表观遗传学现象
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表观遗传学现象范文第1篇
基因组印记
基因组印记是一种不遵循传统孟德尔遗传规律的表观遗传现象。这是由于来源于某一亲本的等位基因或其所在的染色体发生了表观遗传修饰，导致不同亲本来源的两个等位基因在子代细胞中表达不同。受印记机制调控而差异表达的基因称之为印记基因（imprintedgene）。目前在植物、昆虫和哺乳动物中均发现了基因组印记现象，而在鸟类、鱼类、爬行类和两栖类动物普遍认为不存在印记现象。1991年Bartolomei等采用基因敲除技术在小鼠中首次确认了类胰岛素生长因子2型受体和非编码RNAH19基因两个母源印记基因及一个类胰岛素生长因子2型父源印记基因。2007年，杜克大学的研究人员用机器学习的人工智能形式发现了156个新的印记基因，并以此为基础创造了第一张人类基因组印记基因图谱。
X染色体失活
X染色体失活是指雌性哺乳类细胞中两条X染色体的其中之一失去活性的现象，X染色体会被包装成异染色质，进而因功能受抑制而沉默化，这种现象也称为X染色体的剂量补偿（dosagecompensation）。X染色体失活的起始和选择发生在胚胎发育的早期，这个过程被X染色体失活中心（X-inactivationcenter，XIC）所控制，是一种反义转录的调控模式。这个失活中心存在着X染色体失活的特异性转录基因，当失活命令下达时，这个基因产生1个17kb不翻译的RNA与X染色体结合，介导DNA甲基化和组蛋白修饰，引发并维持X染色体的失活。X染色体失活中心还有“记数”功能，即保持每个二倍体中仅有1条X染色体有活性，其余全部失活。X染色体的失活状态需要表观遗传修饰来维持，可以通过有丝或减数分裂遗传给后代。
非编码RNA
非编码RNA是指不能翻译为蛋白质的功能性RNA分子，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA等多种已知功能的RNA以及未知功能的RNA。按照它们的大小可分为长链非编码RNA和短链非编码RNA，前者在基因簇以至于整个染色体水平发挥顺式调节作用，后者在基因组水平调控基因表达并介导mRNA的降解，诱导染色质结构改变，决定细胞的分化命运，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组。microRNA是一类内源产生的长度约为22个核苷酸的非编码小RNA分子，广泛存在于真核生物甚至病毒中，通过调节编码蛋白的基因的表达或翻译来发挥调控作用。microRNA的功能十分广泛并且渗入到了生理病理学的各种调控途径中，包括发育周期、细胞增殖和分化、细胞凋亡、新陈代谢、神经调控、肿瘤发生以及病毒和宿主的相互作用等。在法医学应用中，由于降解后的片段长度过小，不能进行有效的PCR扩增，然而microRNA就能满足降解检材的PCR扩增，开始成为关注的热点。
表观遗传学在法医学中的应用
1表观遗传学与亲权鉴定
自1985年英国遗传学家AlecJeffreys教授首次报道DNA指纹图技术应用于法医DNA分析以来，DNA分析技术已经在多起重大的刑事犯罪侦破和民事诉讼中发挥重要的作用。目前主要是以荧光标记STR与SNP等传统遗传标记进行个体识别和亲权鉴定。但在法医学亲子鉴定中，尤其是子代为杂合子或者父（母）和子代为相同的杂合子的单亲鉴定中，亲代的必需等位基因可能无法确定，使基因座的鉴别能力下降。但通过使用亲缘特异性甲基化遗传标记可以直接判定等位基因的亲源，从而确定亲代的必需等位基因。Zhao等应用甲基化特异性PCR对被甲基化标记的母系SNP位点rs220028进行检测证明了这一观点。另外，Poon等报道，采用DNA甲基化标记可有效识别孕妇外周血中的胎儿DNA，这也为产前的亲权鉴定提供了一种非侵入性的检测方法。
2表观遗传学与年龄推断鉴定
个体年龄推断一直是法医学研究的重要内容。目前实际工作中，个体年龄推断主要依据人类学方法，通过测量与年龄相关的骨骼、牙齿标志等，根据相关模型进行推算。近年来，许多研究者发现表观遗传学为个体年龄推断的研究提供了一种新的思路。DNA甲基化随年龄变化的特点为利用甲基化标记进行年龄推断提供了可能。陈培利等利用人胚肺二倍体成纤维细胞（humanembryoniclungdiploidfibroblast，2BS）进行体外培养，发现其p16基因启动子区及外显子Ⅰ处的DNA甲基化水平随个体细胞代龄的增加而降低。Tra等用限制性标记基因组扫描（restrictionlandmarkgenomescanning，RLGS）技术对T淋巴细胞2000个基因座的甲基化年龄变化情况进行了调查，发现29个基因座有变化，其中23个增加，6个降低。由于甲基化标记数目众多，从中可以筛选出一组适合于法医学应用的、年龄变化有规律的座位，应用于微量检材的年龄推断。尹慧等用高效液相色谱（HPLC）法对94个健康个体DNA甲基化水平的检测发现，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）含量随年龄增加而降低，50岁以上与50岁以下年龄组5mC含量差异具有统计学意义。2010年，Teschendorff等通过对261个绝经后妇女全血样本约14000个基因启动子区超过27000个CpG的甲基化状态进行分析，证实干细胞多梳蛋白家族（polycombgroup，PcG）靶基因比非靶基因更容易随年龄发生甲基化，并且变化不依赖于组织类型、疾病状态和甲基化水平。
Bocklandt等通过分析唾液中的DNA甲基化标记，可以预测一个样本组成员的年龄，结果与实际年龄相差大约在5岁范围内。这项技术如果被确证，可能会成为法医取证方面很有用的一种工具。同时，它还表明了一种可能性：DNA甲基化修饰或许可以提供一种比计算生日更具医学相关性的年龄测定方法。
2010年，NorenHooten等在外周血单核细胞中的800个microRNA标记中筛选出9个与年龄相关的基因，但发现其中5个与疾病有关，该研究表明microRNA可以作为推断年龄以及和年龄相关疾病的诊断指标。
2011年，国内Jin等首次报道了通过体细胞发挥功能的组蛋白修饰基因对衰老这一重要生物学过程的调控作用。这项研究通过生物化学、分子生物学、遗传学和系统生物学相结合的方法，发现组蛋白H3K27me2/3去甲基酶UTX-1/UTX对衰老发挥了重要的调控作用。在秀丽线虫中，该基因的杂合突变体及野生型的RNAi敲降后都能极大地延长线虫寿命，使其抗逆性也大大加强。遗传学分析发现其功能依赖于胰岛素样信号通路。这种通过重新建立组蛋白修饰模式的方式，揭示了细胞的重编程在抑制衰老过程中的重要作用，并提示其作用机制在哺乳动物细胞中同样存在。
3表观遗传学与双生子的鉴别
同卵双生子（monozygotictwins，MZ）是由一个受精卵经过卵裂产生两个单独的细胞，并发育为完全独立的个体，因此同卵双生两个个体的遗传背景完全相同，享有共同的DNA序列。在法医DNA分析领域，现有的DNA分析手段尚不能有效鉴别同卵双生个体。
但是近年来，众多研究都已证实，同卵双生子的表观遗传学水平存在一定的差异。Fraga等对西班牙的40对同卵双生子个体进行研究，发现他们在DNA甲基化、X染色体失活、组蛋白位点特异性乙酰化上存在差异，并且这种差异会随年龄增长而增加。Kaminsky等对114对同卵双生子个体的DNA甲基化的研究显示，血白细胞、口腔黏膜上皮细胞和肠道组织中的甲基化状态均存在差异。
此外，Ollikainen等对新生儿不同组织相关的4个差异甲基化区域的甲基化状态进行了研究，发现甲基化水平存在显著差异。从上述研究成果中可以看出，研究人员已经把目光投入到了法医DNA分析的全新领域，尤其是DNA甲基化在同卵双生子中的研究。这些都为采用DNA甲基化这一表观遗传学标记进行同卵双生子个体甄别的可能性提供了强有力的理论支撑。
4表观遗传学与组织来源鉴定
在常见的法医学案件中，有时需要对生物检材的组织来源进行鉴定。传统的形态和生化方法信息含量少，容易受各种条件的影响，因此常常受到限制。随着分子生物技术的发展，以表观遗传学为基础的组织鉴定方法存在明显优势，越来越为人们所关注。
例如，富含CpG的Alu重复序列，在体细胞中是甲基化的，在生殖细胞中却是低甲基化的，有一个在进化上比较年轻的Alu亚族在中几乎是完全没有甲基化的。通过对这一Alu亚族甲基化的分析，就可以判断检材是否含有。范光耀应用联合亚硫酸氢盐的限制酶法，调查、常见体液、分泌液和组织的DEAD盒多肽4［DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp）boxpolypeptide4，DDX4）］基因启动子甲基化水平，发现中的甲基化水平显著高于非组织。因此，选择一个合适的界值，可以根据DDX4甲基化水平有效地鉴别（斑）的种属来源。
Hanson等运用RT-PCR技术，根据microRNA的细胞组织特异性对血液、、唾液、阴道分泌液和经血进行来源鉴别，并通过与21种人体组织比对验证了各种斑痕microRNA表达的特异性，用于检测RNA的模板量最低可达50pg。Zubakov等运用微阵列和Taqman定量PCR技术确证了一些能运用于法医学实践识别血痕和精斑的稳定的microRNA标记。该项研究不仅将灵敏度提高到相当于单细胞水平的0.1pgRNA模板量，而且在新鲜与陈旧样本的比对中发现其microRNA分子绝对含量未发生明显变化。
5其他
近年来，随着学者们对RNA在法庭科学领域的研究逐渐广泛和深入，发现microRNA在法医学领域的应用价值也日益重要。2007年王芬等发现有6个microRNA分子在H2O2诱导PC12细胞凋亡后表达显著下调，这一结果为法医病理学者研究脑缺血再灌注损伤中神经细胞凋亡的机制提供了理论依据。2010年李文灿等在研究大鼠心肌组织microRNA降解与死亡时间的相关性时发现，其含量在机体死后120h内保持相对稳定的水平，可作为内参指标反映其他生物指标的变化水平。
随着分子生物学技术的飞速发展，法医工作者又面临一项新的挑战，即如何在日常的亲缘鉴定和个体识别工作中有效甄别伪造DNA。用于伪造DNA常使用PCR扩增的方法，因此使用亲缘特异性甲基化遗传标记，可以在进行亲子鉴定和个体识别的同时，检测样本的甲基化状态，从而鉴别样本是否为人工伪造DNA。因此DNA甲基化遗传标记在鉴定DNA是否人工伪造中发挥着重要的作用。
表观遗传学现象范文第2篇
[关键词] 心力衰竭；表观遗传学：药理学
[中图分类号] R541.61 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）06（a）-0007-03
表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因及基因表达发生了可遗传的变化。这些改变包括DNA的甲基化、多种形式的组蛋白修饰及小分子RNA（microRNA）等。个体间疾病易感性及治疗反应性的差异在很大程度上取决于遗传因素[1]。然而，根据全基因组研究，笔者不得不承认遗传表型的改变不仅仅是核苷酸序列的变化[2-3]。表观遗传学与核苷酸的改变共同调控了基因的表达，因而从另一种角度解释了个体间的差异。
表观遗传学研究发现，基因及其表达的遗传性改变不仅仅是指基因突变或基因多样性等DNA序列的变化。已知的三种可调节基因表达的表观遗传学改变主要是：基因组DNA的甲基化，组蛋白修饰，非编码RNA的调节（如microRNA）。上述机制均涉及外在因素在蛋白质编码序列不变的情况下仍可调节基因转录[4]。表观遗传学调节机制存在个体及组织差异性，并且可以随年龄增长、环境及疾病状态的改变而变化。表观基因组在基因组表达过程中起关键作用，个体间基因表达的不同造成药物不同的反应性，这可能是通过表观遗传学改变进行调节的。因此，目前认为表观遗传学改变可以帮助解释基因突变在药物反应中的作用，继而在临床医学中发挥作用，这一迅速崛起的新学科称为表观遗传药理学。个体间药物的反应性不同，该学科不仅研究表观遗传因子在这一过程中的作用，而且旨在开发新的药物靶点[5]。笔者认为表观遗传药理学与遗传药理学将共同在药理学、临床医学中发挥重要作用。
目前为止，表观遗传药理学的大多数研究集中于肿瘤学领域，例如，研究细胞色素p450在个体间表达的差异。幸运的是，表观遗传学修饰的作用已被应用于解释其他复杂并且多源的现象，应用的范围越来越广。在这里，笔者总结了表观遗传修饰在心衰及心血管疾病治疗方面最新的研究。
1 表观遗传修饰与心力衰竭
1.1 组蛋白的修饰
庞大的真核生物基因组在高度保守的组蛋白的作用下得到了紧密的压缩。在核小体中，基因组DNA围绕核心组蛋白（核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4各两组）折叠、压缩，形成了染色体的基本单位。基因组DNA与染色体蛋白的相互作用有助于转录因子向靶基因片段聚集，从而调节转录活性[6]。通过这种机制，核小体利用其核心组蛋白的共价修饰传递表观遗传学信息。这些修饰包括组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化及SUMO化修饰。核心组蛋白的氨基末端从染色质丝上伸出来，与DNA或其他组蛋白、蛋白质等相互作用。该末端上的赖氨酸、精氨酸残基是组蛋白修饰的主要靶点。多数研究旨在了解赖氨酸乙酰化、甲基化的作用。事实证明，赖氨酸的乙酰化作用主要与染色质亲和力及转录相关，而赖氨酸的甲基化作用取决于何种残基被修饰。
有趣的是，正如Mano所总结的那样，组蛋白乙酰化的调控与心肌肥厚相关。去氧肾上腺素可诱导心肌细胞肥大，这一过程需要乙酰基转移酶介导的组蛋白乙酰化。与此结果相一致的研究是针对Ⅱ类组蛋白去乙酰基酶（HDACs）5、9的研究，其通过抑制心肌细胞增强因子2（MEF2）的活性进一步阻碍致肥厚基因（pro-hypertrophic genes）的表达来发挥抗肥厚的作用。与此相反，Ⅰ类HDACs具有相当强的致肥厚作用，其通过调节磷脂酰肌醇三磷酸酰胺磷酸酯酶的表达发挥作用。这意味着，HDACs在多水平上控制肌肉细胞的体积。
1.2 DNA甲基化
在真核生物中，DNA甲基化是通过将甲基团转移到核苷酸胞嘧啶环的5''位碳原子上完成的。在哺乳动物体内，DNA甲基化主要发生在基因的5''-CG-3''序列，也指的是CpG双核苷酸；人体内，大约70%的CpGs发生甲基化。另一方面，未甲基化的CpGs存在于许多基因的5''端调控区域，以CpG岛的形式出现。与其他DNA区域相比，CpG双核苷酸在CpG岛出现的概率较高。人体内CpG岛甲基化的不同是表观遗传学改变的组成部分。
