纤维素酶
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纤维素酶范文第1篇
关键词：生物乙醇 纤维素酶 工程菌株
The study and development progress of Bio-ethanol and cellulase production
Liping Yang1 Shuiwen Cai1 Ling Luo1 Hui Liu1，2
1. Changsha Environmental Protection and Professional technique College, 410004 2 Hunan
2. Agricultural university, 410128, Changsha, China
Abstract: With the fossil fuels from shortage to exhaustibility, the humanity is facing toward a common problem in energy crisis. Finding new energy sources is important to sustainable economic development and even human survival. Bio-ethanol, as an energy source that is renewable, affordable, and environmentally safe, will become a substitute for oil. Elevation of cellulase production and reduction of the cellulase production cost are the key factor for enhancing the market competitiveness of cellulosic bioethanol. In this paper, we discussed the development progress of bio-ethanol and cellulose industry to provide a basis for the future upgrading of bio-ethanol production industry and the development of gene engineering strain.
Keywords: bio-ethanol cellulose engineering strain
随着石化燃料由短缺变成枯竭，能源危机是人类面临的共同问题。1998年，Campbell和Laherrere对石油储备和未开发的石油进行评估后认为，天然油在2010年前的产量就开始下降，到2050年全球每年石油供应量将从目前的25亿桶下降到5亿桶[1]。随着石化燃料供应的减少，寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。生物乙醇作为一种可再生的、经济上可承受的，并且对环境安全的能源物质将逐渐成为石油的替代品[2]。生物乙醇的生产经历了以1代淀粉原料生产乙醇和以木质纤维素为代表的非淀粉原料的2代生物乙醇工业。2代生物乙醇生产克服不与食品的供应之间存在竞争，但是纤维素酶产量低、不稳定、难以工业化导致2代生物乙醇的生产成本大大提高。本文从生物乙醇产业发展过程、木质纤维质物质生产生物乙醇的市场前景及纤维素降解酶的研究进展进行综述，为生物乙醇生产产业的提升、纤维素工程菌的研发提供基础。
生物乙醇产业发展过程
从上世纪80年代开始，人们就开始以谷物为原料来生产乙醇用作供氧燃料，这些被业内称为第1代燃料乙醇的原料。在一些国家，如美国、加拿大、巴西、中国等，乙醇已经被广泛地掺入到汽油中来代替纯汽油使用，其中乙醇的体积含量可达到10%。最近美国正在实施一项混合燃油计划E85，即汽车制造商生产一种可使用乙醇混合物E85（85% 的乙醇和15% 的汽油按体积比混合）的汽车[3]。巴西早在1929年就建立了一项利用乙醇作为发动机燃料的计划，并在接下来几年里安装了第一个使用乙醇作为燃料的发动机。1984年，巴西要求新生产的汽车能使用水化生物乙醇（96%的生物乙醇+4%的水）作为燃料[3]。混合燃料的使用不仅可以减少汽油的使用量，还可以降低温室效应气体以及有毒气体的释放。
但是随着世界人口的不断增长，以谷物等第1代淀粉原料生产乙醇就与食品的供应之间存在竞争，这些谷物为原料生产乙醇就不能满足全球的需求。中国在过去三十年中GDP的年平均增长量为10%，这使得中国成为世界上最大的燃料消费国之一，同时也成为世界上造成空气污染最严重的国家。由于大部分的能源由燃烧化石燃料提供，中国政府正努力解决诸如国内因迅速枯竭的石油和天然气资源而越来越依赖进口石油来满足国内一半的实际需求[4]，以及严重的环境污染等问题。为了改善现状，中国政府决定增加使用能源的种类，尤其提倡使用可再生的、排放更少温室气体的燃料，如乙醇这样的生物燃料和生物柴油。由于生物燃料从诸如玉米、木薯、大豆这样的农产品中提取而来，这对改善中国农村人口的经济状况有积极影响。除了向乙醇生产者发放津贴以鼓励乙醇的生产之外，中国政府近年来也强制要求中国十个省份必须销售浓度为10%的乙醇汽油，这些措施使得中国2008年的乙醇产量迅速达到14.6亿升且在2010年达到21.5亿升，一举成为继美国和巴西之后的世界第三乙醇生产大国。尽管中国政府之前要求到2020年国内乙醇的年消费量要达到100亿升，然而由于担心乙醇生产可能与食物生产行业形成竞争，且考虑到国内农村可用耕地数量有限，以及水资源供应短缺的问题，中国政府于2007年宣布暂停国内谷物乙醇的生产。
为了解决这个矛盾，以木质纤维素为代表的非淀粉原料成为生物乙醇生产的重要原料物质。木质纤维素，其结构复杂，有三种：纤维素35%～37%、半纤维(23-25%)和木质素(18-22%)组成。每年光合可产生大于1，500亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素[5]。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素，如农业废物( 稻草、稻壳、麦秆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废物(果皮、果渣等)、木材废物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40%~60% 固体废物是垃圾和废纸)等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。
木质纤维质物质生产生物乙醇的市场前景
到2020年，全世界从木质纤维素物质生产生物乙醇的产量大约是165亿加仑（合计约625亿升），美国将占有63.9%的市场，欧洲和中国分别将占有10.4%和11.5%的市场[3]。目前，生物乙醇的产业，尤其是非淀粉类的生物乙醇产业主要在于政府的补贴和维持，其原因在于利用木质纤维生产生物乙醇的生产成本较高。第1代淀粉类原料与第2代非淀粉类原料发酵生产生物乙醇不同之处在于前面的预处理和酶解糖化过程。淀粉类原料很容易被酶接触到，就被淀粉酶和糖化酶酶解为葡萄糖(C6糖)，然后葡萄糖再被普通的酵母发酵生产出乙醇，这样，生产工艺环节少，流程短，成本就非常低。但是木质纤维素物质经过自然选择和漫长进化，木质素将半纤维素和纤维素紧密包裹在内部，形成紧密结构，被天然“设计”成可以抵御酶进攻的分子结构。因此与淀粉乙醇不同的是首先要有高温高压蒸汽或结合加酸碱等化学品的预处理技术将紧密结构打开，让酶能够接触到纤维素和半纤维素。纤维素和半纤维素酶解后发酵可以生产出乙醇[6]。纤维素酶解后可得到葡萄糖(C6糖)，半纤维素酶解后可得到木糖(C5糖)，淀粉类和纤维素都是由葡萄糖聚合成的长链结构，只是结合的方式不同而已，因此酶解过程需要的酶是不同的；而半纤维素是由C5糖聚合而成的长链结构，也需要特定的酶。纤维素及半纤维酶的成本更高，这也是导致木质纤维素乙醇成本比淀粉乙醇高的重要原因之一。在每加仑生物乙醇的生产中，利用木质纤维生产，纤维素酶的成本大约是15-20美分，而利用淀粉类生产，淀粉酶的费用仅仅只占到了2－4美分[7]。因此要想提高纤维素生产生物乙醇的市场的竞争力，提高纤维素酶的产量，降低纤维素酶的成本成为解决问题的关键因素。我国是纤维素酶的需求大国，由于纤维素酶的广泛应用，我国市场需求量将以每年25%～35%的速度上升，用纤维素酶产业化生产生物乙醇的关键技术将在未来几年内得到解决，那时我国纤维素酶年需求量将增加到25-40万吨，每年将为我国节省生产燃料乙醇用粮500-1，000万吨[8]。由于产酶菌种落后，产率低，成本高，严重影响我国纤维素酶工业发展，从而阻碍了以木质纤维素为原料的2代生物乙醇工业的发展。
