃ 1 min， 共34个循环， 循环结束后继续于72℃延伸10 min。将扩增产物经20倍稀释后取1 μL作为模板进行第2轮扩增， PCR条件同前，上 游引物: 5′GTTAGTATAGATTTTAGGTATTT3′， 下游引物序列同前， 扩增产物长度397 bp。PCR产物行15 g/L琼脂糖凝胶电泳， 将PCR产物切胶回收后用T4 DNA连接酶与pGEMT Easy载体相连，连接反应体系: PCR产物与pGEMT Easy载体比例为3∶1， 2×连接反应缓冲液 5 μL， T4 DNA连接酶1 μL， 用去离子水补至10 μL， 4℃孵育过夜。取5 μL连接反应产物转化感受态大肠杆菌JM109， 将PCR初步鉴定阳性的克隆送测序鉴定。
1.2.5 甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂处理NK92MI细胞 实验前1 d将NK92MI细胞传代， 实验当天将细胞接种在 35 mm细胞培养皿中， 每个培养皿的细胞数为2×106个， 用2 mL完全培养基培养。实验孔加入终浓度依次为1 μmol/L、 2.5 μmol/L、 5 μmol/L的Aza， 或同时加入2.5 μmol/L的Aza和50 nmol/L的TSA， 或仅加入50 nmol/L的TSA， 对照孔加入等量PBS缓冲液， 细胞继续置于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度孵箱中培养。每隔24 h更换新鲜培养液及相同浓度的药物， 于处理72 h后收获细胞， 检测基因表达。每组实验重复3次。
1.2.6 RTPCR检测KIR3DL1基因表达 在20 μL逆转录体系中加3 μg RNA， 42℃水浴1 h， 95℃ 5 min灭活逆转录酶后， 取1 μL逆转录反应液为模板行PCR扩增。根据文献[8]合成引物， KIR3DL1上游引物: 5′ACATCGTGGTCACAGGTCC3′， 下游引物: 5′ACAACTTTGGATCTGGGCTT3′， 产物长度为682 bp; 内参照βactin上游引物: 5′CGCGAGAAGATGACCCAGATC3′， 下游引物: 5′TTGCTGATCCACATCTGCTGG3′， 产物长度为734 bp。PCR体系同上。扩增条件: 94℃预变性5 min后， 94℃ 1 min， 61℃ 1 min， 72℃ 45 s， 共5个循环， 然后94℃ 30 s， 60℃ 45 s， 72℃ 45 s， 共30个循环， 循环结束后继续于72℃延伸10 min。PCR产物行15 g/L琼脂糖凝胶电泳， 紫外凝胶成像仪扫描分析， 以KIR3DL1/βactin光密度比值作为KIR3DL1 mRNA水平相对值。
1.2.7 统计学处理 数据以x±s表示， 采用SPSS10.0统计软件包行t检验， 检验水准以P
2 结果
2.1 NK92MI细胞中KIR3DL1启动子区甲基化模式 CpG二核苷酸在KIR基因转录起始区域密度增加， 其出现率（观测值与期望值的比率）≥0.6， 符合CpG岛的定义[9]， 因此， 本研究将KIR3DL1基因自转录起始位点上游-270 bp至下游+69 bp之间的这段长339 bp的序列定义为CpG岛， 为便于分析说明， 将这段序列内的全部19个CpG二核苷酸位点以转录起始位点编号， 上游为“-”， 下游为“+”。NK92MI细胞基因组DNA经亚硫酸氢盐修饰后， 采用PCR扩增KIR3DL1基因启动子序列， 将扩增产物连接到T载体， 转化感受态大肠杆菌， PCR初步鉴定阳性重组子， 随机挑取10个克隆行初步PCR鉴定， 均可扩增出与预期大小相一致的目的片段（图1）。阳性克隆进一步测序， 结果与GenBank数据库中KIR3DL1基因启动子序列（基因号NM_013289）比对， 除第1、 4、 5号克隆序列错误外， 得到7条正确的序列。亚硫酸氢盐修饰可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶， 而甲基化的胞嘧啶保持不变， 以第10号克隆测序结果为例， 可见全部19个CpG二核苷酸位点由于被甲基化， CpG二核苷酸中的胞嘧啶保持不变， 其他部位的“C”全部发生改变（图2）。综合分析所得7条正确序列测序结果， NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子CpG二核苷酸位点甲基化频率在70%～100%之间， 因此， KIR3DL1基因启动子处于高度甲基化状态（图3）。
图1PCR方法鉴定含KIR3DL1启动子pGEMT easy载体的克隆（略）
Fig 1 Identification of clones containing KIR3DL1 promoterpGEMT easy vector by PCR amplification
M: DNA marker; 1-10: PCR products of clone 1 to 10.