DNA胞嘧啶甲基化有助于局部转录因子复合物的结合，其与组蛋白修饰共同在局部及整个基因组中影响染色体的结构。因此，DNA甲基化的一个重要作用是调控基因的表达。在这方面，CpG岛超甲基化可以使基因沉默，而低甲基化使基因发生转录。有人认为，甲基化是一种稳定遗传的修饰，但同时它也受到环境因素的影响。如小鼠野鼠色基因位点，可以受到其上游转座子甲基化状态的影响。从遗传角度来讲，完全相同的亲代其野鼠色基因不同的甲基化状态可使得后代出现不同的毛色[7]。
最近，Kao等[8]的研究结果发现，DNA甲基化在心衰特定的基因转录调控中发挥作用。他们发现促炎症基因TNF-α可下调肌浆网Ca2+-ATPase（SERCA2A）的表达，这是通过增强SERCA2A启动子的甲基化状态完成的。Movassagh等[9]发现，在心肌病及人类心肌组织形成时甲基化的状态是不同的。而且，他们鉴别出三个基因位点（IECAM1、PECAM1、AMOTL2），在不同的心脏样本中，位点甲基化状态与基因表达的调控密切相关。
1.3 MicroRNAs
MicroRNAs是短的双链RNA分子，来源于细胞核及细胞质中较大的RNA前体，其可以在基因转录后对基因表达发挥调节作用。miRNAs可以对30%～50%的蛋白质编码基因进行调控，这一过程主要是通过与mRNA3''端未转录区域的碱基对进行互补结合，继而干扰转录，靶mRNAs可降解或暂时沉默[10]。miRNAs调节蛋白的表达是非常复杂的，多种miRNAs可以作用于同一基因，不同基因也可受到同一种miRNAs的调节。miRNAs的表达具有组织、疾病特异性。近年来，多种病理状态下的miRNA分子标记已被检测出来，如各种类型的肿瘤以及多种心血管疾病[11]。
越来越多的证据表明，miRNAs与基本的细胞功能密切相关。目前，miRNAs与心衰的关系已得到明确，在过去的几年中，该领域的报道层出不穷。对心血管疾病的研究主要集中于两种心脏组织特异表达的miRNA家族（miRNA-1/miRNA-133、miRNA-208）。多项研究显示，miRNA在健康、高血压以及不同病因所导致的人、小鼠、大鼠衰竭的心脏中均有表达，Divakaran等[12]发现心脏特异性的miRNA-208不仅可调节心肌细胞肥大、纤维化同时可在应激、甲退时调节β-肌球蛋白重链（β-MHC）的表达。这种miRNA由α-MHC基因的内含子编码。该基因编码α-MHC及一种主要的心肌收缩蛋白，使心脏变大，在应激以及激素信号作用下通过miRNA-208及其作用位点发挥调节作用。再者，定向删除心肌特异性的miRNA，miRNA-1-2，揭示了它们在心脏中的多种功能，包括调节心脏的形态发生、电信号传导及细胞周期的调控。Thum等[13]发现，受损心肌中miRNA标记与胚胎心中miRNA表达的类型极为相似，这说明受损心肌中重启了胚胎基因的表达程序。Thum等[13]另一个发现是miRNA-21可以调控ERK-MAP激酶途径，这种调控在心脏成纤维细胞中尤为明显，心肌细胞中却没有这种表现，这可以影响到心脏的结构及功能。在成纤维细胞中，miRNA-21水平的增高可通过抑制特定基因来激活ERK激酶，经由这种机制，miRNA-21调节了间质纤维化、心肌肥厚。上述研究揭示了在心脏成纤维细胞中，基因调节的另一种方式是在miRNA介导的旁分泌水平上进行的。
miRNA在心脏肥厚反应中的意义得到了进一步的研究，miRNA成为基因调控的主要调节因子。到目前为止，miRNA已被证实不仅可以影响心肌，还可以影响心脏电信号转导及调节血管再生[14]。
2 表观遗传筛选方法
表观基因组学示意图不是固定的，它因细胞类型、时间的不同而不同，并且可在生理学、病理学、药物作用情况下发生改变。因此，作为人类基因组计划的后续工程，表观基因组测序是一项艰巨的任务。虽然判断基因组序列的表观遗传学状态是比较容易完成的，描绘整个表观基因组需要对数十个基因组进行测序，覆盖一个有机体在生命不同阶段的所有细胞类型。
亚硫酸氢盐测序法是标测DNA甲基化类型最为准确的方法。基因组DNA与亚硫酸氢钠相作用，导致未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。为观察特定基因的甲基化状态，用特异性引物对目的片段进行扩增，随后对产物测序。在序列中，甲基化的胞嘧啶被标记为Cs，未甲基化的胞嘧啶为Ts。
近来出现了多个对甲基化进行定位的全基因组研究方法，它们都是以甲基化和未甲基化的CpGs对限制性内切酶的敏感性不同为基本原理的。限制长度的基因组扫描利用两种酶双酶切DNA，一种是频繁切割的甲基化非敏感性限制内切酶，另一种是罕见的甲基化敏感性的酶如Not1，这种酶只有在非甲基化状态时才可以酶切所识别的位点。还有一种完全不同全基因组研究方法是利用DNA芯片技术，它可以一次性标测成千上万的CpG岛的甲基化状态。这种方法可以用来识别CpG岛，相对于正常的调控过程来说，CpG岛在肿瘤组织中发生甲基化。
亚硫酸盐转化的替代方法是ChIP-seq方法（一种与测序相结合的染色质免疫沉淀方法）。通过免疫共沉淀技术使得目的蛋白与DNA发生交联，然后对DN段进行基因组测序。这一方法可以帮助识别任何DNA相关蛋白的DNA结合位点。该技术还可以提供组蛋白修饰的信息，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化修饰。对ChIP技术进行改进得到的DCS方法，是将ChIP与消减式PCR进行偶联。该方法旨在避免基因组片段与芯片杂交后产生非特异性信号。
以同样的方式可以检测人体病理状态下miRNA的作用，大多数研究是利用高通量的方法分析临床病例中总miRNA的表达情况。高通量技术是以miRNA基因芯片和real-time RCP为代表的。尽管分子间的差别给这些技术带来了巨大的挑战，但miRNA芯片最大的优点是具有很高的特异性，而缺陷是其敏感性较低。
3 药物可以改变表观遗传状态
表观遗传学改变正常及疾病状态下的表型，这可能意味着充分理解和调控表观基因组对于人类常见疾病的防治具有重要意义。表观遗传学为我们提供了一个重要的窗口，来认识环境与基因在疾病发生过程中的相互作用以如何调节这些作用达到改善人类健康的目的。
miRNA派生的反义寡核苷酸是单链RNA分子，对其进行化学修饰可能是针对致病miRNA新的方法。但是这种方法困难重重，miRNA属于密切相关的家族，且很难合成针对每一种miRNA的反义寡核苷酸。再者，一个单独的miRNA可针对多种基因发挥作用，它们之中可能含有对心肌有益的分子。在这方面，寡核苷酸的化学修饰可能会特异性破坏miRNA与单个mRNA的作用，这可能是疾病治疗良好的备选方案。每一种miRNA可以以不同的强度针对成百上千的基因发挥作用，所以在体内miRNA修饰的最终作用尚不明了。最终，将miRNA拮抗剂应用于临床领域将面临很多困难，这与我们在基因治疗方面所遇到的极为相似，如导入方式、载体、特异性以及毒性等问题[15]。至少在理论上，针对特异性miRNA的方法将来可能是治疗缺血性心脏病、心肌肥厚、心衰、血管再生、离子通道病的有效手段，可控制心衰的发展。
另一种方法可能是将靶DNA甲基化。一些影响基因组DNA甲基化的化学合成剂已经应用于临床，例如5-氮胞嘧啶、抑制甲基转移酶的氮胞嘧啶可以使DN段脱氨基。其它药物是通过阻碍甲基化酶的活性而发挥抑制甲基化作用。更多信息可参照Gomez等[16]的文章。除了要开发可以调节DNA甲基化的药物外，还需要设计可以影响组蛋白修饰的药物。
在抗肿瘤药物的发展过程中，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂占据着重要地位，它可以通过逆转与肿瘤相关的异常表观遗传改变，继而发挥作用。已有证据表明，在心肌肥厚时，HDAC抑制剂可修复基因表达程序。Gallo等证明体外试验中，曲古霉素A、丁酸钠可延缓心脏肥厚。
4 表观遗传学和环境
众所周知，环境因素如毒素、饮食可以影响DNA甲基化和染色质修饰，并且可遗传给下一代。雌激素、抗雄激素类物质可改变DNA甲基化状态降低男性的生育能力，这也是可遗传的。该假说认为，环境因素可以改变表观遗传学标记和基因表达形式，这可能在人类疾病研究中具有重要意义。常见疾病大多受到基因和环境因素的双重影响，环境可诱导表观遗传结构发生改变，进而将基因和环境因素联系起来[17]。
年龄在基因与环境相互作用中发挥重要作用。常见病的发病率随着年龄的增加不断增高，这与在人的一生中表观遗传学改变不断累积有关。有研究发现，相对于年轻者而言，年长的同卵双胞胎体内总DNA甲基化及组蛋白H3K9乙酰化的水平较高，但该研究没有检测同一个体中表观遗传学改变随时间变化的情况。
5 结论
表观遗传学为研究个体在临床疗效、药物反应及毒性间的差异，以及发现新的药物治疗靶点等方面开拓了更为广阔的空间。随着人类表观基因组工程的开展，表观遗传学机制得到不断完善，这有助于更为充分地了解人类疾病和表观遗传药物的一系列分子靶点。表观遗传药理学已被应用于肿瘤学领域，对于心血管疾病的表观遗传学研究不断增多，尤其是在miRNA方面的研究最为突出。Mishra等[18]清楚地描述了心血管疾病微观RNA组学的最新进展，以及miRNA作为一种潜在治疗靶点或药物制剂的前景。
表观基因组学在健康或疾病状态下表现型的形成过程中发挥重要作用，这可能意味着充分认识和合理调控表观基因对于人类常见病的防治具有重要意义。
[参考文献]
[1] De Boer RA，Van der Harst P，van Veldhuisen DJ，et al. Pharmacogenetics in heart failure：promises and challenges [J]. Expert Opin Pharmacother，2009，10（11）：1713-1725.
[2] Codd V，Mangino M，Van der Harst P，et al. Common variants near TERC are associated with mean telomere length [J]. Nat Genet，2010，42（3）：197-199.
[3] Newton Cheh C，Johnson T，Gateva V，et al. Genome-wide association study identifies eight loci associated with blood pressure [J]. Nat Genet，2009，41（6）：666-676.
[4] Margulies KB，Bednarik DP，Dries DL，et al. Genomics，transcriptional profiling，and heart failure [J]. J Am Coll Cardiol，2009，53（19）：1752-1759.
[5] Peedicadyl J. Pharmacoepigenetics and pharmacoepigenomics [J]. Pharmacogenomics，2008，9（12）：1785-1786.
[6] Mano H. Epigenetic abnormalities in cardiac hypertrophy and heart failure [J]. Environ Health Prev Med，2008，13（2）：25-29.
[7] Ball MP，Li JB，Gao Y，et al. Targeted and genomescale strategies reveal gene-body methylation signatures in human cells[J]. Nat Biotechnol，2009，27（5）：361-368.
[8] Kao YH，Chen YC，Cheng CC，et al. Tumor necrosis factor-alpha decreases sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expressions via the promoter methylation in cardiomyocytes [J]. Crit Care Med，2010，38（1）：217-222.
[9] Movassagh M，Choy MK，Goddard M，et al. Differential DNA methylation correlates with differential expression of angiogenic factors in human heart failure [J]. Plos One，2010，5：8564.
[10] Schroen B，Heymans S. MicroRNAs and beyond：the heart reveals its treasures [J]. Hypertension，2009，54（6）：1189-1194.
[11] Silvestri P，Di Russo C，Rigattieri S，et al. MicroRNAs and ischemic heart disease：towards a better comprehension of pathogenesis，new diagnostic tool and new therapeautic target [J]. Recent Pat Cardiovasc Durg Discov，2009，4（2）：109-118.
[12] Divakaran V，Mann DL. The emerging role of microRNAs in cardiac remodeling and heart failure [J]. Circ Res，2008，103（6）：1072-1083.
[13] Thum T，Cross C，Fiedler J，et al. MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts [J]. Nature，2008，456（7224）：980-984.
[14] Zorio E，Medina P，Rueda J，et al. Insights into the role of microRNAs in cardic diseases：from biological signaling to therapeatic targets [J]. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2009，7（1）：82-90.
[15] Puceat M. Pharmacological approaches to regenerative strategies for the treatment of cardiovascular diseases [J]. Curr Opin Pharmacol，2008，8（8）：189-192.