木质纤维素及纤维素降解酶
木质纤维素，其结构复杂，有三种：纤维素(35%～37%)、半纤维(23%-25%)和木质素(18%-22%)组成[9]。纤维素属于可再生自然资源，是生物界最重要的碳源物质，每年由光合作用产生的植物干质量约1，500亿吨，其中纤维素占850亿吨[5]。
纤维素酶(cellulase)是指能够水解纤维素β-1，4-D-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。纤维素酶是一种具有很高活力的木聚糖酶，是一种复合酶，属生物催化剂[10]。纤维素酶主要是指三类关键酶:（1）外切型纤维素酶，系统命名为外切β-1，4-D-葡聚糖酶，又称纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91，也称Cl酶)。这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-糖苷键，每回依次从纤维素分子中切下一个纤维二糖分子，所以又称纤维二糖水解酶(简称CBH)。（2）内切型纤维素酶，系统命名为内切β-l，4-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.4，也称Cx酶或CMCase)。这类酶是纤维素酶中最重要的酶，它作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带有非还原末端的小分子纤维素。（3）纤维二糖酶，系统命名为β-葡萄糖苷酶(EC2.1.21，也称CB酶)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。当以上三种纤维素酶的关键酶的活性比例适当时，就能协同作用完成对纤维素的降解，但各个酶组分单独作用时效果极差。所以说纤维素酶降解纤维素时一个协同表达和作用的过程[11-12]。
不同来源的纤维素酶分子特征和催化活性都不尽相同。细菌产生的纤维素酶量少，主要是内切酶，大多数对结晶纤维素没有活性，而且不能分泌到细菌细胞外，常常聚集形成多酶复合体[13]。真菌能产生大量的纤维素酶，产生的酶组分，能分泌到菌体外，一般不聚集成多酶复合体，但可以相互发生强烈的协同作用。纤维素酶分子的大小因来源不同也有明显的差异，变化范围很广。多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受到糖基化，所含碳水化合物的比率不同在很大程度上决定了酶的多型性，表现为分子量的差别[14]。纤维素酶的酶活力一般都很低，因而酶生产成本高。据报道，纤维素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的大100倍，这是影响纤维素酶实际应用的重要原因之一[3]。
迄今为止，人们已从40多种细菌和数种真菌中克隆到了多种纤维素酶基因，有一百多种基因可在大肠杆菌中表达，大多数克隆的纤维素酶基因能产生信号肽，从而使表达产物部分或全部转移至E.coli的细胞质间隙[15]。虽然克隆到大肠杆菌的基因，不需要载体的启动子就可表达，但表达水平很低，推测可能是其启动子不能完全被识别的缘故。但在大肠杆菌中表达纤维素酶基因存在两个主要问题:一是提取有很大困难，二是表达水平低、酶蛋白不能分泌，离工业化应用的目标还有一定的距离，所以在纤维素酶基因的表达方面人们将目光转向了真核表达系统[16]。
木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌[6]，世界纤维素酶市场中的纤维素酶20%是来自木霉属和曲霉属[17]。绿色木霉是一种在各种气候带的土壤中能够普遍存在的一种多细胞丝状真菌，能够分泌完全的纤维素酶系，其中产量较高并且稳定，是目前纤维素酶商业化生产的主要生产菌株[18]。对于绿色木霉的研究直到九十年代初仅有CBHⅠ基因克隆的报道，王建荣、张曼夫利用里氏木霉的基因序列同源片段做探针，构建了绿色木霉基因文库，并克隆了CBHⅠ、CBHⅡ基因，并对其基因结构进行了研究[19]。
纤维素酶的合成一般受纤维素诱导及葡萄糖降解物的阻遏，多数菌株纤维素酶的合成既受纤维二糖、山梨糖等的诱导，又为葡萄糖、甘油等易利用碳源的阻遏，还受菌体生长速度的影响[6]。在绿色木霉中，纤维素酶属诱导型酶类，其多个酶组分的表达经过严密的调控。在绿色木霉中能产生分泌型的纤维素酶，当CBHⅡ基因缺失时，会影响纤维素酶系其他酶的表达，而缺失其他基因时，只单独影响自身的表达。另有研究表明CBHⅡ是纤维素酶系统中最先表达的酶，其表达产物进一步诱导其他纤维素酶基因的表达，但CBHⅡ基因的表达受纤维素降解产物葡萄糖的抑制[20]。
随着基因工程技术的发展，定点突变和基因重排技术在纤维素酶的生产工业中的应用越来越广泛。在里氏木霉 (T.reesei) 中，需要产生至少14种酶协同作用才能水解未经化学处理过的植物干物质。为了降低纤维素酶的复杂性，将里氏木霉的CBH1、嗜酸耐热菌的葡聚糖内切酶EI 以及曲霉(Aspergillus niger)的β- 葡萄糖苷酶以90∶9∶1(质量比)混合形成一个三元复合物，此三元复合物在120 小时内水解预处理过的纤维素的能力与李氏木霉中纤维素酶体的水解能力相当。为了提高此三元复合物水解纤维素的活力，利用定点突变的方法对葡聚糖内切酶EI的活性位点进行修饰，结果与突变前的三元复合物相比，其水解纤维素的活性提高了12%[21]。Zinnia R等在里氏木霉菌中应用同源重组技术将外切β－葡萄糖苷酶整合到egl3和xyn3基因启动子的下游，增强了纤维素酶的表达量4倍到7.5倍，这些重组菌株能有效的降解纤维素物质[22]。
生物乙醇及纤维素降解酶的未来发展趋势
随着石化燃料供应的减少，寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。生物乙醇作为一种可再生的、经济上可承受的，并且对环境安全的能源物质将逐渐成为石油的替代品[2]。由于产酶菌种落后，产率低，成本高，严重影响我国纤维素酶工业发展，从而阻碍了以木质纤维素为原料的2代生物乙醇工业的发展。因此要想提高纤维素生产生物乙醇的市场的竞争力，提高纤维素酶的产量，降低纤维素酶的成本成为解决问题的关键因素。目前纤维素酶工程菌株中不稳定、产酶量不高、难应用于大规模产业化大规模生产等三大难题。利用基因工程技术改造菌种，尤其是纤维素酶基因启动子的改造，在发酵过程中其酶形成过程不受主要代谢产物葡萄糖的抑制，促进其他纤维素酶基因的协同表达，大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力，将是工程菌柱构建的方向，构建不受葡萄糖抑制、稳定、高效的表达纤维素酶工程菌。可以解决本项目的实施将会大大提高纤维素酶的产量，降低木质纤维素生产生物乙醇时纤维素降解成本，从而促进木质纤维素生产生物乙醇产业的发展。
参考文献：
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纤维素酶范文第2篇
【摘要】
目的优选黄芪总黄酮的提取工艺。方法用正交设计法探讨了影响纤维素酶法提取黄芪中总黄酮的主要因素，并确定了最佳提取工艺。结果纤维素酶法提取黄芪总黄酮的最佳工艺条件为:酶解时间为120 min，酶解温度为30℃，酶量为8 mg，pH值为4.5。结论此工艺简单可行，是一条提取黄芪总黄酮类物质的有效途径。
【关键词】 纤维素酶 黄芪 总黄酮 正交设计法
Abstract：ObjectiveTo opmtimize the extraction technics for total flavonoids from Astragalus. MethodsThe orthogonal design was conducted to investigate the main cellulose enzymatic extraction of total flavonoids from Astragalus and the best extraction technics was determined. ResultsThe optimum conditions cellulose enzymatic extraction of total flavonoids from Astragalus were as follows: enzymolysis time 120min， hydrolysis temperature 30 ℃， enzyme volume 8mg， PH value 4.5.ConclusionThis method is simple and feasible. It is an effective way for extraction of total flavonoids from Astragalis.