图2 经硫化修饰后的KIR3DL1启动子部分测序结果（略）
Fig 2 Partial result of DNA sequencing of bisulfiteconverted KIR3DL1 promoter
图3 NK92MI细胞系中KIR3DL1启动子各CpG位点的甲基化频率（略）
Fig 3 Methylation frequency at inpidual CpG positions of KIR3DL1 promoter in NK92MI cell line
2.2 去甲基化诱导NK92MI细胞KIR3DL1表达增加 为进一步分析KIR3DL1基因启动子甲基化与基因表达的关系， 采用不同浓度的去甲基化药物Aza处理NK92MI细胞， 结果显示， 终浓度为1 μmol/L的Aza作用72 h， NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比无明显增加（t=0.632， P=0.562）， 而2.5 μmol/L和5 μmol/L的Aza可以使KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比分别增加66.6%和114.6%（统计分析结果分别为: t=3.411， P=0.027; t=6.454， P=0.003）， 说明去甲基化药物Aza可以诱导NK92MI细胞中KIR3DL1表达， 随药物浓度增加， 这一诱导作用逐渐增强（图4A）; 单用50 nmol/L的TSA处理NK92MI细胞72 h， KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比无统计学意义（t=0.203， P=0.852）， 将50 nmol/L的TSA与2.5 μmol/L Aza联用处理NK92MI细胞72 h， KIR3DL1 mRNA表达量与单用Aza组相比也无统计学意义（t=1.840， P=0.140）， 说明单用TSA不能诱导KIR3DL1表达， 其与Aza联用后也没有协同作用（图4B）。
图4 RTPCR方法检测经5氮胞苷和曲古抑菌素A处理的NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达（略）
Fig 4 Detection of KIR3DL1 mRNA levels in 5azacytidine and trichostatin Atreated NK92MI cells by RTPCR
A: NK92MI cells were treated with different final concentrations of 5azacytidine (1 μmol/L， 2.5 μmol/L and 5 μmol/L) for 72 h; B: NK92MI cells were treated with 2.5 μmol/L of 5azacytidine and (or) 50 nmol/L of trichostatin A for 72 h. aP
3 讨论
KIR基因家族位于人染色体19q13.4， 目前发现有17个成员。KIR基因家族的特点是各成员在NK细胞表面呈随机性、 多样性的表达， 每个NK细胞只表达KIR基因家族部分成员， 一种KIR分子的表达不依赖于其他KIR分子， 从而形成了表达多种多样KIR分子的NK细胞群[5]。KIR基因的这一特有的表达模式对NK细胞特异性识别和清除异常细胞非常重要。在异基因造血干细胞移植中由于供受者之间KIR不相容引发的异源反应性NK细胞活性有利于增强移植物抗白血病作用、 抑制移植物被排斥和移植物抗宿主病、 促进造血干细胞植入， 延长患者生存期， 因此， 明确KIR表达调控机制， 调节NK细胞活性， 对改善造血干细胞移植预后具有重要临床意义， KIR基因表达调控机制已成为近年来的研究热点[10]。