[16] Gomez A，Ingelman SM. Pharmacoepigenetics：its role in interindividual differences in drug response [J]. Clin Pharmacol Ther，2009，85（4）：226-230.
[17] Turan N，Katar S，Coutifaris C，et al. Explaining interindividual variability in phenotype：is epigenetics up to the challenges? [J]. Epigenetics，2010，5（1）：16-19.
表观遗传学现象范文第3篇
[关键词] 表观遗传学；抑癌基因；DNA甲基化；胃癌
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2012）36-0012-02
肿瘤的发生发展是一个多因素参与的复杂过程。众所周知，肿瘤发生发展的主要原因为原癌基因的激活和抑癌基因的失活，目前越来越多的证据表明，其发生机制除遗传学改变外，表观遗传学改变也占有非常重要的地位。目前在表观遗传学机制中研究最多的是DNA甲基化。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制与DNA甲基化状态的改变密切相关。
1 表观遗传学与胃癌
表观遗传学（Epigenetics）是指基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化，主要包括DNA甲基化、染色质构象改变和组蛋白修饰等[1]。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶5位碳原子上[2]。
肿瘤中的表观遗传学改变是由Feinberg和Vogelstein两位科学家于1983年首次描述的，他们发现在肿瘤中同时存在两个互相矛盾的表观遗传现象，即全基因组低甲基化和局部高甲基化[3]。研究表明，全基因组的低甲基化可以导致ras、c-myc等原癌基因激活，而DNA启动子区CpG岛的高甲基化可以导致p16、APC等抑癌基因失活，两者协同作用，从而促使肿瘤的发生。
胃癌（gastric cancer，GC）由于其患病率高、预后差、有限的治疗选择等，仍然是全球范围内一个重要的临床挑战。虽然胃癌的发病率逐年下降，但它仍然是癌症死亡的第二大原因和四个最常见的恶性肿瘤之一[4]。研究表明，相比其他类型的癌症（如大肠癌），胃癌中基因突变的频率相对较低，而以DNA甲基化为主的表观遗传改变却发挥了关键作用。
2 抑癌基因甲基化与胃癌
目前，DNA甲基化研究最深入的方向是抑癌基因（tumor suppressor genes，TSGs）的异常甲基化。Bird等研究发现DNA启动子区CpG岛甲基化可导致肿瘤细胞抑癌基因失活。从此，表观遗传改变在肿瘤发生和发展中的作用受到了人们的高度重视，并成为了研究的热点[4]。人类基因组中，约有50%基因的启动子区5'端富含CpG，这种区域称为CpG岛（CpG island），其长度不小于500 bp、GC含量不少于55%。CpG岛在正常情况下一般处于非甲基化状态，当其发生甲基化时，基因的空间结构也随之改变，表达受到抑制。
越来越多的研究证实，胃癌的发生与抑癌基因启动子区CpG岛的异常高甲基化密切相关[5，6]。目前已知胃癌中，包括p16、APC、CDH1、RASSF1A、CHFR、DAPK、PTEN和RUNX3等数十个抑癌基因，均是由于高甲基化而失活的[7]。这些基因参与DNA修复、调节细胞周期、信号转导等多个细胞生理过程，与胃癌的发生发展具有密切关系。以下是几个近年来研究较热门且具有代表性的抑癌基因。
2.1 PTEN基因
PTEN基因定位于人染色体10q23.3，由9个外显子组成，编码由403个氨基酸组成的蛋白质，具有磷酸酯酶的活性。PTEN蛋白可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展。研究显示，PTEN基因在多系统恶性肿瘤中均表达下降，均与DNA异常高甲基化有关。Liu S等[8]对56例胃癌标本中PTEN基因mRNA表达及启动子区CpG岛甲基化状态进行检测，结果显示胃癌组织PTEN基因表达较癌旁正常组织明显下降（P ＜ 0.01），甲基化率48.2%明显高于癌旁正常组织3.6%（P ＜ 0.01），说明PTEN基因甲基化可能是其低表达的原因。
2.2 RASSF1A基因
RASSF1A基因位于人染色体3p21.3区域位点，内含编码340个氨基酸的开放阅读框，编码相对分子质量38 800 Da的蛋白多肽，通过参与抑制Ras/RASSF1/ERK通路的信号转导调控细胞的凋亡、维持微血管稳定性[9]。其表达失活，可以使胃黏膜细胞凋亡受抑，并向恶性细胞转化。研究证实，RASSF1A基因在肺癌、胃癌、乳腺癌等多种实体瘤中均存在甲基化导致的表达失活。林海等[10]检测出RASSF1A基因在62例胃癌标本较56例正常组织中的mRNA表达明显下降（P ＜ 0.01），甲基化率分别为66.1%和23.2%，癌组织甲基化率是正常组织的2.80倍，差异有统计学意义（P ＜ 0.01），表明RASSF1A基因高甲基化可能是导致其表达降低的原因。
2.3 RUNX3基因
RUNX3基因定位于人染色体1p36区域位点，属于RUNX基因家族，在哺乳动物发育和肿瘤中发挥重要作用，并已被证实与胃上皮细胞稳态和胃癌的发生相关[11]。研究发现，有相当比例的胃癌组织中由于RUNX3基因启动子区CpG岛异常甲基化而不表达RUNX3。何小兵等[12]分别对9种胃癌细胞系和35例胃癌患者手术切除肿瘤组织及其癌旁组织RUNX3基因启动子区域甲基化进行检测，结果显示在7种胃癌细胞系中RUNX3基因启动子区域过度甲基化，RUNX3基因在35例胃癌及其癌旁组织中甲基化率分别为40.0%和8.6%。因此，RUNX3基因启动子区CpG岛甲基化可能是导致基因转录失活及其表达下调的主要原因。
3 CpG岛甲基化表型与胃癌
肿瘤细胞中多个基因或DNA位点甲基化的状态称为CpG岛甲基化表型（CpG island methylation phenotype，CIMP）。如果有3个以上基因CpG岛处于甲基化状态称为甲基化表型阳性（CIMP+），反之则称为甲基化表型阴性（CIMP-）。多项研究表明，胃癌中存在甲基化表型阳性。例如Tahara T等[13]检测了146例胃癌标本中p14、p16、DAPK、E-cadherin 4个抑癌基因的甲基化状态，结果显示43.2%的病例表型为CIMP+。Kim等[14]检测了40例早期胃癌中hMLH1、TIMP3、THBS1、DAP2K、GSTP1、APC和MINT2的甲基化状态，结果显示40%病例表型为CIMP+。这表明，甲基化表型阳性在胃癌的早期就已经发生，可以作为早期胃癌的诊断指标之一。
此外，有研究表明，CIMP+与胃癌的分期和侵袭转移无关，而与胃癌Borrmamm分型和预后相关。Park等[15]对196例胃癌标本中16个肿瘤相关的CpG岛或位点进行了分析，结果显示CIMP+的胃癌患者预后较差。这表明甲基化表型阳性也可以作为胃癌预后判断的一项指标。
4 抑癌基因甲基化临床应用前景
检测肿瘤抑癌基因的甲基化状态可以用于癌症的筛选、风险的预测和治疗的选择。研究发现，抑癌基因的异常高甲基化在胃癌癌前病变阶段（如慢性胃炎和肠上皮化生）也经常检测到，说明DNA甲基化的发生往往早于各类癌症的肿瘤形成，这使得它尤其适用于癌症风险预测[16]。此外，若干报道指出，癌特异的、甲基化的DNA可以在微量的生物体液中被检出[17]，这表明它可能是一个灵敏的非侵入性诊断的标记物。
目前研究者认为，DNA甲基化在一定程度上是一个可逆的过程。DNA甲基化需要DNMT的催化，因此应用甲基转移酶抑制剂抑制DNMT的活性后，可使DNA甲基化逆转，称为去甲基化。目前研究较深入的甲基转移酶抑制剂为5-氮杂-2-脱氧胞苷，大量体外研究证实，应用5-氮杂-2-脱氧胞苷处理后，抑癌基因表达缺失的胃癌细胞株均重新表达该基因[18]。故通过去甲基化恢复抑癌基因表达可恢复基因正常功能，有可能达到治疗癌症的目的。
综上所述，抑癌基因甲基化是胃癌发生发展的重要机制之一，多基因甲基化状态的检测及去甲基化药物的研究对胃癌的预防、诊断和治疗均具有长远意义。而如何根据不同患者的实际情况选择进行检测的抑癌基因从而提高早期胃癌检出率，以及去甲基化药物的选择和临床应用还有待进一步的研究。期待更加深入的科学实验为临床诊疗提供日趋完善的理论基础，使得日渐成熟的甲基化检测技术及去甲基化药物早日广泛应用于恶性肿瘤的诊治。
[参考文献]
[1] Saavedra KP，Brebi PM，Roa JCS. Epigenetic alterations in preneoplastic and neoplastic lesions of the cervix[J]. Clin Epigenetics，2012，4（1）：13.
[2] Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory[J]. Genes Dev， 2002，16（1）：6-21.
[3] Feinberg A. Interview： Professor Andrew Feinberg speaks to Epigenomics[J].Epigenomics，2009，1（1）：25-27.
[4] Nardone G，Compare D. Epigenetic alterations due to diet and Helicobacter pylori infection in gastric carcinogenesis[J]. Expert Review of Gastroenterology and Hepatology，2008，2（2）：243-248.
[5] 乔炜，琚坚. DNA甲基化与胃癌的关系研究[J]. 胃肠病学和肝病学杂志，2010，19（11）：965-968.
[6] 庄杰，刘海林. DNA甲基化与胃癌的关系及检测方法[J]. 国际消化病杂志，2008，28（1）：6-8.
[7] Suzuki H，Tokino T，Shinomura Y，et al. DNA methylation and cancer pathways in gastrointestinal tumors[J]. Pharmacogenomics，2008，9：1917-1928.
[8] Liu S，Yu JP，Fu P，et al. Relationship between promoter methylation and mRNA expression of PTEN gene and gastric carcinoma[J]. Chinese-German Journal of Clinical Oncology，2008，7（10）：580-583.
[9] 樊宇靖，刘宾，王立东，等. RASSF1A基因启动子区甲基化在贲门腺癌、食管下段鳞癌组织中的变化及临床意义[J]. 世界华人消化杂志，2011，19（1）：84-88.
[10] 林海，曹俊，张斌，等. RUNX3、RASSF1A启动子高甲基化与胃癌进展转移的关系[J]. 世界华人消化杂志，2010，18（9）：889-896.
[11] Kodach LL，Jacobs RJ，Heijmans J，et al. The role of EZH2 and DNA methylation in the silencing of the tumour suppressor RUNX3 in colorectal cancer[J]. Carcinogenesis，2010，31（9）：1567-1575.
[12] 何小兵，张海元，王卫政，等. 胃癌中Runx3基因甲基化表达及临床研究[J]. 长江大学学报（自科版），2009，6（2）：16-19.
[13] Tahara T，Shibata T，Arisawa T，et al. CpG island promoter methylation （CIHM） status of tumor suppressor genes correlates with morphological appearances of gastric cancer[J]. Anticancer Res，2010，30（1）：239-244.
[14] Kim HC，Kim JC，Roh SA，et al. Aberrant CpG island methylation in early-onset sporadic gastric carcinoma[J]. Cancer Res Clin Oncol，2005， 131（11）：733-740.
[15] Park SY，Kook MC，Kim YW，et al. CpG island hypermethylator phenotype in gastric carcinoma and its clinicopathological features[J]. Virchows Arch，2010，457（4）：415-422.
[16] Tahara T，Arisawa T. Potential usefulness of DNA methylation as a risk marker for digestive cancer associated with inflammation[J]. Expert Rev Mol Diagn，2012，12（5）：489-497.
[17] Shivapurkar N，Gazdar AF. DNA methylation based biomarkers in non-invasive cancer screening[J]. Curr Mol Med，2010，10：123-132.