Key words：Cellulase; Astragalus; Total flavonoids; Orthogonal design
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus Technology或膜夹黄芪Astragalus membranaceus的干燥根，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效。黄芪中的主要有效成分为多糖、皂苷和黄酮类化合物，其中黄酮类化合物主要包括毛蕊异黄酮(calycosin ) 及其糖苷芒柄花素 (formononetin)和芒柄花苷(ononion) 等［1］ 。研究证实黄芪中的黄酮类成分具有多种药理活性，具有清除氧自由基、抑制脂质过氧化、增强免疫力、抗病毒以及促进细胞增殖的作用［2～3］。
近年来，酶技术应用于中草药有效成分的分离提取取得了不少新的成果，尤其应用纤维素酶可破坏细胞壁的致密结构，加速药用有效成分的溶出，提高药用有效成分的提取率。酶解过程的实质是通过酶解反应促进传质过程。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。纤维素是黄芪细胞壁的主要成分，亦是胞内黄酮等大分子溶出的主要屏障，利用纤维素酶水解细胞壁，利于胞内成分溶出［4～9］。但将纤维素酶应用于提取黄芪中总黄酮的研究鲜见报道。本实验将上海伯奥生物科技有限公司提供的绿色木酶（主要成分为纤维素酶，以下简称纤维素酶）用于黄芪总黄酮的提取，应用正交设计优化酶法提取黄芪总黄酮的工艺条件，探讨各因素对黄芪总黄酮提取率的影响，以期达到提高提取率、缩短提取时间、减少能耗和有效保存黄芪总黄酮的生物活性，并为植物酶技术在中药有效成分的提取方面的应用提供依据。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
HH-6恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）；RE-52CS旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂)；予华牌循环水真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂)；UV1101紫外/可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)；AY120电子分析天平（日本岛津公司）；KH-400KDB型高功率数控超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；摇摆式高速中药粉碎机(大德中药机械有限公司)。
1.2 试剂
乙醇（无水乙醇）；5%亚硝酸钠；10%硝酸铝；4%氢氧化钠；乙酸（冰醋酸）；无水乙酸钠；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号:050923）， 黄芪购自广州致信中药饮片有限公司，纤维素酶 (活性单位≥15 U／mg)由上海伯奥生物科技有限公司提供。
2 方法与结果
2.1 黄芪总黄酮成分提取
称取纤维素酶8 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1g黄芪粉末（过50目筛）混合均匀，在30℃ 下处理1 h后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h过滤，用20 ml体积分数85％ 的乙醇洗涤残渣过滤，合并滤液，回收乙醇，残渣溶于质量分数为85%的乙醇，定容至25 ml，精密吸取1 ml于25 ml的容量瓶中，30%乙醇定容，得供试品溶液。
2.2 黄芪总黄酮含量的测定
2.2.1 芦丁对照品溶液的制备
准确称取于芦丁对照品10 mg， 置于50 ml 容量瓶中， 加30%的乙醇30 ml， 超声使之溶解， 冷却至室温， 并稀释至刻度， 摇匀， 得浓度为200 μg/ml 的芦丁对照品溶液， 冷藏， 备用。
2.2.2 吸收波长的选择
对照品测定波长的确定：取对照品溶液1 ml，按标准曲线项下的方法进行，在400～700 nm波长范围内扫描，结果在500 nm波长处为最大吸收。样品测定波长的确定：取样品的乙醇提取液1 ml，按标准曲线项下的方法进行，在400～700 nm波长范围内扫描，结果在500 nm波长处有最大吸收。
2.2.3 标准曲线制备
精密称取芦丁对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分别至25 ml容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 ml，放置6 min，加入1 mol氢氧化钠溶液4 ml，分别用30%的乙醇定容，放置15 min，置比色皿中，在500 nm波长处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线。经回归统计，得标准曲线方程：A=0.010 9C-0.001 3，r=0.999 8。浓度在0～400 μg/ml范围内与吸光值线性关系良好。
2.3 黄芪中总黄酮提取率的测定
取黄芪中总黄酮提取液用紫外分光光度计于500nm下测出吸光度A代入以下回归方程式及下列公式，计算出黄芪中总黄酮的提取率。 提取率（%）=（C×V×10-6）W，式中V为定容体积（ml），W为黄芪药粉质量（g），C为黄芪提取液浓度（μg/ml）。
2.4 单因素实验及正交实验酶法提取的整个工艺分为酶解和浸提两部分，准确称取黄芪1g，加入缓冲溶液和一定比例的酶，黄芪经酶解后在相同的条件下浸提，过滤，按标准曲线方法测定吸光度。
2.4.1 考察酶解温度对总黄酮提取率的影响
称取纤维素酶8 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1 g黄芪粉末（过50目筛）混合均匀，分别在30，35，40，45，50，55℃ 下处理1 h后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h过滤，用20 ml体积分数85％ 的乙醇洗涤残渣过滤，合并滤液，回收乙醇，残渣溶于质量分数为85%的乙醇，定容至25 ml，精密吸取1 ml于25 ml的容量瓶中，30%乙醇定容，按标准曲线操作测定总黄酮含量。绘制单因素图见图1。由于一般纤维素酶的活性多在40～60℃较好，因此考察酶解温度为30，40，50，60，70℃对黄芪中总黄酮提取率的影响。由图1可知，在40℃以下总黄酮的提取率随温度的升高而增大，温度为40℃时，黄芪总黄酮提取率最大，随后温度进一步升高黄芪总黄酮收率逐渐减小，温度在60℃，70℃时提取率稳定，趋向一致。这是因为40℃时纤维素酶发挥最大活性，有利于黄酮类化合物的溶出，提高黄芪总黄酮提取率。而温度进一步提高，则不利于酶活力的发挥，温度过高会使酶蛋白变性失活，丧失催化能力，因而提取效果变差。
2.4.2 考察酶解时间对总黄酮提取率的影响
称取纤维素酶8 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1 g黄芪粉末（过5目筛）混合均匀，在45 ℃下分别处理30，60，90，120，150 min后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃下浸提1 h，过滤定容方法同上，单因素图见图2。从图2中可知，随着酶解时间的延长，总黄酮的提取率也随着提高，当酶解2 h即可达到最佳效果，在2 h之前，延长酶解时间可明显提高总黄酮提取率，但在2.5 h实验时的总黄酮的提取率仅比2 h略高，说明酶解已经基本完成，没有再增加酶解时间的必要。
2.4.3 考察酶用量对总黄酮提取率的影响
分别称取纤维素酶4，6，8，10，12 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1g黄芪粉末（过5目筛）混合均匀，在45℃下处理1 h后加入95%的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h。过滤定容方法同上，其单因素图见图3。由图3可看出，在酶用量在8 mg之前，随着酶用量的增大，总黄酮的提取率逐步提高，酶用量到8 mg之后，总黄酮的提取率上升趋势不明显。纤维素酶用量对酶解用一定的影响，在一定的酶浓度范围内，随着酶量的增加，纤维素酶解率增大。由于一定量的纤维素在一定条件下，纤维素分子能和酶分子结合的结合点数有限当这些结合点全部被纤维素酶分子占据后，再增加纤维素酶用量，起不到酶解作用，而从经济角度考虑，酶用量也要尽可能的少。因此最佳的酶用量为8 mg。