KIR3DL1基因与KIR家族其他成员的5′侧翼区序列同源性高达91.1%～99.6%， 在NK细胞表面呈多样性表达[11]。本研究组的前期实验证实KIR3DL1基因启动子在没有内源性KIR3DL1基因表达的K562细胞中具有活性（结果未显示）; Stewart等[12]的研究也证实， KIR3DL1基因启动子不仅在有KIR3DL1基因表达的NK细胞系YTIndy中有活性， 并且在没有KIR3DL1基因表达的T细胞系Jurkat中也具有活性。可见KIR3DL1基因转录激活所需的反式作用因子在不同细胞系中广泛分布， 提示表观遗传机制可能在调控KIR3DL1基因表达中发挥重要作用。为此， 本研究首先采用亚硫酸氢盐测序法对NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子甲基化状态进行了检测， 证实KIR3DL1基因启动子存在高甲基化， 然后用去甲基化药物处理NK92MI细胞， 研究启动子甲基化与KIR3DL1基因表达的关系， 以确定KIR3DL1基因的表达是否受甲基化调控。
大量研究已证实DNA甲基化可以调控基因表达[13]， 启动子甲基化， 基因转录活性被抑制; 去甲基化， 这一抑制作用被取消。DNA甲基化介导转录抑制的机制可能包括以下三方面: 其一， DNA甲基化直接干扰特异转录因子与各自启动子的识别位点相结合， 抑制基因转录; 其二， 通过在甲基化DNA上结合特异的转录阻遏物（如甲基胞嘧啶结合蛋白1， 2）， 这种蛋白质可以和转录因子竞争性地与甲基化DNA的结合位点结合， 抑制基因转录; 其三， 甲基化改变了蛋白质与DNA的相互作用， 导致染色质结构的改变，抑制基因转录。Aza是一种常用的甲基化抑制剂， 它通过与DNA甲基化酶共价结合， 降低其生物活性，从而逆转DNA甲基化。本研究证实Aza能够诱导NK92MI细胞KIR3DL1基因表达增加， 由此可以推断KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。
组蛋白乙酰化是表观遗传调控的另外一个重要方面[14]， 组蛋白乙酰化由乙酰基转移酶催化完成， 此时染色质呈疏松状态， 有利于基因的表达; 相反， 组蛋白去乙酰化由去乙酰基转移酶催化完成， 此时染色质呈压缩状态， 不利于基因的表达。组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂TSA通过提高组蛋白乙酰化水平， 活化基因转录。但本研究应用TSA处理NK92MI细胞， 未见KIR3DL1基因表达增加， 也没有观察到其与Aza的协同作用; 本研究的前期结果显示， 即使用300 nmol/L的TSA也不能明显增加KIR3DL1基因转录（结果未显示）; Santourlidis等[15]的研究也发现， 用25 nmol/L的TSA处理NKL细胞系不能诱导KIR3DL1基因转录增加。由此推测组蛋白乙酰化可能在KIR3DL1基因表达调控中作用不大。
综上所述， 通过检测NK92MI细胞KIR3DL1基因启动子区甲基化模式， 证实NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子存在高甲基化， 去甲基化处理能够诱导NK92MI细胞表达KIR3DL1基因， 因此， NK92MI细胞中KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。
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表观遗传学的研究意义范文第8篇
关键词 分子肿瘤学；研究型教学；教学改革
中图分类号：G642.0 文献标识码：B 文章编号：1671-489X（2013）12-0081-02