表观遗传学现象范文第4篇
【摘要】
目的RAS相关结构域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）启动子区超甲基化介导的基因转录失活在卵巢癌中频见，可作为卵巢癌诊治过程中有意义的分子生物学指标，RAS相关结构域蛋白2A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）与RASSF1A同源，其基因异常甲基化在多种肿瘤发生发展中发挥重要作用。本研究探讨上皮性卵巢癌组织RASSF2A甲基化水平，并分析其临床意义及高甲基化与mRNA表达情况的相关性。方法选择2013－10－01－2014－12－31聊城市人民医院手术治疗的50例上皮性卵巢癌、27例交界性上皮性卵巢肿瘤和20例良性上皮性卵巢肿瘤患者，应用甲基化特异性PCR（MSP）检测卵巢肿瘤组织中RASSF2A基因启动子甲基化状态，采用RT－PCR检测其mRNA表达水平。采用5－氮杂2′－脱氧胞苷（5－aza－dC）对人卵巢癌细胞株SKOV3、3AO进行去甲基化干预实验，并检测药物作用前后RASSF2A基因启动子甲基化及其mRNA的表达情况。结果RASSF2A基因mRNA在良性上皮性卵巢肿瘤中的表达阳性率为95．00％（19／20），交界性上皮性卵巢肿瘤为59．26％（16／27），上皮性卵巢癌组织为34．00％（17／50），表达强度依次下降，差异有统计学意义，χ2＝21．855，P＜0．001。RASSF2A基因启动子在良性上皮性卵巢肿瘤组织中的甲基化率为0（0／20），交界性上皮性卵巢肿瘤为22．22％（6／27），上皮性卵巢癌组织为46．00％（23／50），差异有统计学意义，χ2＝15．474，P＜0．001。RASSF2A甲基化水平与卵巢癌患者的年龄、病理类型、临床分期、组织分化程度及淋巴结转移无明显相关性。RASSF2A基因甲基化与其mRNA的表达呈负相关，甲基化阳性组织的mRNA表达水平明显低于甲基化阴性组织。5－aza－dC药物作用后，卵巢癌细胞株中RASSF2A基因甲基化被逆转，而其基因表达明显升高。结论RASSF2A启动子区高甲基化导致的基因表达沉默与上皮性卵巢癌的发生发展有关。
【关键词】
上皮性卵巢癌；甲基化；RAS相关结构域蛋白2A基因；基因检测
上皮性卵巢癌是女性生殖系统中恶性程度最高和预后最差的肿瘤，其病死率居妇科恶性肿瘤首位［1］。大量研究已证实，RAS相关结构域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）启动子区超甲基化介导的基因转录失活是卵巢癌中的频发事件，可作为卵巢癌诊治过程中有意义的分子生物学指标［2－4］。与RASSF1A具有高度同源性的RAS相关结构域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）异常甲基化在多种肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。本研究通过RT－PCR和MSP方法检测良性上皮性卵巢肿瘤、交界性上皮性卵巢肿瘤和上皮性卵巢癌组织及卵巢癌细胞株中RASSF2AmRNA的表达及其启动子甲基化状态，分析RASSF2A启动子甲基化与其mRNA的表达以及卵巢癌临床病理特征的关系，探讨RASSF2A启动子区甲基化在卵巢癌发生发展中的作用。
1材料与方法
1．1标本来源收集2013－10－01－2014－12－31聊城市人民医院妇产科收治的上皮性卵巢癌患者50例，交界性上皮性卵巢肿瘤27例，良性上皮性卵巢肿瘤20例。所有组织标本均经病理学确诊，所有患者术前均未接受任何放化疗或激素治疗。标本采集在离体后10min内进行，并迅速放入液氮罐保存，后转移至－80℃冰箱保存。上皮性卵巢癌病例中，依据2006年FIGO分期标准，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期31例；依据2003年WHO组织学分类标准，浆液性腺癌24例，黏液性腺癌16例，子宫内膜样癌10例；高分化10例，中分化15例，低分化25例；有淋巴转移27例，无淋巴转移23例；年龄＜50岁者19例，≥50岁者31例。
1．2细胞株卵巢癌细胞株SKOV3和3AO由聊城市人民医院中心实验室提供。
1．3主要试剂Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，DNA甲基化试剂盒购自德国Qiagen公司，引物均由上海生工设计合成。
1．4实验方法
1．4．1细胞培养及药物处理在37℃、5％CO2及饱和湿度的孵育箱中静置培养卵巢癌细胞株，用含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养基及时换液。用终浓度为10μmol／L的5－aza－dC处理卵巢癌细胞株，常规换液，保持上述药物浓度。于药物连续作用72h后收集细胞。
1．4．2RT－PCR检测参照Trizol试剂说明书提取组织及细胞总RNA。测得其浓度及纯度符合实验要求后，取2μL总RNA进行逆转录。所得cDNA经半定量PCR扩增。RASSF2A基因上游序列为5′－GCG－CCTAGAACGTGTTTTTC－3′，下游序列为5′－ACT－AGGCGTCCTCACATTGC－3′，扩增产物长度为563bp。以GAPDH作为内参基因，上游为5′－CAA－CGGATTTGGTCGTATT－3′，下游为5′－CACAGTC－TTCTGGGTGGC－3′，扩增片段长度为166bp。PCR反应条件为95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察实验结果。
1．4．3DNA的提取及亚硫酸盐修饰采用酚氯仿法提取组织及细胞总DNA，并对基因组DNA进行亚硫酸盐修饰，按照甲基化特异性PCR试剂盒说明书进行。所得产物直接用于PCR扩增或保持在－20℃冰箱保存备用。
1．4．4甲基化特异性PCR使用2对引物检测RASSF2A基因启动子甲基化状态。甲基化引物正义链为5′－GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG－3′，反义链为5′－AAAAACCAACGACCCCCGCG－3′，非甲基化引物正义链为5′－AGTTTGTTGTTGTTTTTTA－GGTGG－3′，反义链为5′－AAAAAACCAACAACCC－CCACA－3′，扩增产物长度均为108bp。反应条件为95℃预变性10min，95℃变性30s，58℃复性30s（甲基化）；54℃复性30s（非甲基化），72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。所得产物电泳后摄像，分析结果。
1．4．5甲基化结果判定标准若仅甲基化引物扩增出阳性条带，为完全甲基化；若仅非甲基化引物扩增出阳性条带，为非甲基化；若两者均扩增出阳性条带，为部分甲基化。
1．5统计学方法采用SPSS13．0分析数据。RASSF2A甲基化、mRNA表达在卵巢肿瘤组织间的差异以及基因甲基化与临床病理特征等计数资料采用χ2检验或Fishier确切概率法。RASSF2A甲基化及其表达之间的关系采用Spearman相关性分析法。卵巢癌细胞系中RASSF2AmRNA表达量比较采用t检验。检验水准α＝0．05。
2结果
2．1卵巢肿瘤组织RASSF2AmRNA的表达表1和图1所示，卵巢良性肿瘤、交界性肿瘤及卵巢癌组织中RASSF2AmRNA表达率依次降低，分别为95．00％（19／20）、59．26％（16／27）和34．00％（17／50），差异有统计学意义，χ2＝21．855，P＜0．001。两两比较结果显示，卵巢癌组与交界性肿瘤组比较，χ2＝4．568，P＝0．033；卵巢癌组与良性肿瘤组比较，χ2＝21．280，P＜0．001；交界性肿瘤组与良性肿瘤组比较，χ2＝7．719，P＝0．005；差异均有统计学意义。
2．2卵巢肿瘤组织RASSF2A基因甲基化水平表1和图2所示，97例卵巢组织标本均成功进行了MSP实验。50例卵巢癌组织标本中有13例发生了部分甲基化，10例完全甲基化，甲基化频率为46．00％（23／50）；27例交界性卵巢肿瘤中甲基化阳性率为22．22％（6／27），其中2例为完全甲基化。而20例良性卵巢肿瘤组织均未扩增出甲基化阳性条带，甲基化频率为0，差异有统计学意义，χ2＝15．474，P＜0．001。
2．3RASSF2A基因甲基化与其表达的相关性表2所示，RASSF2A基因甲基化状态与其mR－NA表达水平呈负相关。在RASSF2A基因发生甲基化的组织中，RASSF2A基因表达明显降低，提示RASSF2A基因高甲基化可能是该基因表达沉默的原因之一。
2．4甲基化状态与卵巢癌临床病理特征相关性表3所示，RASSF2A甲基化程度与卵巢癌患者的年龄、病理类型、临床分期、分化程度及淋巴结转移之间无明显的相关性。
2．55－aza－dC作用结果图3所示，卵巢癌细胞株SKOV3和3AO中均检测到RASSF2A基因甲基化，经去甲基化药物5－aza－dC作用后，SKOV3细胞由完全甲基化转变为非甲基化，而3AO细胞甲基化状态被部分逆转。SKOV3和3AO中RASSF2AmRNA表达水平较低，经药物干预后，SKOV3（t＝－5．258，P＝0．006）和3AO细胞株（t＝－3．060，P＝0．038）RASSF2AmRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义。
3讨论
近年来，随着肿瘤分子生物学及表观遗传学的发展，肿瘤抑制基因失活在癌症发生发展中的作用越来越受到人们的重视。总的来说，其机制可概括为遗传学机制及表观遗传学机制，换言之，肿瘤抑制基因功能的失活既可以是不可逆的，即遗传学机制，如基因的突变或染色体的缺失，也可以是可逆的，即表观遗传学机制，如基因甲基化或组蛋白修饰。与遗传学不同，表观遗传学主要研究内容不涉及DNA序列的改变，且在细胞分裂过程中具有可遗传的、可逆性的基因组修饰作用［5］。DNA甲基化是哺乳动物基因组中最普遍的表观遗传学事件。相对于Knudson’s的二次打击学说，基因甲基化仅靠一次打击就可导致基因失活，肿瘤易感性增加［6］。RASSF2是新近发现的RASSF家族成员之一，生物信息学分析显示，RASSF2与其他成员一样，也含有RAS相关域［7］。RASSF2位于人类常染色体20p13，有329个氨基酸的开放阅读框，11个外显子。根据不同的启动子和外显子选择剪接，可形成RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C3个不同的转录本，其中，RASSF2A是最长的转录本，也是唯一一个含有5′CpG岛的转录本。RASSF2A在卵巢癌组织中发挥抑癌基因的作用，如抑制细胞生长，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡等，是一个肿瘤抑制基因。本研究分析了RASSF2A基因在上皮性卵巢癌组织中的转录表达及其甲基化水平。RT－PC检测结果显示，RASSF2A基因表达水平在良性卵巢肿瘤、交界性肿瘤及卵巢癌组织中依次降低，提示RASSF2A的转录失活，可能参与了卵巢癌的恶性演进过程，RASSF2A在上皮性卵巢癌中也起到抑癌基因的作用。张娴等［8］研究结果显示，RASSF2A基因甲基化可能参与了宫颈癌的发生，与宫颈癌的恶性进展密切相关。本研究结果显示，良性卵巢肿瘤组织中未发生RASSF2A启动子区甲基化，而基因异常甲基化从交界性肿瘤到癌呈逐渐上升的趋势，RASSF2A基因甲基化从无到有，从少到多的现象，说明了RASSF2A基因启动子区甲基化从卵巢上皮增殖阶段就开始起作用，与卵巢癌发生密切相关。多项研究表明，RASSF2A启动子区高甲基化与基因表达沉默有关［9－11］。本研究结果表明，在发生RASSF2A甲基化的组织中，其基因表达水平明显下降，两者呈负相关。结果提示，在卵巢癌中RASSF2A启动子甲基化是导致其低表达或者表达缺失的重要原因，这在细胞试验中也得到验证。应用甲基转移酶抑制剂5－aza－dC对卵巢癌细胞株进行去甲基化处理后，卵巢癌细胞株的基因启动子甲基化被逆转，而其mR－NA的表达水平明显升高，从而进一步证实了RASSF2A启动子CpG岛的异常甲基化在调节RASSF2A基因的表达中发挥重要作用。研究显示，RASSF2A基因甲基化程度与宫颈癌、胃癌的淋巴结转移有关［8，12］，而与胰腺癌和结直肠癌［9，13］患者临床病理特征无关。另有研究表明，基因启动子甲基化水平与癌症患者年龄密切相关［14］。在子宫内膜癌的研究中显示，＞45岁的患者更容易发生RASSF2A甲基化（P＝0．041）［15］。在结肠癌和口腔鳞癌中也发现，RASSF2A基因甲基化程度与年龄相关［13，16］。在生物个体发育过程中，伴随着时间的进程，DNA甲基化异常会不断呈现，由此认为，表观遗传学疾病是一种与年龄相关性疾病。这在某种程度上解释了为什么肿瘤多发生在老年人。检测DNA甲基化程度可作为细胞衰老的标志之一。本研究结果显示，RASSF2A基因甲基化水平与卵巢癌患者的临床病理参数之间无明显的相关性，是上皮性卵巢癌中的早期频发事件，随着患者年龄的增加，RASSF2A基因甲基化有增高的趋势，但差异无统计学意义，可能上皮性卵巢癌中RASSF2A基因甲基化不是年龄相关的表观遗传学改变。
综上所述，RASSF2A启动子区的高甲基化是卵巢癌发生和发展过程中的频发事件，是导致卵巢癌中RASSF2A低表达或表达缺失的重要原因，其参与了卵巢癌的发病过程，并在卵巢癌的发生和发展中发挥着重要作用。监测RASSF2A基因启动子CpG岛甲基化水平可作为表观遗传学的分子靶标，指导卵巢癌的诊断及其预后判定。
参考文献
［1］SiegelR，NaishadhamD，JemalA．Cancerstatistics［J］．CACancerJClin，2012，62（1）：10－29．
［2］ShiH，LiY，WangX，etal．AssociationbetweenRASSF1Apro－motermethylationandovariancancer：ameta－analysis［J］．PLoSOne，2013，8（10）：e76787．
［3］李其荣，刘培淑，冯进波．卵巢肿瘤组织和血清中RASSF1A基因甲基化检测及临床意义的研究［J］．中华肿瘤防治杂志，2008，15（5）：374－377．
［4］FuLJ，ZhangSL．ExpressionofRASSF1Ainepithelialovariancancers［J］．EurRevMedPharmacolSci，2015，19（5）：813－817．
［5］MannJR．Epigeneticsandmemigenetics［J］．CellMolLifeSci，2014，71（7）：1117－1122．
［6］JoungJG，KimD，KimKH，etal．Extractingcoordinatedpat－terntsofdnamethylationandgeneexpressioninovariancancer［J］．JAmMedInformAssoc，2013，20（4）：637－642．
［7］AkinoK，ToyotaM，SuzukiH，etal．TheRaseffectorRASSF2isanoveltumor－suppressorgeneinhumancolorectalcancer［J］．Gastroenterology，2005，129（1）：156－169．
［8］张娴，张友忠．宫颈癌RASSF2A基因启动子甲基化与其临床病理特征的关系［J］．现代妇产科进展，2014，23（7）：524－526．
［9］ZhaoL，CuiQ，LuZ，etal．AberrantmethylationofRASSF2Ainhumanpancreaticductaladenocarcinomaanditsrelationtoclini－copathologicfeatures［J］．Pancreas，2012，41（2）：206－211．
［10］Guerrero－SetasD，Perez－JanicesN，Blanco－FernandezL，etal．RASSF2Ahypermethylationispresentandrelatedtoshortersurvivalinsquamouscervicalancer［J］．ModPathol，2013，26（8）：1111－1122．
［11］任芳，波．RASSF2基因甲基化与卵巢透明细胞癌的相关性［J］．中国医科大学学报，2014，43（11）：969－972．