2.4.4 正交实验上面讨论了各单因子的影响，但是在实际的操作中，各因素是相互交差影响的。因此，为全面考查影响因素，设计了4因素3水平正交实验，结果见表1～2。从表2的K值和极差R值可以看出，在4个影响总黄酮提取率的因素中，影响顺序为：酶解温度（B）＞酶量（C）＞酶解时间（A）。其中A3B1C3为最佳优化条件，即酶解时间为120 min，酶解温度为30℃，酶量为12 mg，pH值为4.5。经测定，在此最优工艺条件下，黄芪中总黄酮的提取率为0.402%。比较初步优化和正交优化的结果可以看出，两者的条件基本不同。原因可能在于4个主要因素相互影响，有相互作用。表1 正交实验的因素及水平，表2 酶法提取黄芪中总黄酮的正交实验结果（略）。
3 讨论
实验结果表明，酶解时间的延长、酶量的适当加大、适当的温度和pH值有利于提高黄芪有效成分提取率。各因素对总黄酮的提取率的影响大小次序先后为：酶解温度＞酶量＞酶解时间。各因素的优化工艺参数为：A3B1C3，即酶解时间为120 min，酶解温度为30℃，酶量为12 mg，pH值为4.5。在此最优工艺条件下，黄芪中总黄酮的提取率为0.402%。如“2.4.3”项结果，在本实验参数的基础上，为了获得较高的提取率、节省酶用量，酶用量取8 mg。此工艺简单可行，是一条提取黄芪总黄酮类物质的有效途径。
纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。黄芪细胞的细胞壁主要由纤维素构成，纤维素酶可以将其水解为葡萄糖，使其内容物更容易被提取出来。纤维素酶只是破坏黄芪细胞的细胞壁，其细胞内部物质并不含有纤维素类物质，因此纤维素酶对其内容物的成分没有任何影响。中草药种类繁多，有效成分结构复杂。为了提高中草药有效成分的提取率，可应用酶法提取中药有效成分。随着酶技术在中草药有效成分提取方面研究的不断深入，应用纤维素酶、果胶酶以及复合酶提高中草药药用有效成分的提取率，将成为充分利用中草药资源的有效途径，酶技术必将在中药现代化进程中发挥重要作用。
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纤维素酶范文第3篇
摘要：目的：对纤维素酶提取中药中有效成分的研究进行综述。方法：查阅文献，纤维素酶提取中药材有效成分时，其工艺只比原工艺多了一步对原药材饮片的酶解处理。结果：在纤维素酶的作用下，提高了中药材有效成分的收率，两种方法对比有显著性差异。结论：酶法提取，具有高效、快速、省时、操作简便等优点。
关键词：纤维素酶 酶解技术中药提取 研究进展
Abstract: Objective: This paper has summarized the research progress of effective components of Chinese herbs in cellulase extraction.Methods:Though literature review that cellulase on extracting effective components in traditional Chinese medicinal materials, the new process is one more step than the previous one which is enzyme treatment in the original Chinese herbal slices.Results: With the action of cellulase, improve the effective components in traditional Chinese medicinal materials yield, it had significant difference by comparing the two methods.Conclusion: Enzymatic extraction is high efficiency, fast, time-saving, easy operating etc..
Key words :cellulase; enzyme technology; the extraction of traditional Chinese medicine; research progress
中药酶解技术就是根据植物药材细胞壁是由纤维素构成，利用酶反应所具有的高效专一性，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分水解或降解，破坏细胞壁结构，使其有效成分暴露出来，并溶解于溶剂中，从而达到提取细胞内有效成分的一种制剂新技术。
传统的提取方法（如煎煮、浸渍、渗漉、回流）有着提取温度高、周期长、提取率不高等诸多缺点。而运用中药酶解技术就可以清而易举的克服这些方法存在的不足，提高有效成分的含量，保证成品质量稳定性。本文在此对酶解技术的作用原理、特点及其在中药提取中的应用作一综述，希望能对从事中药研究的工作者们起到一定的参考作用。
1.酶解技术的作用原理
据普查，我国可供药用的植物、动物和矿物已达12807种之多，其中植物药占87%；动物药占12.4%；矿物药占0.6%。因此，对植物药的酶法提取研究尤为重要。
中药酶法提取是在传统的溶剂提取方法的基础上，根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有的高度专一性等特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分水解或降解，破坏细胞壁结构，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取细胞内有效成分的目的的方法。由于植物提取过程中的屏障——细胞壁被破坏，因而酶法提取有利于提高有效成分的提取率。
2.酶解技术的特点
（1）酶反应在较温和的条件下可将植物组织分解,最大限度从植物体内提取有效成分，较大幅度提高了药物有效成分的提取率,改善了中药生产过程中的滤过速度和纯化效果,提高了产品的纯度和制剂的质量；
（2）酶处理技术是在传统的中药提取基础上进行的，对设备无特殊要求，应用常规设备即可完成；
（3）由于酶属于生物催化剂，少量的酶就可以极大地加速所催化的反应；酶促反应用于中药的提取和提取液的分离纯化，操作简便，成本低廉；
（4）采用酶反应可较温和地使中药组织分解，减少了化学品的使用，有利于资源合理利用、环境改善和人员劳动保护。
3.酶解技术在中药提取中的应用
目前酶在中药制剂中的应用主要有四个方面：（1）酶解技术用于植物药材提取过程，酶作为浸提辅助剂，破坏植物细胞结构，提高药材有效成分提取率；（2）酶解技术用于中药提取液的纯化；（3）酶解技术用于动物药的提取；（4）酶解技术在药渣再利用中的应用。
张彩霞等将纤维素酶应用于穿山龙提取薯蓣皂苷元，其工艺只比原工艺多了一步对原药材饮片的酶解处理，但在纤维素酶的作用下，提高了薯蓣皂苷元的收率，两种方法对比有显著性差异。马桔云等在穿心莲提取穿心莲内酯之前，经纤维素酶进行酶解，与原提取工艺相比较，提高了穿心莲内酯的含量和提取量，经薄层层析检测，两种提取工艺所得成分没有差异，说明酶的加入对所提有效成分没有影响。因此，生物酶解技术在中药制剂制备、药材综合利用及提高制剂质量等方面具有较好的运用前景。
4.问题及展望
由于酶解技术是通过酶反应进行的，而酶反应需要在适宜的条件下才能进行。因此，在中药提取、提取液的分离纯化、药渣的在利用中应用酶处理技术，需深如研究和探讨以下问题。
4.1酶反应条件的筛选
酶反应需要一定的条件。当条件适宜时，酶的催化能力最强，表现出的活性最强。尽管纤维素酶水解纯纤维素时的最佳温度为55℃，最佳PH值为4.5，但因中药成分复杂、干扰因素多，因此，在中药酶反应处理过程中，对于具体药物，优选酶反应的最适条件、最大限度地发挥酶的催化作用极为重要，需要综合考虑以下因素。
（1）酶的种类
酶是一类具有专一性生物催化能力的蛋白质。不同的酶要求不同的底物进行酶催化反应，因而不同的酶对含不同种类、性质有效成分的药材有不同的酶解效果。
（2）酶浓度
一般情况下，底物浓度远较酶的浓度高，这时增加酶的浓度，酶促反应也相应地加快，且成正比关系。
（3）酶解温度
温度对酶活力的影响，是对酶蛋白结构的稳定性和反应速度综合作用的结果.在一定范围内，温度升高，可加速化学反应进程；但由于酶的化学本质是蛋白质，当温度超过一定程度时，蛋白质分子逐渐发生紊乱而丧失活性。