近年来，恶性肿瘤已成为严重威胁国民健康的重要疾病之一。在全球范围内，每年新发癌症患者约1000多万，死亡700多万。我国每年新发病例也逐步提升，如何有效防治恶性肿瘤已成为医学界面临的时代难题[1]。世界各国政府纷纷大力投入，积极探索新技术、新方法，使肿瘤学研究得到飞速发展。
分子肿瘤学是生物学与医学的交叉学科，是将分子生物学技术应用于肿瘤相关基因及其表达产物的研究中，进而阐明肿瘤的发生、发展及其本质，为肿瘤的预防、诊断和治疗提供新措施。北京工业大学生命科学与生物工程学院以抗肿瘤药物的研发为学科发展方向，但随着现代生物技术发展的日新月异，原有的一些肿瘤学基础知识已不能完全满足当前科研的发展需求。为适应生物前沿技术发展趋势，有力地推动生物技术向多专业渗透，促进边缘交叉学科领域的发展，学院首次为研究生开设分子肿瘤学这门课程，主要从分子水平上深入阐述肿瘤学研究的新进展，并结合学院研究生培养目标和课程建设的要求，对该课程教学内容、教学方法以及考核方式等方面进行尝试与探索。这一举措必将促进学院在生物领域和医学领域的科学研究和学科建设。
1 以肿瘤基础研究为背景确立课程教学内容
随着我国医学模式的转变以及全球性卫生重点的转移，肿瘤的防治研究成为科教兴国战略的重要组成部分，不论是肿瘤发生发展的分子机制，还是临床肿瘤诊断治疗，都取得长足进步[1]。
北京工业大学生命科学与生物工程学院生物医学工程专业以探究肿瘤发生发展机制、抗肿瘤药物开发以及基因治疗等为主要研究方向，与医学肿瘤专业相比，在定位和针对性方面都有较为鲜明的特色。学院研究生大多数具有生物学等工科背景，掌握分子生物学、细胞生物学、免疫学及病毒学等丰富的理论知识，在基础研究方面具有优势，但缺少一定的临床肿瘤学知识。因此，分子肿瘤学这门课程的开设不同于医学院传统的临床肿瘤学课程，而是着重以肿瘤基础研究为背景，拓宽研究领域，深化研究层次。授课内容涉及肿瘤发生发展分子机制及其基因治疗、分子药靶、肿瘤表观遗传学等相关领域，以及肿瘤干细胞、miRNA、RNA干扰、蛋白质组学和生物信息学等前沿领域，从基因层面探讨肿瘤发生机制和有效的治疗措施。在此基础上，进一步发现新的肿瘤标志物，用于肿瘤的早期预测与防治。
2 以研究型教学为主导确立课程教学方法
研究生的课程教学处于从本科时期的知识学习型阶段向课题研究型阶段过渡的重要时期，是研究生培养过程中的一个基础环节。因此，这就决定了研究生课程教学不应仅仅只是本科式的知识传授的延续，而应是知识传授与科研能力培养并重。但当前高校教学中仍以传统的灌输式教学方法为主，师生交流与互动少，只适于简单的传授知识，不利于培养研究生自主学习和科研创新能力。
2.1 转变观念意识，优化课程设置
为了更好地增强教学效果，培养学生的综合能力，在开设分子肿瘤学课程之初就积极转换教学观念，以研究型教学为主导，结合课程的基础性与前沿性，优化课程设置，确立新的教学模式[2]。根据学校的研究生培养目标，制定出一套适应研究生教育的教学大纲，既满足研究生的知识需求，又能反应出学科水平和发展趋势。在整个教学过程中，以学生为中心，教师发挥组织和引导作用，根据课程具体内容、学生知识背景及理解能力等因素，充分激发学生的主动性与积极性。
在课程设置中，没有采用固定的教材形式，而是根据学生背景知识的差异，结合当前生物前沿技术在肿瘤学领域的研究趋势，采用启发式、讲座研讨式的教学方式，有目的性地开展授课。课程内容主要分为三部分：
第一部分着重介绍一些肿瘤学相关基本知识，包括细胞生物学如细胞结构与功能、分子生物学如肿瘤的分子标志物等基础知识，既照顾了那些基础薄弱的学生，同时给基础好的学生进行了复习；
第二部分重点从细胞周期与凋亡、细胞信号转导、血管生成、侵袭转移、耐药性等方面阐述肿瘤的癌变机制和肿瘤恶性演进机制；
第三部分介绍肿瘤的分子诊断、预防与治疗等内容与研究进展。