［12］MaruyumaR，AkinoK，toyataM，etal．CytopalsmicRASSF2Aisaproapoptoticmediatorwhoseexpressionisepigeneticallysi－lencedingastriccancer［J］．Carcinogenesis，2008，29（7）：1312－1318．
［13］ParkHW，KangHC，KimIJ，etal．Correlationbetweenhyperm－ethylationoftheRASSF2ApromoterandK－ras／BRAFmuta－tionsinmicrosatellite－stablecolorectalcancers［J］．IntJCancer，2007，120（1）：7－12．
［14］HorvathS．DNAmethylationageofhumantissuesandcelltypes［J］．GenomeBiol，2013，14（10）：R115．
［15］LiaoX，SiuMK，ChanKY，etal．HypermethylationofRASef－fectorrelatedgenesandDNAmethyltransferase1expressioninendometrialcarciongenesis［J］．IntJCancer，2008，123（2）：296－302．
表观遗传学现象范文第5篇
关键词 核转染仪 肝素酶基因 肝癌细胞
RNA干扰（RNA interferance，RNAi）是近些年在分子生物学中迅速发展起来的一项新技术，是基因功能研究最常用手段之一[1]；它包括转录水平（Transcriptional gene silencing ，TGS）和转录后水平（post-transcriptional gene silencing， PTGS）2种基因沉默方式[2]。通常所说的RNAi指的是PTGS，通过基因编码区设计的小分子RNA（siRNA）能与对应的mRNA靶序列特异结合，并使靶序列降解，从而使基因沉默[1]。由于基因上游转录水平持续活跃，不停地产生大量mRNA，要使基因持久沉默，就得不停地给予外源性siRNA。因此，PTGS的干扰效率不高。研究发现植物细胞存在高效率的TGS现象，即在DNA水平上通过基因5’端启动子区域DNA甲基化或组蛋白去乙酰化形式使基因永久沉默；这种现象被称为siRNA指导下的DNA甲基化（siRNA-direct DNA methylation）或组蛋白修饰[3，4]。2004年Kawasaki 等[5]首次发现在人细胞也存在TGS现象。理论上讲，一次给予针对基因5’端启动子的siRNA，就可使该基因由于表观遗传修饰而保持持久沉默[6～8]。因此，TGS相对于PTGS的研究更具有经济性和临床应用前景[9]。肝素酶基因（heparanase gene，HPA）位于人染色体4q 21.3，其5’端启动子区域含有CpG岛，表明基因的表达受甲基化等表观遗传学机制调控[10]；HPA在肝癌、乳腺癌、大肠癌、肺癌和淋巴瘤等多种肿瘤中都有高水平的表达[11～13]，主要参与肿瘤转移和侵袭。然而，TGS的沉默对象是位于细胞核中的非编码DNA调控序列，siRNA必须进入细胞核内才能发挥作用。近年由于核转染技术发展，尤其是德国AMAXA公司研发的NucleofectorTM专利创新技术，它采用电穿孔技术与细胞类型特异的核转染溶液结合方法，直接将DNA序列转入细胞核内，即使是常规转染无法转染的原代培养细胞和不分裂细胞也可成功转染，其转染率可高达70%以上，速度快，转染2h后就能发挥作用，操作简单方便[14，15]。但目前尚未见该技术用于TGS研究，既往TGS研究采用常规脂质体转染技术。本研究采用HPA基因为模型，比较核转染仪辅助转染技术和常规脂质体转染技术在肝素酶基因沉默效果和沉默维持时间上的差别。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM培养基、胎牛血清、含100 U/mL青霉素、100 U/InL链霉素的青链霉素混合液均购自Gibco公司，SMMC-7721细胞（中科院上海细胞所），NucleofectorTM电转试剂盒（德国Amaxa公司），德国Amaxa公司单孔核电转仪，型号2b（北京达科维生物公司提供），Trizol试剂（invitrogen公司），逆转录试剂盒（fermentas公司），2×Taqmix（ABI公司），兔抗人肝素酶多克隆抗体、HPR标记羊抗兔抗体（Santa公司），PVDF膜（ Santa 公司），发光试剂盒，Transwell小室（BD公司）；Lipofetmiane 2000试剂盒（美国Invitrogen）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 从液氮中取出SMMC-7721细胞，42℃热水迅速复苏，用高糖DMEM加10%的血清和1%的青链霉素混合液，放入37℃、5%CO2、常规湿度培养箱中培养。
1.2.2 干扰片段设计 针对肝素酶基因启动子区，分别设计多个干扰片段（siRNA），在预实验中筛选出干扰效果较理想的siRNA；TGS的 siRNA为：GAGGAAGUGCUAGAGACUCU；同时对HPA基因编码区设计RNAi片段：CCUUAAGAAGGCUGAUAUU（图1），整个设计合成由美国BIOO公司协助完成，设计完成后的siRNA经过DNAMAN软件与原基因组BLAST以后，与肝素酶基因的启动区完全匹配。
1.2.3 基因转染 实验分为3个组，核转染仪组，脂质体转染组及对照组（不含siRNA）。在转染前1 天，将对数生长期的SMMC-7721细胞按l×106个铺于10cm培养皿中，细胞生长至90%融合时进行转染，方法按照Amaxa电转染试剂盒产品说明书进行，即选择多个参数进行预实验，优化好转染参数，将培养在对数生长期的106个肝癌细胞与siRNA混合，加入转染液，重悬细胞，放入转染杯，在电转染仪中进行转染，将转染后的细胞放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养。脂质体常规转染采用Lipofetmiane 2000试剂盒，具体操作按说明书进行。
1.2.4 RT-PCR 分别收集转染后48h、72h和96h的细胞，trziol一步法分别提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒将其逆转为cDNA后，PCR检测各组细胞肝素酶基因表达情况。HPA基因上游引物：ATGTGGAGGAGAAGTTACGG，下游引物：TGAGTTGGACAGATTTGGAA；PCR条件为94℃/ 3min； 94℃ /30s；55℃/ 30s；72℃ /45s，共32个循环，最后72℃ 延伸10min。
图1 HPA基因启动子siRNA设计示意图
1.2.5 实时半定量RT-PCR HPA基因上游引物：GTGGTGATGAGGCAAGTATTC，下游引物：GTGGTGATGAGGCAAGTATTC。采用EverGreen I PCR试剂盒（Biotech）进行实时荧光半定量PCR反应，操作按说明进行，一管中不加模板用作阴性对照。反应液混匀后，置于SLAN荧光定量PCR仪中。设立程序：95℃ /5min预变性后，94℃/30s， 60℃退火45s，72℃延伸45s， 循环40次，最后72℃充分延伸10min。PCR反应结束后从55℃到95℃按每级0.5℃递增作出溶解曲线，分析每个PCR反应的溶解曲线以确保PCR扩增产物的特异性。每个反应重复3次。内参β-actin作一相对标准曲线，根据内参和目的基因的Ct值计算该基因相对表达量。
1.2.6 Western blot检测 将转染后48h，72h和96h的细胞裂解，收集蛋白质，Bradford法测定含量。蛋白变性后每孔上样70μg，经10%SDS一聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白后转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶封闭1h。用5%脱脂牛奶稀释一抗（β-actin以1：2000稀释，兔抗肝素酶抗体以1：500比例稀释）4℃摇床孵育过夜，PBST洗膜3×10 min，加入相应的二抗（PBST1：1000稀释）室温温育1 h，PBST洗膜3×10 min，化学发光试剂检测蛋白质印迹，X线暗室曝光成像。
2 结果
2.1 实时半定量RT-PCR定量检测核转染仪和脂质体转染技术对基因沉默效果
定量检测结果示：在转染48h后，2种方法对HPA基因mRNA表达几乎达到100%的抑制；72h后，脂质体转染组HPA基因表达有所恢复，而核转染组仍保持100%的抑制；在转染96h后，2组HPA基因均恢复表达，表达相对量接近对照组的一半。（图2）
2.2 Western杂交检测核转染组和脂质体转染组对HPA基因沉默效果
western 杂交结果显示，转染后48h，2组干扰细胞的HPA基因蛋白表达完全沉默；72h后，脂质体组HPA基因蛋白再次表达，而核转染组HPA仍保持沉默；96h后，2组细胞的HPA蛋白恢复表达（图3）。
图2 实时定量RT-PCR检测核转染组和脂质体转染组转染48h、72h、96h后HPA表达情况
图3 western blot 检测核转染组和脂质体转染组分别在转染后48h、72h、96h后，HPA表达情况
3 讨论
恶性肿瘤细胞的浸润、转移一直是肿瘤临床治疗关键和难点，而肝素酶基因被证明在肿瘤的侵润转移中起着重要作用[12]。随着肿瘤发展分子机制阐明，肿瘤的基因治疗成为目前研究重点之一；近年用RNAi技术在多种不同肿瘤细胞中成功干扰多种靶基因表达，抑制肿瘤细胞生长，已成为目前肿瘤治疗研究热点[1]。这些基因除肿瘤基因，还包括抗凋亡分子、端粒酶、生长因子受体、某些信号分子等基因。应用RNAi 技术，还可探索各种基因功能及相互作用，为筛选新的药物靶基因提供便利。已有实验证明，通过RNAi沉默肝素酶基因，可以阻止部分肿瘤的侵袭和转移[16]。
传统的靶向肿瘤基因RNAi治疗是建立在转录后水平上，其缺点是：基因的启动子活跃，靶基因能被持续转录，要想使基因长期沉默，需要不间断地给予siRNA。而目前由于用于人类肿瘤基因治疗载体存在许多问题，建立长期稳定的特异性在瘤细胞内表达的治疗基因载体并用于临床治疗尚不成熟。用于临床上实验性治疗药物多为体外合成并经化学修饰的寡核苷酸，不仅价格昂贵，半衰期短，且有一定细胞毒性；要使靶基因沉默，需长期给药，不仅疗效受到影响，毒性很大，也不经济。而转录水平的RNAi不仅诱导基因调控序列同源靶序列被降解，还可以诱导异染色质形成，DNA甲基化，组蛋白修饰等表观遗传学改变，使基因不能转录；理论上讲，一次给予针对5’端启动子的siRNA就可使该基因永久沉默，因此对于转录水平的RNA干扰，有着更广泛地应用前景[9]。要实现TGS， 必须要将siRNA有效转入细胞核内，本项研究是通过核转染仪将设计在肝素酶5’端的siRNA转入肝癌细胞，以证实转录水平干扰的优越性。
研究首先针对细胞核内的启动子区，设计siRNA靶点，同时对胞浆内的mRNA区设计相应siRNA靶点，通过PCR初步检测发现，2组细胞在干扰发生48h后，基因同时都被沉默；72h时，脂质体转染组细胞基因沉默效果明显下降，而核转染组细胞基因沉默效果仍然很明显，96h时，2组细胞的肝素酶基因再次同时表达出来，RT-PCR证实这个结果。从Western blot实验也进一步证明，核转染技术的转录水平沉默肝素酶基因比脂质体的转录水平沉默肝素酶基因细胞，肝素酶的沉默时间维持更长些；但是96h的时候，2组肝素酶蛋白又再次表达。相对于脂质体的转录后基因沉默，核转染转录水平的基因沉默维持时间相对更持久，但并未达到先前预期的基因永久沉默目的。
尽管本次实验从基因水平和蛋白水平都无法证实，TGS对基因有着永久沉默作用；但是相比于PTGS，TGS对基因沉默维持时间显然有所延长。上述结果与理论上转录水平干扰能持久沉默基因的推测仍然有较大差距，其原因可能有：（1）细胞核转染的效率；电转染只有一少部分siRNA被转染进核中，多数siRNA还是留在胞浆内被降解，可能会造成实验结果不理想。在实验中，用普通的脂质体转染HPA调控区siRNA，TGS几乎无任何基因沉默作用，而转染编码区siRNA， PTGS却有明显基因沉默效应（结果未公布），说明TGS必须用有效的核转染技术。（2）不同细胞或基因对TGS的效果不同。可能不同细胞或基因表达调控受多种机制影响，表观遗传学因素只是其中一种。（3）表观遗传学控制基因的表达是可逆的。
虽然如此，本实验为TGS在肿瘤基因治疗中的研究提供实验基础，至于TGS的作用机制，以及是否针对CpG岛或转录因子结合位点的RNAi更有效，一次RNAi导致的表遗传学改变能维持多长时间（细胞能传多少代），是否含有CpG岛的基因更适合针对启动子的RNAi等等，则需要更多实验加以论证。
参考文献
[1] Davidson BL， McCray PB Jr. Current prospects for RNA interference-based thereapies. Nat Rev Genet 2011，12（5）：329-340.
[2] Verdel A， Vavasseur A， Le Gorrec M， et al. Common themes in siRNA-mediated epigenetic silencing pathway. Int J Dev Biol 2009，53（2-3）：245-257.
[3] MOrris KV， et al. Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells. Science 2004，305（5688）：1289-1292.
[4] Kurth HM， Mochizuki K. Non-coding RNA： a bridge between small RNA and DNA. RNA Biol 2009，6（2）：138-140.
[5] Kawasaki H， et al. Induction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cells. Nature； 2004，431（7005）：211-217.
[6] Weinberg MS， et al. The antisense strand of small interfering RNAs directs histone methylation and transcriptional gene silencing in human cells. RNA 2006，12（2）：256-262.
[7] Swanten C， et al. RNA interference， DNA methylation， and gene silencing： a bright future for cancer therapy？ Lancet Oncology 2004，5：653-654.
[8] Castanotto D， et al. Short RNA-directed cytosine （CpG） methylation of RASSF1A gene promoter in HeLa cell. Mol Ther 2005，12（1）：179-183.
[9] Morris KV. RNA-mediated transcriptional gene silencing in human cells. Curr TOP Microbiol Immunol 2008，320：211-224.
[10] Jiang P， et al. Cloning and characterization of the humanheparanase-1（HPR1） gene promoter. J Biological Chemistry 2002，277（11）：8989-8998.
[11] Zcharia E ， Metzgers ， Chajek- shaul T ， et al . Molecular properties and involvement of heparanase in cancer progression and mammary gland morphogenesis. J . Mammary Gland Biol Neoplasia ， 2001，6 （3） ：311-322.