（4）酸碱度
酶是两性化合物，分子中有羧基、氨基等酸性或碱性基团，过酸或过碱都可以使酶的空间结构被破坏，引起酶的可逆或不可逆的丧失；或影响底物的解离状态成酶活性部位的结合基团和催化基团的解离状态，从而使底物与酶不能结合或不能转化为产物。
其他影响因素，如酶解时间、酶解反应的次数、提高酶反应速度的酶激活剂和降低酶反应速度的酶的抑制剂的影响等尚需考查。
参考文献：
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纤维素酶范文第4篇
关键词：蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand．－Mazz）；绿原酸；提取工艺
中图分类号：Q946．8；R284．2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）18－4097-04
Optimixation of Cellulase Extraction Technology of Chlorogenic Acid from
Taraxacum mongolicum
LIN Chun－mei
（Ocean College， Huaihai Institute of Technology， Lianyungang 222005，Jiangsu，China）
Abstract：Chlorogenic acid in dandelion （Taraxacum mongolicum Hand．－Mazz．） was extracted by cellulose． The effects of enzyme dosage， raw material to solvent ratio， treatment temperature， treatment time and pH on the yield of chlorogenic acid were optimized by orthogonal experiment based on single factor tests． The results showed that the optimal extraction conditions were pH 6．0； enzyme dosage， 3．0 mL； extraction temperature， 50 ℃； extraction time 1．0 h； the yield of chlorogenic acid under these conditions was 10．031 mg／g．
Key words：Taraxacum mongolicum Hand．－Mazz； chlorogenic acid； extraction
蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand．－Mazz）别名蒲公草、黄花地丁、黄花三七、婆婆丁等，原产于欧洲，在中国大部分地区均有分布，其味甘苦，性寒，既是营养保健野菜，也是常用的中药材，为药食同源植物之一，是开发绿色天然植物型营养保健品理想的宝贵资源。
蒲公英含碳水化合物、脂肪、蛋白质、多种矿物质、微量元素以及维生素等营养成分，此外还含有蒲公英甾醇、蒲公英苦素、皂苷、胆碱、肌醇、咖啡酸、绿原酸、黄酮类等功能性化学成分，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、卡他球菌均有显著的抑制作用，即具有广谱抑菌作用，此外还具有利胆保肝、抗胃损伤、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等功能［1，2］。其中的绿原酸是一种多酚类物质，具有重要的生理活性，有抗氧化、抗艾滋病毒、抗致畸、抗过敏、抗肿瘤细胞毒活性、对透明质酸酶和葡萄糖－6－磷酸酶有抑制作用等功能［3］。因此蒲公英及其绿原酸成为功能性食品研究开发的热点，中国国内外已开发出蒲公英饮料、蒲公英酒、咖啡、糕点、糖果以及蒲公英花粉和蒲公英根粉等保健食品。目前，绿原酸提取的原料主要是金银花、杜仲叶，另外有葵粕、稻壳、甘薯、杭白菊、牛蒡叶等［4－15］，其中蒲公英来源丰富，部分学者用水提或醇提方法进行了蒲公英中绿原酸提取的研究［16］，而纤维素酶法具有条件温和、没有溶剂残留等优点。
研究采用纤维素酶法提取蒲公英中的绿原酸，用分光光度法测定提取液中绿原酸含量，计算绿原酸提取率，并对影响绿原酸提取率的因素进行了初步探讨，优化了绿原酸提取的工艺，为提高蒲公英的综合利用价值提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 原料与试剂 蒲公英为2011年5月27日采自山东省烟台市郊区的农田，将其于低温烘干粉碎过40目筛；35 kU／g纤维素酶购自北京梦怡美生物科技有限公司，使用前配成5 g/L纤维素酶；绿原酸标准品（纯度＞98％）购自北京中科三捷生物有限公司；无水甲醇、无水乙醇、盐酸均为分析纯。
1．1．2 仪器与设备 HW·YS型数显恒温水浴锅购自浙江舟山市定海区海源仪器厂，电子分析天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，T6新世纪紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司，PHS－3C型精密酸度计购自上海精密科学仪器有限公司。
1．2 方法
1．2．1 纤维素酶法
1）工艺流程。选材称量加去离子水加酶液水浴加热灭酶用壳聚糖澄清抽滤取滤液定容用分光光度法测定，计算绿原酸提取率。
纤维素酶范文第5篇
关键词：纤维素酶；菌株；发酵；玉米秸秆；水解
中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3141-04
Optimizing Conditions of Screening and Fermentation for a Strain of High-yield Cellulase
CHAI Ming-yan
（Pharmaceutical and Biological Engineering Department of Zibo Vocational Institute， Zibo 255314， Shandong， China）
Abstract： To obtain the high-yield cellulase strain， the sodium carboxymethyl cellulose （CMC）-congored plate method was used to screen cellulase-producing bacteria in soil samples riched with corn stalk fiber. Fermentation conditions were optimized also determined. The results showed that 10 cellulase-producing bacterial strains were isolated. Among these strains， three bacterial strains had the best effects on producing the celluloses. Especially， the strain tg31 could hydrolyze corn straw at a rate up to 37.62%. The optimal fermentation conditions were temperature of 28 ℃， initial fermentation with pH 5.0， 6% inoculation and shaking speed of 180 r/min. Under the optimal condition， the strain was amplified with 5 L tank and enzyme activity reached 14.21 IU/mL at 120 h. The strain Tg31 obtained the best FPA activity with significant hydrolysis rate of corn stalk， indicating that it had the abroad prospect of application.