在授课中，从激发学生的创新思维目的出发，鼓励研究生参与课堂讨论，并结合学院一些学术前沿讲座，通过学术报告和学术交流，使学生更广泛拓宽学术视野，提高综合科研水平。
2.2 研究型教学在课堂中的实践
研究型教学是在教师的启发指导下，以学生独立自主学习和合作讨论为前提，以教学中的难点重点内容、有争议的学术问题或学科前沿问题为研究内容，通过学生查阅资料、独立钻研和认真思考展开课堂讨论和交流，使不同的学术观点相互碰撞、交流与补充[3]。
分子肿瘤学属于肿瘤学领域的前沿学科，知识更新快，教材不能涵盖最新的研究内容，因此在授课过程中不能以单一的教材作为参考资料。在教学之前提前做好研究性学习，从同行认可度高的期刊中查阅相关领域的最新研究文献，不断更新知识，在课堂上根据授课内容适时引入这些新技术新方法，既丰富了教学内容，又调动了学生的科研兴趣。
分子生物学、细胞生物学是肿瘤研究的基础，教学内容涵盖的知识点多、涉及面广，新技术与新方法的出现日新月异。如在给学生介绍细胞信号转导这章内容时，课前根据学生研究兴趣与方向设定一些知识点与问题，让学生课后分组查阅相关文献，准备PPT在课堂交流学习。如选择一个信号通路，查阅该通路包括的知识点，如蛋白种类、特点及调控功能，思考该通路在肿瘤生成中发挥怎样的机制？是否有其他小分子如miRNA的参与等？学生课后准备充分，结合自己今后的研究方向，积极探索与发现问题，在课堂交流中活跃，既丰富了课堂教学内容，又促进了对新知识的学习。
此外，还注重将本学院的研究成果融入教学过程中，如在介绍病毒与肿瘤这章内容时，为学生介绍学院科研小组对艾滋病、宫颈癌、食管癌等肿瘤病的研究进展与研究成果；在讲细胞生物学时，结合本实验室在干细胞领域的研究思路与研究进展，为学生介绍干细胞包括肿瘤干细胞、IPS细胞的特征及其在临床中的应用前景。这样让学生更全面了解本学院的研究现状与发展趋势，为今后进实验室开展研究工作奠定基础。
3 完善课程考核方式
课程考核是课程质量的重要内容，以多种形式考核指标来完善考核方式。在分子肿瘤学的课堂教学中，主要从课堂出勤、论文撰写、专题讨论三方面加以评估。其中专题讨论和论文撰写分别占总成绩的70%。在研究生的培养中，文献查阅是研究生从事科学研究非常重要的一个环节，学生可以在查阅、积累、梳理资料中消化、理解知识，并与相关知识融会贯通，运用各种知识解决实际问题。因此，撰写某一个感兴趣领域的研究进展论文是考核的重要内容之一。论文统一按照期刊发表的格式来撰写，考评内容包括论文格式的规范性、选题的新颖性、文献的代表性等。
专题讨论部分的考评主要通过学生对文献的理解程度，包括能否把握文献的核心内容，能否提出自己对文献研究内容的完善建议。同时，学生学术交流水平也纳入成绩考核部分，包括多媒体课件的制作、学术表述的流畅性和学术交流过程的应对能力。这样既可以考核学生查阅文献的能力，同时可以锻炼撰写论文的能力。
4 结束语
肿瘤的分子生物学研究一直是生命科学和医学研究的热点，尤其是癌基因的研究。随着科学技术的发展，生物芯片、RNA技术、表观基因组学及生物信息学等分析方法逐渐成为肿瘤研究的一种高效手段，使研究者更深入地了解疾病发生的分子机制，掌握癌基因特异性的分布规律，揭示基因信号内在的生物学意义，有力地促进肿瘤学的发展，为肿瘤的临床治疗奠定基础。
北京工业大学生命科学与生物工程学院专门为生物技术专业研究生开设分子肿瘤学这门课程，旨在为工科院校培养侧重于肿瘤学基础研究的复合专业型人才。在教学中转变教学观念，引入研究型教学模式，把研究的意识、思维、观点与方法融入教学中，强调对知识学习的自主性与探究性，注重学习过程中研究生的实践与体验[4]。在课堂教学中根据课程性质、教学内容和学生特点，创造性地进行教学设计，激发学生的科研兴趣，有利于全面培养研究生的综合创新能力。
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