[12] Friedmann Y， Vlodavsky I ， Aingorn H ， et al . Expression of heparanase in normal ， dysplastic and neoplastic human colon mucosa and stroma. Evidence for its role in colonic tumorigenesis. J . Am J pathol ， 2000，157（4） ：1167-1175.
[13] El2Assal ON ， Yamanoi A ， Ono T ， et al . The clinicpathological significance of heparanase and expressions in heptatocellulor carcinoma J . Clincancer Res ， 2001 ，7 （5） ：1299-1305.
[14] Doherty JE， Huye LE， Yusa K， et al. Hyperactive piggyBac Gene Transfer in Human Cells and In Vivo. Hum Gene Ther 2012，23（3）：311-320.
表观遗传学现象范文第6篇
1中枢神经系统免疫相关研究
对孤独症患儿发育过程的研究发现，ASD患者头围比同龄健康儿明显增大，以大脑额叶的灰质和白质增大为特点［1］，这表明ASD患者神经发育异常，而大部分的研究结果主要集中在免疫系统的激活上，最近的一项研究报告称，母体免疫激活(MRI)可诱导未成年后代大脑的表观遗传改变，妊娠期急性损害对大脑和行为可能造成持续的不利影响［2］。母体免疫激活很可能影响多个脑区，导致大脑整体网络失衡。有研究发现，人类和老鼠的前额叶皮层主要支配社会行为，与ASD的发生有关［3］。这表明早期炎症反应可能是ASD病因的普遍因素。研究发现，早产儿患孤独症的风险比足月儿高大约4倍，也更容易受到感染，同时其血脑屏障发育滞后，使暴露于潜在神经毒素的可能性增加。部分ASD患者在围产期通过感染、压力、环境或过敏引发肥大细胞激活，导致其释放促炎因子和神经毒素分子，从而导致神经系统炎症和孤独症发病。目前，针对孤独症患者体内小神经胶质细胞的研究成为ASD免疫标志的一个新方向。小神经胶质细胞被看作中枢神经系统的巨噬细胞，在各种不同病理状态中起重要作用。研究人员开始研究小神经胶质细胞在ASD患者体内的作用，该细胞可直接与神经元相互作用，维持适当的兴奋与抑制平衡，打破这种平衡会导致神经功能和行为终身改变［4］，这可能与日后神经组织障碍有关。Morgan等［5］证明，在孤独症患者大脑背外侧前额叶皮层有一些与特异性神经元反应有关的小神经胶质细胞被激活。另有研究表明［6］，在孤独症患者小脑的颗粒细胞层和白质中，星型胶质细胞聚集和小胶质细胞激活，以及不同年龄段孤独症患者大脑不同区域的细胞因子表达增加，ASD患者脑脊液中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ均显著增加，并且在这些大脑区域和脑脊液中其他免疫反应相关的基因也表达增多，说明ASD患者的脑中促炎途径被激活。这些炎症因子是由循环中的免疫细胞和巨噬细胞产生的，并能影响神经功能和行为。因此异常的炎症过程可能是ASD一个持续的病因，在病人的整个生命周期中影响其行为及症状。除此以外，大脑神经元形态受损也会引起神经疾病。有研究表明，Sarm1可调节神经元形态发生［7］，由Sarm1调节的炎性细胞因子IL-1和TNF-α可以调节突触可塑性［8］。并且人类Sarm1基因位于17q11号染色体上，处于孤独症易感位点6范围内;另外，孤独症患者大脑皮层中Sarm1蛋白质含量减少［9］;对Sarm1敲除老鼠的行为分析也显示智力障碍、社会行为受损、认知缺乏灵活性等特点［10］。这些行为缺陷与孤独症患者的特征相似。因此，Sarm1被认为可能与神经发育障碍有关。
2自身免疫相关研究
虽然孤独症的病因尚不可知，但许多研究均证明，ASD和自身免疫性疾病家族史有一定联系［11］。流行病学研究证实，在有自身免疫性疾病家族史的儿童中，大约40%患有孤独症，特别与自身免疫性甲状腺炎或甲状腺功能减退、风湿热、风湿性关节炎、乳糜泄、溃疡性结肠炎、银屑病、家族性Ⅰ型糖尿病有密切相关。这些研究结果支持ASD中存在自身免疫成分的可能性。免疫遗传学为在基因水平上研究ASD和免疫系统之间的关系提供了一个方向。Geschwind等［12］的研究发现ASD的病因中约10%～20%源于遗传因素。但是，大多数的孤独症没有特异基因，即使是最常见的遗传形式在病例中也不超过1%～2%。更具体地说，免疫遗传学领域的研究主要集中在HLA相关性上。在这种背景下，研究指出经典MHCⅠ类、Ⅱ类和Ⅲ类等位基因和ASD存在一定关系。早期的研究发现，孤独症儿童父母表达的HLA抗原量大大超过对照组。最近，Torres等［13］发现在孤独症患者体内某些HLA-A2等位基因表达增加。在上述研究中除了MHCⅠ类基因外，MHCII基因也与ASD有关。更具体地说，HLA-DRB1*04(被认为是类风湿性关节炎的主要易感基因)和ASD之间关系更密切。此外，表达在第三高变区(HVR-3)的其他Ⅱ类等位基因也被发现与孤独症有关。还有一些孤独症儿童高表达HLA-A2和DR11等位基因。一些研究甚至表明，有些MHCII类基因可能有保护作用［13］。最新meta分析显示，孤独症与类风湿性关节炎表达相同的保护性HLAⅡ类等位基因，即HLA-DRB1*13［14］。就MHCⅢ类基因而言，补体C4的等位基因与ASD有关。最近的研究表明，转录的表观遗传调控紊乱在自身免疫性疾病中扮演着至关重要的角色［15］。研究证明Rett综合征、脆性X染色体和其他遗传综合征常伴发ASD，这与表观遗传修饰有关，这些研究表明，表观遗传机制与孤独症的病因可能存在一定关系。更具体地说，甲基CpG结合蛋白2(MECP2)基因突变与孤独症的关系最密切。ASD患者体内的各种炎性细胞因子和免疫标记也反映出其免疫功能紊乱。对ASD患者抗体的大量研究表明，抗体与疾病的临床严重程度相关。各种研究表明在ASD患儿体内各种不同的免疫介质，包括血清抗体、大脑抗体、血清细胞因子、趋化因子、NK细胞和黏附分子都发生了显著变化。虽然这些研究严谨性不高，但是，作为一个整体看，这些结果似乎表明免疫介质变化与ASD的关联，当然这需要进一步的正确研究来证实。更具体地说，ASD患儿IgG、IgM减少，可能表明免疫功能紊乱。同样，促炎因子IL-6、IL-12和IFN-γ增加和抗炎因子IL-10和TGF-β1减少表明在ASD中可能存在超免疫状态。趋化因子在免疫系统中发挥着重要的作用，ASD患儿MCP-1、T细胞激活性低分泌因子(RAN-TES)、嗜酸性粒细胞趋化因子增多，这与患儿行为障碍有关，这种关联表明了一个异常的免疫状态可能与孤独症行为改变有关。此外，研究已表明ASD患儿的免疫异常，在ASD患儿中发现自身免疫相关的现象，比如单核细胞、NK细胞过度活化，T细胞反应增强，调节性T细胞功能抑制等［16］。虽然还没有研究证明ASD和特定的自身免疫性疾病之间特定的联系，但这些发现表明，免疫应答的异常调节或免疫功能障碍与ASD有密切的关系。
3ASD与孕产妇自身抗体的关联
有越来越多的证据表明［17］，母体免疫反应可能在孤独症的病因中发挥作用。1964年风疹大流行后，被病毒感染的母亲生出的孩子有8%～13%的儿童出现孤独症症状。另有研究［18］发现，在怀孕前三个月孕妇病毒感染和孤独症风险增加有密切相关。此外，感染各种微生物，包括流感、巨细胞病毒、水痘、麻疹都会使患ASD的风险增加。因此有人认为，ASD不是特定病原体引起的，而是与一个更广义的母体免疫系统激活有关［19］。并且孕产妇血清和羊水的炎症标记物C-反应蛋白水平升高与后代的ASD有关［20］。在动物模型中，母体免疫激活的后代表现出孤独症的症状，如在老鼠模型中，母体免疫激活的后代表现出超声波发声的数量和质量减少或下降，嗅觉交流改变，社会互动障碍，不断为自己梳理毛发和其他ASD相关行为异常［21］。类似的损害在母体免疫激活的猴子模型中再次出现。给怀孕的老鼠或猴子体内注入微生物抗原，如细胞壁成分脂多糖(LPS)或病毒成分，比如poly(I:C)，结果导致其后代出现孤独症样行为功能失调［22］。总之，这几个大型的流行病学研究和动物模型均指出母体免疫激活在孤独症的病因中起重要作用。最近有研究显示，一些产妇自身抗体IgG与胎儿脑组织反应，可能会影响胎儿的神经发育，如孕产妇患重症肌无力，就导致暂时的新生儿重症肌无力［23，24］，有时也会出现致命的先天性多关节挛缩症。尽管这样的情况相对少见，但是自身免疫性IgG会影响胎儿重要的发育过程，从而导致永久性的缺陷。例如，在某些情况下，新生儿红斑狼疮，典型的母体抗体引起，该抗体可结合核糖体蛋白，阻止发育过程中胎儿正常心脏的形成［25］。胎儿的血脑屏障发育还不完善，进入胎儿体内的IgG可以在其完全形成之前进入发育中的大脑。在系统性红斑狼疮妊娠小鼠模型抗体转移的研究中，特异性沉积的母体抗N-甲基-D-天门冬氨酸IgG在发育中的新皮层的浓度高于母体大脑的60到70倍。胎儿血脑屏障的发育时机很复杂，其排斥特性主要是血管周围的星形胶质细胞对Wnt/β-Catenin信号的反应。众多相关信号分子参与这种级联反应，其中涉及孤独症易感因素的一些基因变异，其中一个Engrailed2基因，它的功能是调节从母体循环穿过胎盘的外源性因素的灵敏性。这种遗传易感性可能是母体抗体参与ASD症发展机制的基础。最后，孕产妇自身抗体生产的根本原因是什么目前还不十分清楚。在许多自身免疫相关的神经障碍中，自身抗体是在应对微生物感染的应答中产生的，从这个意义上说，可以认为孕产妇自身抗体生产和某些情况下感染的孕产妇产生抗体存在相似机制。孤独症家族的自身免疫性疾病或过敏性疾病的发病率比正常人高，尤其是母亲，这也表明母体免疫状态和后代ASD发病风险增加之间有一定联系。此外，母体免疫激活长期影响产前及产后免疫力，包括降低胎儿的免疫耐受。免疫耐受缺陷，可能是促进自身反应性抗体生产的基础。而维持自我耐受与MET受体酪氨酸激酶及其相关的信号级联反应有关，研究发现孤独症相关MET-c等位基因会导致免疫失调和自身抗体生产［26］。同时MET多态性已经在几个独立基因研究中发现与ASD相关［27］，并且该多态性与在孤独症儿童母亲体内发现的孕产妇抗胎儿大脑抗体有显著相关性。因此，总体来说，母体免疫激活和孕产妇自身抗体生产表示免疫相关易感性因素与ASD的风险增加有关。
4总结与展望
表观遗传学现象范文第7篇
关键词:表观遗传;序列依赖性;转录起始位点(TSS);核小体定位
中图分类号:Q344+.1文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)10-2233-05
Advances on Nucleosome Mapping Around TSS
WANG Cheng-ai
(School of Mathematics,Physics and Biological Engineering,Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou 014010,Inner Mongolia,China)
Abstract: Nucleosome mapping,an important epigenetic factor participating in regulating eukaryotic gene expression, deeply affects lots of biological processes,including gene transcription,DNA replication,DNA repair and so forth. The nucleosome mapping around TSS and TFBS has been reported properties of nucleosome mapping were introduced in this paper. Features in nucleosome mapping around TSS were summarized. Advances on nucleosome mapping around TSS from both the DNA sequence-dependent factor and some epigenetic factors including DNA methylation, variants and modification of histone,chromation remodeling,alternative splicing were reviewed.