Key words： cellulase； strain； fermentation； corn stalk； hydrolysis
中国是农业大国，每年产生的农作物秸秆总量超过7亿t，约占世界秸秆总产量的1/3[1，2]，其中玉米秸秆产量高达2.2亿t[3]。玉米秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素等，难以被人类有效利用。目前，中国玉米秸秆大部分被直接焚烧，不仅对环境造成了极大的污染，同时也浪费了大量的秸秆纤维素资源[4]。为改变现状，开发纤维素酶降解玉米秸秆，实现废弃资源的生物利用，已逐渐成为该领域的研究热点之一。纤维素酶可充分降解秸秆中的纤维素，将其转化为微生物可利用的糖类，大大提高玉米秸秆的经济利用价值，该技术在医药中间体、精细化工、食品、饲料及生物能源等领域都有广泛的应用前景[5，6]。因此，展开高产纤维素酶菌株的选育、发酵工艺条件优化等研究工作，对纤维素的商业化开发具有重大意义。
本研究在玉米秸秆地进行针对性的取样筛选，获得一株高产、高玉米秸秆水解率的菌株，并对其产酶条件进行了摇瓶优化及5 L罐发酵工艺放大，为玉米秸秆纤维素资源的产业化应用打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 从辽宁省喀左县富含腐烂玉米秸秆地区取土样若干。
1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的配制参照邱雁临等[7]的配方。初筛培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）2.0 g，琼脂2.2 g，土豆汁20 g，蔗糖2.0 g，去离子水 100 mL；复筛培养基：CMC-Na 2.0 g，琼脂2.2 g，土豆汁20 g，蔗糖2.0 g，刚果红0.02%，去离子水100 mL；发酵培养基：蛋白胨1.0 g，酵母粉1.0 g，CMC-Na 1.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO4 0.1 g，去离子水100 mL，pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 菌株 初筛：参照肖舸等[8]的方法稍加改动，称取0.5 g 样品加入49.5 mL含有玻璃珠的生理盐水中（稀释度为10-2），振荡30 min混匀，并将上清液按10-3、10-4、10-5稀释，各取1 mL稀释液接种于分离培养基平板上，每个稀释度进行两次重复，28 ℃培养48 h，挑取生长较快的菌株纯化两次，镜检后接种到斜面上，4 ℃保存。复筛：使用打孔器将纯化后的菌株挑取单菌落放置到CMC-刚果红平板上，28 ℃培养3 d，测量透明圈的大小，透明圈大说明纤维素酶的分泌能力强[9]。
1.2.2 摇瓶发酵优化 研究摇瓶发酵温度、pH、接种量及转速对菌株产酶效果的影响，以期获得最适的产酶工艺。用250 mL三角瓶将筛选得到的水解圈较大的菌株接种于30 mL液体发酵培养基中发酵培养。其中，温度设计：24、26、28、30、32 ℃；初始pH设计：3、4、5、6、7、8；接种量设计：2%、4%、6%、8%、10%；摇瓶转速设计：120、150、180、210、240 r/min。发酵5 d后取样测酶活性，每个研究条件均设置2个平行样。
1.2.3 滤纸（FPA）酶活测定 依据刘德海等[10]的研究，将发酵液5 000 r/min离心10 min，收集上清液，将0.5 mL发酵液上清液和1 mL 0.05 mol/L pH 4.8柠檬酸缓冲液加入试管，加热至50 ℃，加入whatman滤纸[（50±1 mg）]，反应60 min，立即加入3，5-二硝基水杨酸（DNS）反应液3 mL，水浴5 min。冷却至室温，用去离子水适当稀释，在540 nm处测定吸光度。滤纸酶活定义为每分钟转化生产1 μmol葡萄糖所需的酶量为1 IU。
1.2.4 水解试验 参照文献[11]，采用酶液进行水解试验，水解体系为30 mL，反应温度为50 ℃，底物浓度10%，pH 4.8的柠檬酸缓冲液为缓冲体系，酶的装载量根据底物量定为10 IU/g。分别对玉米芯、玉米秸秆、木屑、蔗糖渣与棉子壳进行水解试验。
1.2.5 5 L发酵罐放大 将摇瓶获得的最佳发酵工艺条件进行5 L发酵罐放大试验，发酵开始24 h第一次取样，以后每隔12 h进行一次取样，共发酵120 h。
2 结果与分析
2.1 产纤维素酶菌株的分离筛选
采用刚果红染色法从富含腐烂玉米秸秆的土样中筛选获得菌圈较大的10株菌株，菌株编号及透明菌圈直径如表1所示。jx25、lt01及tg31产纤维素酶能力最强，选取此3株菌株进行发酵工艺优化试验。
2.2 摇瓶发酵结果
2.2.1 最佳温度 试验考察不同温度水平对3株菌株摇瓶发酵产酶效果的影响，经发酵液测得FPA酶活。由图1可见，jx25与tg31最适发酵温度均为28 ℃，lt01最适温度为30 ℃。其中tg31菌株酶活最高为5.89 IU/mL，其次jx 25酶活为4.72 IU/mL，lt 01酶活仅为4.42 IU/mL。
2.2.2 最适初始pH 由图2可见，随着初始pH的增加jx25、lt01和tg31产酶能力逐渐提高，在pH 5.0时均达到最高，分别为6.234、6.824与7.350 IU/mL，而后酶活随pH增加逐渐降低，当pH 为8.0时酶活最低。由此可见，选用初始pH 5.0作为3株菌株摇瓶发酵pH最为适宜。
2.2.3 最适接种量 由图3可见，接种量为6%时，3株菌株的FPA酶活均达到最高，其中tg31酶活最高，达到9.56 IU/mL，是jx25酶活（7.92 IU/mL）的1.2倍。故菌株最适接种量为6%。
2.2.4 最佳摇瓶转速 由图4可见，随着转速的提高，初始阶段酶活也随之提高，当转速为180 r/min时，3株菌株酶活均达到最高，jx25、lt01、tg31分别为9.83、10.49、13.68 IU/mL，而后随着转速增加酶活降低。可见，最佳摇瓶转速为180 r/min。
2.3 纤维素酶对不同底物的水解
3株菌株发酵获得的发酵液对不同底物的水解效率如图5所示。由图5可见，jx25对甘蔗渣和木屑的水解效率最高，分别达到18.23%和27.46%；水解底物为棉子壳、玉米秸秆、玉米芯时，tg31水解效率最好，分别为27.38%、37.62%、27.86%。由此可知tg31是能产生针对玉米类秸秆纤维素高效高产降解酶的菌株，鉴于中国废弃玉米秸秆量巨大的现状，tg31具有广阔的应用前景。
2.4 5 L发酵罐放大
综合摇瓶发酵结果，tg31菌株FPA酶活最高，水解试验得知其对玉米秸秆的水解效果最好，是一株能产生针对玉米类秸秆纤维素高效高产降解酶的菌株，故选择tg 31进行5 L发酵罐放大。5 L发酵罐不同时间酶活曲线如图6所示。由图6可见，5 L发酵罐中，接种后酶活迅速提高，发酵前96 h提升速率较快，96～120 h时酶活提升速率减缓，120 h时酶活最高，达到14.2 IU/mL。
3 小结和讨论
运用透明圈法和摇瓶液体培养法，对从富含腐烂玉米秸秆的土壤样品中得到的纤维素酶高产菌进行初筛和复筛，获得一株高酶活、高产纤维素酶的菌株tg31，将其作为液体发酵条件研究的供试菌种。对该菌的产酶条件（包括最适温度、最适pH、最适接种量和最佳转速）进行研究得出摇瓶发酵产酶最优工艺条件为发酵温度30 ℃，发酵初始pH 5.0，最适接种量6%，最佳转速180 r/min，此时酶活达到13.68 IU/mL，对玉米秸秆水解率达到37.62%，并可将此工艺成功放大应用于5 L发酵罐中。
纤维素作为世界上最丰富的可再生资源，其生物利用潜力备受人们的关注。据研究得出，酶学降解产生单糖或蛋白质等产品是纤维素生物利用的最佳途径，其有关研究已成为生物科学的热点领域。目前，随着科学研究的不断深入，纤维素酶的应用技术逐渐成熟。玉米秸秆作为丰富的可再生资源，含有大量纤维素和半纤维素成分，难以被生物有效降解。经过纤维素酶等酶系的有效降解，能够产生更高的经济价值。为此，利用纤维素酶降解玉米秸秆的研究具有重要的科学意义。