Key words:epigenetic; DNA sequence-dependent; TSS; nucleosome mapping
核小体是真核生物中染色质的基本组成单位,而核小体定位是目前生命科学,特别是表观遗传学研究领域的一个热点问题｡核小体是由核心DNA约147 bp,缠绕在组蛋白八聚体周围约1.65圈而成,串联并进一步折叠成为染色质纤维[1]｡研究发现,真核生物基因组DNA有3/4以上被核小体所占据｡可以这样说,核小体定位是指核小体在基因组上的位置,通过控制蛋白结合位点等因素参与基因转录调控过程｡一些顺式作用元件比如Poly A序列､GC含量和序列模体等,是影响低等真核生物中核小体定位的主要因素,而高等生物核小体多数服从统计定位[2]｡核小体定位受到DNA序列因素的影响,但很多研究表明表观遗传因素对核小体定位同样起着重要的作用｡很多研究报道转录起始位点(TSS)序列外显子处核小体占据率高于内含子,DNA转录位点基因间区､启动子､5′NFR等处核小体分布较少｡鉴于此,有研究认为AA/TT/TA是核小体定位密码[3],邻近核小体､染色质高级结构也影响核小体定位｡一些表观遗传因素引起的DNA结构多样性,也同样影响核小体定位[4]｡然而,多种因素导致的基因功能位点附近核小体的有无或者位置的不同均会影响基因表达调控｡
1转录起始位点核小体定位研究概况
核小体定位是一种重要的表观遗传因素,影响基因表达调控;而对于转录起始位点附近的核小体定位特征研究的也比较多｡目前,研究人员做了关于人类以及酵母基因组的数据分析,发现核小体定位有重要的偏好性序列特征,TSS处核小体定位参与基因的转录调节,也与一些非组蛋白因子的影响有关｡Li等[5]通过研究小鼠肝脏的核小体定位图谱,发现DNA上核小体的定位能够调节基因转录水平｡
1.1转录起始位点核小体定位的特征
TSS附近核小体定位具有重要的序列特征｡Arya等[6]报道了缺乏和含有TATA盒的两种启动子核小体定位不同｡后者位于离TSS上游25~125 bp处,核小体缺失区域不明显,这种启动子可能被核小体完全占据,或者促进TSS下游核小体占据｡TSS和一些转录激活结合位点常被覆盖｡酵母核小体缺失区域(NDR)两侧有2个强烈定位的核小体,+1核小体边缘通常跨过TSS,可能参与调控转录的进行｡据统计,TSS上游基因间区核小体占据水平高于下游｡
TSS处核小体定位参与基因的转录调节过程｡刘宏德等[7]利用弯曲度谱法发现,核小体在编码基因区域和miRNA基因启动子区域定位有差异｡在TSS上游-200~-400 bp和-400~-600 bp处以及TSS下游约200 bp处核小体定位信号较强,在上游0~ -400 bp内存在核小体缺失区域,在这里转录因子结合位点分布较多,这可能与转录起始有关,有利于基因的转录,总之,除了序列因素,包括转录因子或者重塑酶,转录中的RNA聚合酶,核小体“统计定位”[8],Bdf1､SWR1复合物[9],和复制､转录等一些生物学过程与核小体定位也有密切关系｡其中,DNA偏好性序列的生物物理性质对核小体定位起主要作用｡
1.2转录起始位点核小体定位与基因表达调控
基因转录水平与核小体缺乏程度有关[10]｡不仅如此,Ercan等[11]发现酵母基因组核小体密度与基因的转录效率之间呈负相关,转录因子与核小体相互作用能够取代核小体,而核小体又会占据转录因子结合位点｡在TSS附近,核小体稀疏区域促成转录因子与靶位点结合而发挥作用｡然而,并非某一种因素单独影响TSS附近核小体定位,受到多种因素的共同作用｡可以通过染色质结构的改变,暴露出转录因子结合位点,影响基因的转录机制｡刘辉等[12]分析了人类CD4+T 细胞甲基化组蛋白ChIP-seq数据,发现甲基化修饰之后的核小体大多分布在基因启动子处､TFBS区域｡有意思的是,核小体定位还能够影响TSS处核苷酸多态性位点(SNPs)的分布,从而影响转录因子的结合[12-14],在TSS下游,核小体的规则分布与多态性位点的周期性具有一致性[14],SNPs多位于核心DNA的两端,而插入､插入删除等多态性位点核小体缺乏｡Deniz等[15]统计分析了酵母的核小体定位数据集,发现核小体在启动子区域内呈现周期性分布,周期性强度与基因转录水平呈负相关,与前面论述的观点保持一致｡可能是组蛋白占据TFBS,通过负调控抑制基因转录｡
2转录起始位点核小体定位与序列依赖性因素
研究一致认为,DNA序列依赖性是转录起始位点核小体定位的主要因素,不同序列对组蛋白核心亲和力不同[16],当然这主要发生在低等真核生物中｡然而,Gaffney等[17]通过研究人类12号染色体上的400多个核小体的排列,发现在大量连续重复序列中核小体定位在一些偏好性序列区域,核小体在核心DNA和连接DNA的偏好性也可通过k-mer频次法进行统计[18,19]｡而这种偏好性在一定程度上依赖于A+T和G+C含量｡G/C二核苷酸在体外偏向于形成核小体,而非体内[20]｡李慧敏等[21]分析了调控酵母核糖体蛋白基因的主要转录因子在启动子序列中的结合位点,发现A+T含量在TSS附近较高,这样便于DNA的解链和进行基因转录,A+T含量在内含子中也较高,常见的调控元件都富含碱基C和G｡充分地说明了核小体定位序列的特征｡
DNA序列有差异,核小体定位水平不同,引起基因表达调控不同｡TSS附近大多数TF位点距离很近,甚至部分重叠,与核小体存在竞争,也在一定程度上表明转录起始位点附近核小体分布较少｡启动子区域含有许多顺式作用元件,比如内含子一定程度上引起转录调控机制的差异[21];某些基因的TSS定位并预测,比如从GC偏好性等出发[22],有助于基因调控机制的探索｡然而,Dai等[23]认为核小体定位受基因组DNA序列和各种蛋白因子的共同作用｡
3转录起始位点核小体定位与表观遗传因素
既然核小体定位对于基因的转录调控､DNA复制等过程如此重要,因此,本研究较详细地总结了影响核小体定位的各种因素,除了序列因素,其他影响基因组上TSS处核小置的表观遗传因素,比如转录因子､DNA甲基化､组蛋白变体及修饰､染色质重塑､可变剪接等因素也在一定程度上影响核小体的动态定位[24],这几种表观遗传因素与TSS处核小体的形成和定位有着密切关系,已成为目前表观遗传学领域研究较为热点的问题｡
3.1TSS核小体定位与DNA甲基化
DNA甲基化是一种重要的表观遗传因素,与TSS附近核小体定位呈现特殊关系｡研究人员通过研究人类CD4+T细胞TFBS和TSS周围核小体的分布情况,发现核小体动态地在定位､缺失之间改变｡TSS上下游200 bp内核小体定位,与DNA甲基化基本上呈正相关,在TFBS处呈互补模式｡DNA甲基化越高,越有利于核小体定位｡而且核小体核心DNA比连接DNA更易被甲基化,DNA甲基化位点与核小体定位也具有一致周期性｡除此之外,DNA甲基化会受组蛋白甲基化调节[25-27]｡关于核小体DNA甲基化,大部分研究并不认为DNA甲基化直接导致基因转录沉默发生[27],这可能与核小体定位机制有关,DNA甲基化同组蛋白甲基化共同调控基因表达,两者之间关系密切｡比如组蛋白修饰H3K9甲基化能够促进DNA甲基化的进程[28,29]｡Chodavarapu等[30]发现核小体和DNA甲基转移酶关系保守,DNA甲基化酶倾向于修饰缠绕在组蛋白上的DNA,在外显子中核小体高度富集,多定位于内含子与外显子交界处｡DNA甲基化在外显子的普遍存在,除了用于界定外显子外,同时还与外显子处核小体的偏好性存在保持一致｡
3.2TSS核小体定位与组蛋白变体､修饰
H2A.Z､H3.3是组蛋白H2A的保守变体｡两者通常在TSS附近参与形成核小体[31],对H2A.Z报道居多｡Bargaje等[32]报道H2A.Z缺失会改变酿酒酵母基因组转录水平,核小体定位在沉默基因和高表达基因中不同,前者核小体覆盖TSS定位,而后者核小体则被取代｡位于TSS两侧的-1核小体和+1核小体的H2A.Z与基因表达的动态改变有关｡组蛋白变体能够影响核小体的稳定性和足迹变化,这也说明了染色体构型受组蛋白变体等的影响｡核小体的去组装和重新组装需要组蛋白分子伴侣的介导[33],以及能影响激活转录所用关键因子的参与｡Tolstorukov等[34]认为人类含H2A.Z核小体偏好性地保护一段核心DNA序列免受微球菌核酸酶降解,这同样说明H2A.Z可能会参与核小体和染色质结构的调整过程｡
然而,组蛋白变体的修饰也可影响核小体定位,进而影响基因转录活性调控｡在酵母H2A.Z的N末端多处乙酰化位点的突变,可能通过影响核小体结构,导致染色体传递受阻等｡有ChIP分析显示,H2A.Z中K14的乙酰化修饰仅出现在转录活跃基因的启动子上,在静息基因启动子区域几乎没有｡H2A.Z的部分生物学功能是由H2A.Z和染色质复合物SWR1-C协同完成[35],染色质重塑复合物能够影响H2A.Z的作用,两者共同影响H2A.Z突变体细胞表型｡
H2A.Z在基因转录起始位点附近富含,与常染色质标记H3K4me3和H3K9ac的富含相一致,H2A.Z也与基因调控元件有关[36,37]｡Zhang等[38]发现核小体可能存在于一些重要的功能区域,一些有活性的组蛋白变体H2A.Z在TSS上游占据较多,在下游不断减少｡组蛋白修饰能够控制顺式调节元件中的染色质结构｡还有观点认为,TSS附近H2A.Z是核因子Y(NF-Y)依赖性的,而且许多生物学过程中组蛋白乙酰化受核因子Y影响,可以用于甲基化与乙酰化的转换､组蛋白变体募集等[39]｡在癌细胞中存在乙酰化H2A.Z,H2A.Z水平则减少｡TSS处H2A.Z乙酰化与抑癌基因沉默水平增加保持一致,与DNA甲基化呈负相关[40]｡因此,组蛋白翻译后修饰对于转录起始位点处核小体定位水平以及基因的转录至关重要｡
3.3TSS核小体定位与染色质重塑
染色质结构及重塑复合物也与其他因素相互作用,共同影响核小体定位｡在不同启动子区域,染色质结构一般会存在差别｡许多研究认为蛋白质复合物､染色质重塑因子ISWI家族成员[41]通过与ATPases作用,来迫使核小体在DNA上滑动或者交换,还有观点认为,是DNA在核小体表面的扭曲度增加导致核小体的滑动[42,43]｡Varga-Weisz[44]认为依赖ATP的染色质重塑因子驱使核小体离开转录因子结合位点,阻止核小体进一步的结合｡染色质重塑因子可能和转录因子发生作用,影响基因的表达水平[45]｡不仅如此,滑动的核小体趋向于靠近启动子区域,反映了转录起始位点处核小体的动态定位｡启动子处核小体定位模型与转录依赖特性具有重要联系,转录调节前后存在核小体去稳定性现象[46,47]｡
转录起始位点核小体定位受染色质重塑结构的影响,然而染色质的结构和功能受DNA修饰和组蛋白修饰的影响[48]｡Zlatanova等[49]认为染色质结构是高度动态的,生物大分子的装配需要消耗ATP水解能来调节染色质结构｡染色质纤维拓扑样结构､RNA聚合酶都能造成转录延伸中核小体结构高度不稳定,使聚合酶跨越核小体障碍,有利于转录的进行｡
3.4TSS核小体定位与RNA剪接
RNA剪接事件与核小体定位也有一定关系｡陈伟等[50]从人类基因组转录起始位点上下游选取探针序列,根据目的序列碱基特征,用多样性增量二次判别方法(IDQD)构建模型,探讨了在人类基因组剪接位点(GT/AG)邻近序列中的核小体分布,发现外显子处DNA序列喜欢形成核小体,核小体较多,转录的RNA具有较强刚性,而剪接位点及其邻近的内含子处则相反｡研究认为,DNA序列的核小体定位或者核小体缺失状态与RNA的刚性/柔性具有统计相关性[50]｡Ringrose[51]也发现核小体定位和外显子―内含子边界显著相关,研究也发现特定组蛋白修饰能够调解选择性剪接｡为了更好地预测TSS处核小体定位,有研究用支持向量机(SVM)等方法结合TSS数据库预测启动子的位置[52]｡另有研究发现,存在大量因子影响核小体在DNA上的精确定位｡基因组序列中周期性的AA∶TT能够维持核小体的稳定性｡TA二聚体常存在小沟,CG常存在大沟位置[53],可变剪接与核小体定位偏好性也有关系｡针对剪接事件发生的重要性,有课题组也开展了可变剪接的相关研究工作｡
3.5TSS核小体定位与RNA聚合酶II ､CpG岛
RNA聚合酶是影响TSS处核小体定位反式因子中的重要因子｡RNA聚合酶影响核小体结构,核小体又会成为RNA聚合酶在DNA移动的转录屏障,RNA聚合酶为摆脱这一障碍,就需要逐出或者滑动核小体[54],这种现象在启动子和编码区抵抗了核小体定位的热动力学偏好性｡有研究认为,当启动子TSS附近有核小体富集时,为激活转录RNA聚合酶Ⅱ提前进入TSS周围｡然而,在核小体分布较少的TSS处,染色质结构开放能够加速结合调节蛋白,进而可以募集RNA聚合酶用以转录[54]｡RNA聚合酶Ⅱ含量在外显子中比在内含子多,核小体定位能够调节RNA聚合酶Ⅱ的持续合成｡
不仅如此,已有研究发现,另一种因素CpG岛偏好性地出现在基因的TSS处,特别是在管家基因中｡在转录起始位点周围核苷酸的周期性存在于含有CpG岛的区域,在人类和黑猩猩相同基因组区域的序列也发现了同样的现象｡在TSS附近的SNP分布呈现周期性也与CpG岛有关[55,56]｡在一些植物和真菌基因中的GC偏好性特征影响转录,这可能是由转录起始过程中基因突变或者有偏好性的转录因子结合位点造成的[57]｡Blackledge等[58]发现CpG岛可以直接提供去甲基化酶,去除甲基化现象,CpG岛与核小体定位有着重要的关系,但有待深入研究｡
4结语
本文从转录起始位点出发,较为详细地概述了国内外核小体定位领域的最新研究进展,概括了核小体定位的多种影响因素,主要从序列依赖性和表观遗传因素两方面进行了归纳和综述,旨在把握现象并发现规律｡综合大量研究发现,TSS周围核小体定位特征具有一定的规律性,受DNA序列和表观遗传因素的共同作用,转录起始位点处核小体定位较少,除了序列特征造成的影响外,DNA甲基化的分布､组蛋白变体及组蛋白修饰､染色质重塑､可变剪接､RNA聚合酶Ⅱ等因素密切相关,从而调控基因表达水平｡对其深入研究具有重要的生物学意义,对于部分疾病的预防和治疗具有重要价值｡对TSS核小体定位的各种特性进行精确的分析,能够为相关研究领域提供参考｡目前对于这方面的研究大多是基于理论预测或者模型计算结果,而针对具体的基因功能位点核小体定位特性的试验研究比较少,还需要理论设计与试验验证相结合,使得目前核小体定位的理论得到进一步完善｡
参考文献:
[1] 蔡禄,赵秀娟.核小体定位研究进展[J].生物物理学报,2009,25(6):384-395.
[2] SCHONES D E,CUI K,CUDDAPAH S,et al.Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome[J].Cell,2008,132(5):887-898.
[3] SEGAL E,FONDUFE-MITTENDORF Y,CHEN L,et al.A genomic code for nucleosome positioning[J].Nature,2006,442: 772-778.
[4] GAN Y,GUAN J,ZHOU S,et al.Structural features based genome- wide characterization and prediction of nucleosome organization[J].BMC Bioinformatics,2012,13(1):49.
[5] LI Z,SCHUG J,TUTEJA G,et al.The nucleosome map of the mammalian liver[J].Nature Structural & Molecular Biology,2011,18(6):742-746.
[6] ARYA G,MAITRA A,GRIGORYEV S A.A structural perspective on the where, how, why, and what of nucleosome positioning[J]. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics,2010, 27(6):803-820.
[7] 刘宏德,张德金,谢建明,等.miRNA基因和编码基因启动子区核小体定位分析[J].科学通报,2010,55(14):1335-1340.
[8] KORBER P.Active nucleosome positioning beyond intrinsic biophysics is revealed by in vitro reconstitution[J].Biochemical Society Transactions,2012,40(2):377-382.
[9] KOERBER R T,RHEE H S,JIANG C,et al.Interaction of transcriptional regulators with specific nucleosomes across the Saccharomyces genome[J].Molecular Cell,2009,35(6):889-902.
[10] LEIMGRUBER E,SEGUIN-ESTEVEZ Q,DUNAND-SAUTHIER I,et al.Nucleosome eviction from MHC class II promoters controls positioning of the transcription start site[J].Nucleic Acids Res,2009,37(8):2514-2528.
[11] ERCAN S,CARROZZA M J,WORKMAN J L.Global nucleosome distribution and the regulation of transcription in yeast[J].Genome Biology,2004,5:243.
[12] 刘辉,壮子恒,关佶红,等.核小体定位的转录调控功能研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2012,39(9):843-852.
[13] BAHAR B,SWEENEY T. Mapping of the transcription start site(TSS) and identification of SNPs in the bovine neuropeptide Y (NPY) gene[J].BMC Genetics,2008,9:91.
[14] 刘宏德,孙啸.人类基因组核苷酸多态性位点核小体定位分析[J].生物化学与生物物理进展,2011,38(5):427-432.
[15] DENIZ O,FLORES O,BATTISTINI F,et al.Physical properties of naked DNA influence nucleosome positioning and correlate with transcription start and termination sites in yeast[J].BMC Genomics,2011,12:489.
[16] WANG D,ULYANOV N B,ZHURKIN V B.Sequence-dependent Kink-and-Slide deformations of nucleosomal DNA facilitated by histone arginines bound in the minor groove[J].J Biomol Struct Dyn,2010,27(6):843-859.
[17] GAFFNEY D J,MCVICKER G,PAI A A,et al.Controls of nucleosome positioning in the human genome[J].PLOS Genetics,2012,8(11):1-13.
[18] XING Y,ZHAO X,CAI L.Prediction of nucleosome occupancy in Saccharomyces cerevisiae using position-correlation scoring function[J].Genomics,2011,98(5):359-366.
[19] XU F,OLSON W K.DNA architecture,deformability,and nucleosome positioning[J].Journal of Biomolecular Structure & Dynamics,2010,27(6):725-739.
[20] LOCKE G,HABERMAN D,JOHNSON S M,et al.Global remodeling of nucleosome positions in C.elegans[J].BMC Genomics,2013,14:284.
[21] 李慧敏,张静.酵母核糖体蛋白基因启动子序列的特征[J].生物物理学报,2008,24(1):57-64.
[22] BHATTACHARYYA M,FEUERBACH L,BHADRA T, et al.MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection[J].Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology,2012,11(1):1-25.
[23] DAI Z, DAI X, XIANG Q, et al.Insights into distinct regulatory modes of nucleosome positioning[J].BMC Genomics, 2009,10:602.
[24] HENIKOFF S.Nucleosome destabilization in the epigenetic regulation of gene expression[J].Nat Rev Gen, 2008, 9(1): 15-26.
[25] 刘宏德, 孙啸.核小体定位模式及其与DNA甲基化位点分布的关系[J].中国生物化学与分子生物学报, 2011, 27(3):248-253.
[26] CHATAGNON A, PERRIAUD L, NAZARET N, et al.Preferential binding of the methyl-CpG binding domain protein 2 at methylated transcriptional start site regions[J].Epigenetics, 2011,6(11):1295-1307.
[27] HAN H,CORTEZ C C,YANG X,et al.DNA methylation directly silences genes with non-CpG island promoters and establishes a nucleosome occupied promoter[J].Hum Mol Genet, 2011,20(22):4299-4310.
[28] IMAI S, KIKUCHI R, KUSUHARA H, et al.DNA methylation and histone modification profiles of mouse organic anion transporting polypeptides[J].Drug Metab Dispos,2013,41(1): 72-78.
[29] LINDAHL ALLEN M, KOCH C M, CLELLAND G K, et al.DNA methylation-histone modification relationships across the desmin locus in human primary cells[J].BMC Molecular Biology,2009,10(51):1471-2199.
[30] CHODAVARAPU R K, FENG S, BERNATAVICHUTE Y V, et al.Relationship between nucleosome positioning and DNA methylation[J].Nature,2010,466(7304):388-392.
[31] VALEN E, SANDELIN A.Genomic and chromatin signals underlying transcription start-site selection[J].Cell,2011,27(11):475-485.
[32] BARGAJE R, ALAM M P, PATOWARY A, et al.Proximity of H2A.Z containing nucleosome to the transcription start site influences gene expression levels in the mammalian liver and brain[J].Nucleic Acids Research,2012,40(18):8965-8978.
[33] 李微微, 郭东林.组蛋白变体及组蛋白分子伴侣的研究进展[J].国际遗传学杂志,2009,32(5):17-20.
[34] TOLSTORUKOV M Y, KHARCHENKO P V, GOLDMAN J A, et parative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes[J].Genome Research, 2009,19(6):967-977.
[35] 陈慧颖, 张家, 万亚坤.酿酒酵母组蛋白变体Htz1调控基因转录的作用机制[J].中国生物化学与分子生物学报, 2012, 28(2):121-126.
[36] BARSKI A, CUDDAPAH S, CUI K, et al.High-resolution profiling of histone methylations in the human genome[J].Cell,2007,129(4):823-837.
[37] PETTER M, LEE C C, BYRNE T J, et al.Expression of P.falciparum var genes involves exchange of the histone variant H2A.Z at the promoter[J].PLoS Pathogens,2011,7(2):1-14.
[38] ZHANG Y, SHIN H, SONG J S, et al.Identifying positioned nucleosomes with epigenetic marks in human from ChIP-seq[J].BMC Genomics,2008,9:537.
[39] GATTA R, MANTOVANI R.NF-Y affects histone acetylation and H2A.Z deposition in cell cycle promoters[J].Epigenetics, 2011,6(4):526-534.
[40] VALDES -MORA F, SONG J Z, STATHAM A L, et al.Acetylation of H2A.Z is a key epigenetic modification associated with gene deregulation and epigenetic remodeling in cancer[J].Genome Research, 2012,22(2):307-321.
[41] SEEBER A, HAUER M, GASSER S M.Nucleosome remodelers in double-strand break repair[J].Genetics & Development, 2013,23(2):174-184.
[42] HARGREAVES D C, CRABTREE G R.ATP-dependent chromatin remodeling: genetics, genomics and mechanisms[J].Cell Resource, 2011,21(3):396-420.
[43] BOWMAN G D.Mechanisms of ATP-dependent nucleosome sliding[J].Curr Opin Struct Biol,2010,20(1):73-81.
[44] VARGA-WEISZ P D.Insights into how chromatin remodeling factors find their target in the nucleus[J].Chromatin and Gene Expression,2011,107(46):19611-19612.
[45] NOWAK S J,BAYLIES M K.Akirin: a context-dependent link between transcription and chromatin remodeling[J].BioArchitecture,2012,2(6):209-213.
[46] FAZZIO T G,TSUKIYAMA T.Chromatin remodeling in Vivo: Evidence for a nucleosome sliding mechanism[J].Molecular Cell,2003,12(5):1333-1340.
[47] FENG J,DAI X,XIANG Q,et al.New insights into two distinct nucleosome distributions: comparison of cross-platform positioning datasets in the yeast genome[J].BMC Genomics,2010,11:33.
[48] SMOLLE M,WORKMAN J L.Transcription-associated histone modifications and cryptic transcription[J].Biochim Biophys Acta,2013,1829(1):84-97.
[49] ZLATANOVA J,VICTOR J M.How are nucleosomes disrupted during transcription elongation[J]. HFSP Journal,2009,3(6):373-378.
[50] 陈伟,罗辽复,张利绒,等.核小体定位与RNA剪接[J].生物化学与生物物理进展,2009,36(8):1035-1040.
[51] RINGROSE L. How do RNA sequence,DNA sequence,and chromatin properties regulate splicing[J].Biology Reports,2010,2:74.
[52] SATO M.Promoter analysis with wavelets and support vector machines[J].Procedia Computer Science,2012,12:432-437.
[53] CUI F,ZHURKIN V B.Structure-based analysis of DNA sequence patterns guiding nucleosome positioning in vitro[J].Journal of Biomolecular Structure & Dynamics,2010,27(6):821-841.
[54] JANSEN A,VERSTREPEN K J.Nucleosome positioning in Saccharomy cescerevisiae[J].Microbiology And Molecular Biology Reviews,2011,75(2):301-320.
[55] ERCAN S,CARROZZA M J,WORKMAN J L.Global nucleosome distribution and the regulation of transcription in yeast[J].Genome Biology,2004,5(10):243.
[56] HIGASA K,HAYASHI K.Periodicity of SNP distribution around transcription start sites[J].BMC Genomics,2006,7:66.
表观遗传学现象范文第8篇
如果从严格意义上的达尔文主义来说，同性恋是不应该存在的。它并不是传递个体基因的最佳方式，并且使问题进一步复杂化，甚至没有“同性恋基因”被鉴别出来。根据一项假设，其中的原因可能并不在于脱氧核糖核酸（DNA）本身。
有学者认为，可能是先天遗传的原因导致一个人从幼儿时期便产生性倒错，进而形成同性恋倾向。比如有的女孩子生来就具有男孩气质，她们不喜欢花衣服、洋娃娃这些女性的物品或玩具，而喜欢刀枪、棍棒，因此她们被称为“假小子”。可以说，她们的思维和行为方式以及整体气质都是男性化的，角色认同于男性，因此她们没有普通女孩子的娇柔，喜欢和一些弱小的女孩一起玩，去保护她们。这种做法强化了她们内心男性化的欲望，也显示了同性恋的倾向。
进入青春期，她们的性取向依然是男性化的，异性对她们并不能产生很强的吸引力，因此她们的性对象很容易转向同性，进而形成同性恋。对双胞胎的指向研究发现，同卵双胞胎兄弟中若有一人是同性恋，那么另一人也是同性恋的几率高达50%以上。一项以4对同性恋兄弟为对象的DNA分析发现，在3对兄弟的X染色体的一个特殊区域，兄弟两人竟有5个基因相同。
然而，这些兄弟并无明显的女人气，除了性倾向，其他是不同的。这说明遗传可能会影响一个人的性取向，但这并不是产生同性恋的唯一原因。还有一些研究揭示了同性恋形成的先天因素，如胎儿在脑分化阶段所受的性激素刺激以及母亲在怀孕期间所受到的心理创伤等也可能影响胎儿未来的性倾向。
关于性激素水平，有科学家通过动物实验发现，向怀孕的母鼠子宫里注射激素确实能够极大地改变其子代的，因此，有人推测类似的情形是不是也同样会发生在人类身上，即通过胎儿期的激素注射改变其性心理和行为。但鉴于人类道德法律问题，这些实验无法在人体上进行，因而也没有确凿的证据。此外，有科学家分别测量了同性恋者和异性恋者的激素水平，发现同性恋现象与激素水平有关，但难以确定究竟是激素水平的变化导致了同性恋，还是同性恋的心理及行为引起了激素水平的变化。
事实上，随着胚胎的发育，作为对母亲和孩子在子宫中形成的性激素水平波动的响应，与性别有关的基因会被开启和关闭。这种拉锯战可使未出生的孩子受益，保持男性或女性以一种稳定的状态发育，即便面临性激素的峰值时也是如此。但研究显示，一旦这些所谓的表观遗传变化在孩子出生后仍持续存在，并直至他们有了自己的后代，那么其中的一些后代便很有可能成为同性恋者。
美国加利福尼亚大学圣巴巴拉分校的进化遗传学家William Rice认为，一定存在一个理由，从而能够解释为什么同性恋不会随着世代的延续而退出历史舞台。相关研究估算，大约8%的人群是同性恋者，并且已经知道同性恋行为也能够经营家庭。如果同卵双胞胎中的一个人是同性恋者，则另一个人也是同性恋者的几率可高达两成。
此外，Rice强调，“同性恋并非人类独有的行为”。在加州鸥中，大约有14%的伴侣都是雌-雌配对。而在澳洲黑天鹅中，大约6%的伴侣是雄-雄配对，并且有8%的公羊只会对雄性同类产生兴趣。
然而，大部分遗传筛查并没有发现与性取向有关的基因。为了找出是什么原因让同性恋一直存留至今，Rice和同事开始了全面的文献调查。
根据传统观点，Y染色体上的一个基因触发的发育从而让一个胚胎变成了男孩，随后在妊娠的第8周左右便开始产生雄性激素，其中就包括素。而没有Y染色体也就没有素，这样的胚胎就变成了一个女孩。