目前，有关纤维素酶及其产酶菌的研究已有大量报道，并取得了一定的进展，主要集中在以下几个方面：一是产纤维素酶微生物的筛选。已知自然界中能分解纤维素的微生物主要为真菌及部分细菌，其中以木霉、青霉及曲霉的降解能力最为突出[12，13]；二是影响纤维素酶菌株在发酵罐中放大培养的因素，如溶氧[14]、传质[15]及起泡沫[16]等；三是产纤维素酶菌株的发酵方式，如补料及分批发酵[17]等。
本研究从富含腐烂玉米秸秆的土样中获得高产纤维素酶菌株tg31，依据发酵条件优化的初步结果发现，tg31具有良好的产纤维素酶特性，具有广阔的应用前景。结合国内外研究进展，有关tg31的后续研究，应着重考虑结合流体力学及数学模型进行有效的发酵工艺优化。
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纤维素酶范文第6篇
关键词：酶 纺织品 染整 应用
1、纤维素酶
1.1 纤维素酶的定义
纤维素酶是纤维素是由各种不同催化特性的酶组成的多组分的酶体系。一般认为，纤维酶主要由CBIⅠ、CBHⅡ和葡萄糖苷酶组成的，这些酶在纤维素水解过程中具有协同作用。纤维素酶正式应用于纺织品化学加工中已有20多年历史。
1.2 纤维素酶在纺织品染整加工中的作用
纤维素酶在纺织品染整加工中所起到的主要是水解作用，纤维 素酶的水解是固液多相反应，首先纤维素酶扩散到纤维表面或内部，吸附到纤维底物上，而进一步发生水解反应。
1.3 纤维素酶在生物抛光整理中的应用原理
生物抛光是一种用纤维素酶改善棉织物表面的整理工艺，以达到持久的抗起毛起球并增加织物的光洁度和柔软度。天然纤维素的结构复杂，结晶度高，在一定酶浓度和时间条件下很难把纤维素完全水解成葡萄糖单体，仅对织物表面或伸出织物表面的茸毛状短小纤维作用。生物抛光也就是去除从纤维表面伸出的细微纤维，经纤维素酶处理后稍经机械加工就可以得到表面平滑而茸毛少的织物。生物抛光的主要功效是使服装和面料长久保持光鲜、手感更柔软。与传统的加工方法比，生物抛光有如下优点：织物表面更光洁无茸毛；织物表面显得更加均匀；减少起毛起球的趋向；增加悬垂性并具滑爽手感；处理的织物更具有环保意义。经过生物抛光处理的织物还有诸多优点：穿着洗涤不易起球，染色鲜艳，保色保新时间长，尤其对印花织物效果更好。
1.4 纤维素酶在牛仔裤加工中作用
纤维素酶还应用于牛仔裤产品的洗涤加工，代替石洗加工工艺。最早应用在靛蓝牛仔服装的洗涤整理上，以获得与石磨相同的染料脱色，洗白等褪色防旧效果。这种加工的原理是，首先将牛仔服装上的浆料充分去除，充分发挥纤维素酶对牛仔服装表面的剥蚀作用；纤维素酶仅对牛仔服装表面部分水解，造成纤维在洗涤时发生脱落，在纤维素酶处理时，牛仔服装在转鼓中不断发生摩擦，加速服装表面纤维的脱落，并使吸附在纤维表面的靛蓝等染料一起去除，产生石磨洗涤的效果，并具有独特的外观和柔软的手感。目前应用的纤维素酶大多为中性或酸性纤维素酶。纤维素酶用于牛仔服装水洗石磨加工，加工后的服装雪花点多、立体感强、色光好；与传统的石磨工艺相比，酶洗工艺条件温和，耗能降低，减少了服装和设备的磨损，水洗效率高；与传统的化学助剂整理工艺相比，酶洗工艺大大减少了污水排放，有利于环境保护。
2、淀粉酶
2.1 淀粉酶的定义
淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，主要应用与退浆，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、减法更柔软，且不损伤纤维。用淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，在目前的生产工艺中，仍旧是去除淀粉浆料的重要方法。只不过现在应用的淀粉酶的工艺水平向高温高效方向发展，最高温度可达115℃，加工时间最短只有十几秒钟。现在的高温淀粉酶不但可以提高退浆效率，还可以同时去除混合浆料中的PVA等化学浆料。
2.2 淀粉酶的种类及其作用
（1）种类：淀粉酶的种类按作用方式可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、支链淀粉酶和异淀粉酶等。
（2）作用：α-淀粉酶属于内切型淀粉酶，它作用于淀粉时从淀粉分子内部以随机的方式切断α-1，4 苷键，最终水解产物为葡萄糖、麦芽糖和低聚糖，能快速降低淀粉的粘度，是最重要的一类淀粉酶。如淀粉酶应用于棉织物的退浆。传统的棉织物退浆工业应用氧化剂、酸等退浆剂，这就产生了一个缺点：退浆剂在与淀粉作用的同时，也会与纤维素发生作用，并降低织物的强力。如果控制不当，甚至会引起织物全部降解。酶能够发生选择性反应并把淀粉转化到可溶状态。淀粉酶能够完全破坏淀粉，同时又不损伤纤维素，这是淀粉酶退浆的一个非常突出的优点。淀粉酶退浆工艺分为浸渍、保温处理和水洗三个阶段。浸渍阶段：这个阶段包括织物吸收酶溶液，使浆料凝胶化。其主要目的是使织物被酶溶液充分润湿，充分保持酶的稳定性，使浆料凝胶化。为使织物充分地被酶溶液润湿，可在70℃或更高温.。目前退浆用的淀粉酶都是α-淀粉酶。不同来源的α-淀粉酶具有不同的热稳定性和最适反应温度。α-淀粉酶的淀粉改性剂使得淀粉在调浆过程中降解和简单变性.故可部分取代PVA对纯棉、涤棉等织物上浆，大大降低了上浆成本，减少环境污染，并顺应厂找国今后新型浆料的发展方向：“高质量、多功能、少组分、系列化、少用或不用PVA”。另外，近年来，α-淀粉酶还被用于变性淀粉生产中的淀粉预处理工艺中。实现淀粉在变性前被降解，提高变性效率，制得r高浓低粘的高质量的变性淀粉浆料。
纤维素酶范文第7篇
关键词：绿色木霉（Trichoderma viride）；cbhⅠ启动子；绿色荧光蛋白；外源基因表达
中图分类号：Q786；Q939.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3180-03
纤维素酶在木质纤维素资源化利用过程中发挥着重要的作用。目前纤维素酶存在酶活性低、对天然木质纤维素分解能力弱、生产周期长以及价格昂贵等问题，严重制约了其工业化应用[1，2]。本实验室选育的绿色木霉（Trichoderma viride）Sn-9106能以秸秆、纸浆等工业废物为碳源，将其中的纤维素转化为可发酵的糖成分，是一株适合固体发酵模式的纤维素酶工业生产菌株[3-5]。随着基因工程技术的不断发展，利用分子生物学手段研究丝状真菌纤维素酶系分泌机制、活性及协同作用等逐渐成为目前研究热点[6-8]。研究表明，纤维素酶在大肠杆菌表达系统中容易形成包涵体、酶活性比较低、缺乏糖基化修饰；在酵母中表达又存在着过度糖基化和蛋白折叠等问题，使表达的纤维素酶活性严重丧失[9]。目前木霉为适合真菌类纤维素酶的表达载体之一[10]。瑞氏木霉（Trichoderma reesei）中外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ基因（cbhⅠ）是纤维素酶基础性表达基因之一。在异源表达过程中，cbhⅠ启动子在没有诱导物存在的情况下也能够启动报告基因表达[1]。本研究利用瑞氏木霉cbhⅠ启动子、以绿色荧光蛋白为报告基因、潮霉素为抗性标记构建绿色木霉表达载体，为构建高产纤维素酶基因工程菌奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与载体 瑞氏木霉QM9414、绿色木霉Sn-9106、pET30-GFP质粒和pSK质粒载体由沈阳农业大学生物技术学院保存；pSM565质粒由沈阳农业大学生物技术中心提供；感受态细胞E. coli DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司；pMD19-T Simple Vector购自宝生物工程（大连）有限公司产品。
1.1.2 试剂 Taq DNA聚合酶、Long Taq DNA聚合酶等PCR试剂，质粒小量提取试剂盒，DNA Marker，潮霉素，IPTG，X-Gal均购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶，T4 DNA连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 cbhⅠ启动子、GFP基因、hph基因的克隆 根据GenBank NCBI上瑞氏木霉cbhⅠ启动子、GFP基因及hph基因序列设计引物如表1。提取瑞氏木霉基因组DNA[11]，并以基因组DNA为模板，PCR扩增克隆出cbhⅠ启动子。cbhⅠ启动子用二步法进行PCR扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s ，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，67 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。分别以pET30-GFP和 pSM565质粒为模板扩增出GFP基因、hph基因。GFP基因PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。hph基因PCR扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物回收后，与pMD 19-T Simple Vector连接，并送宝生物工程（大连）有限公司测序。
1.2.2 cbhⅠ启动子表达载体pSK-cbhⅠ的构建 将pMD 19-T-cbhⅠ用SacⅠ和EcoRⅠ双酶切，然后与经同样酶切的pSK载体连接，得到重组质粒pSK-cbhⅠ，转化E. coli DH5α感受态细胞。在含氨苄青霉素的培养基上随机选取白色转化子，小量提取制备转化子质粒用于酶切鉴定。
1.2.3 表达载体pSK-cbhⅠ-GFP-hph的构建 将pMD 19-T-GFP用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，与同样双酶切的重组质粒pSK-cbhⅠ连接，得重组质粒后，再以同样的方法将pMD 19-T-hph进行酶切和连接，构建表达载体pSK-cbhⅠ-GFP-hph。
1.2.4 绿色木霉表达载体pSK-cbhⅠ-GFP-hph的转化 绿色木霉Sn-9106原生质体的制备和转化参照文献[12]。将适量转化液涂布于再生培养基， 28 ℃培养12～16 h；在再生培养基上添加一层含75 μg/mL潮霉素的半固体丝状真菌MM培养基，28 ℃培养3～4 d；挑选潮霉素抗性转化子，接种于PDA斜面培养基上继续培养3～5 d；挑取斜面培养基上的绿色木霉制成水压片，在荧光显微镜下观察菌丝，选取有荧光的绿色木霉接种于MM液体培养基中，28 ℃、150 r/min培养3 d；利用PCR方法检测GFP基因。
2 结果与分析
2.1 cbhⅠ启动子、GFP基因和hph基因的克隆
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用Bio-Rad凝胶成像系统观察PCR扩增结果（图1-图3）。PCR产物电泳条带清晰完整，cbhⅠ启动子大小约为1 500 bp，GFP基因大小为726 bp，hph基因大小为1 026 bp，均与预期大小相符。测序后进行BLAST比对分析同源性分别达到96%、90%和92%。
2.2 绿色木霉表达载体pSK-cbhⅠ-GFP-hph的构建
将pSK-cbhⅠ-GFP-hph表达载体转化E. coli DH5α，在氨苄培养基上随机选取白色转化子，提取质粒后经酶切鉴定见图4。酶切产物大小与cbhⅠ启动子、GFP基因、hph基因片段大小相符。绿色木霉表达载体pSK-cbhⅠ-GFP-hph图谱如图5所示。
2.3 pSK-cbhⅠ-GFP-hph转化绿色木霉Sn-9106
将pSK-cbhⅠ-GFP-hph表达载体转化绿色木霉Sn-9106原生质体中，在含75 μg/mL潮霉素的培养皿上得到16个抗性转化子，利用表1中3对引物进行PCR检测，PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用Bio-Rad凝胶成像系统观察结果（图6）。由图6可知，cbhⅠ启动子、hph基因及GFP基因均已转化到绿色木霉中。将转化子单菌落经PDA培养基扩大培养后，制成水压片，在荧光显微镜下可观察到含有绿色荧光的菌丝（图7）。
3 小结
本研究利用pSK载体为骨架，构建了带有cbhⅠ启动子的pSK-cbhⅠ-GFP-hph表达载体，在荧光显微镜下观察到含有绿色荧光的菌丝，证实绿色木霉外源基因表达载体构建成功。虽然验证了绿色荧光蛋白的表达，但对于cbhⅠ启动子是否对外源基因启动了高效表达还有待进一步研究。丝状真菌纤维素酶表达系统表达出的酶为混合酶系，给分离纯化目的蛋白造成很大的障碍，而且丝状真菌纤维素酶启动子为诱导型，所以在利用丝状真菌作为纤维素酶表达宿主时，通常构建组成型表达载体。另外也有文献报道，以丝状真菌启动子构建载体表达外源蛋白，须在外源蛋白基因前加入信号肽。因此，下一步对瑞氏木霉cbhⅠ启动子的作用机制进行研究，并应用于对绿色木霉纤维素酶基因的改造。
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纤维素酶范文第8篇
关键词：苎麻；毛羽；刺痒感
中图分类号：TS123.2 文献标志码：A
The Research Progress of Eliminating Ramie Fabric Scratchiness
Abstract： The ramie fabric scratchiness has seriously limited the development of ramie in apparel field. This review introduced the methods of eliminating scratchiness in three aspects， including mechanical methods， chemical methods and biochemistry methods. In addition， principle and characteristics of these methods were compared and summarized.
Key words： ramie； hairiness； scratchiness
苎麻被称为“中国草”，是我国特有的纤维原料。在各种麻类纤维中，苎麻是品质最为优良的纤维，经过脱胶精练的苎麻纤维拥有丝一般光泽的外观，而且苎麻纤维具有轻盈的特点，不易被虫蛀和霉变。与同样是纤维素纤维的棉纤维相比，苎麻纤维的透气性比棉纤维高 3倍左右，穿着体感凉爽，吸湿性好，利于散热，适用于制作夏季高档服用面料。
苎麻纤维由于具有良好的吸湿排汗、透气凉爽等舒适性能和抑菌防蛀的功能性，因此广受消费者喜爱。但苎麻纤维外表平直粗硬，力大，弹性差，可纺性较差，延伸性小，织物易起皱起毛。另外，苎麻纤维较粗，刚度大，结晶度和取向度较高，表面具有长而且硬挺的毛羽，导致其在接触皮肤时会令人产生强烈的刺痒感，降低了其服用性能。这些因素在很大程度上影响了苎麻织物在纺织服装领域的应用与发展。为了提高苎麻面料的服用舒适性，消除此类织物在穿着时与皮肤接触产生的刺痒感，并且使其作为高档纺织面料在服用领域获得更好的使用和推广，国内研究人员进行了大量关于消除苎麻纤维刺痒感的探索研究。
1 苎麻织物刺痒感机理
在常见纤维中，苎麻纤维的抗弯刚度最大，纤维弯曲性能比较如表 1 所示。
苎麻纤维具有较高的轴向取向度，相应地，纤维的强度和初始模量也较高。苎麻纤维与棉纤维性能比较如表 2 所示。
织物刺痒性受许多因素影响，如：主体因素中的性别与年龄、皮肤表皮层的硬度与厚度、皮肤的润湿程度；环境的温度、湿度；织物和纱线的结构及对毛羽的约束作用，其中起决定作用的是突出于织物表面的毛羽。
由于苎麻纤维支数较低，抗弯刚度大，抱合力差，结晶度和取向度较高，轴向取向排列较整齐。根据细纱成纱结构分析，粗硬的苎麻纤维，因其弯曲刚度大，纤维在加捻过程中不易抱合，被卷入细纱内部时不均匀而被拉断劈裂，容易伸出在细纱表面而形成端毛羽。
由苎麻纤维为原料加工而成的贴身衣物在与皮肤接触时，位于织物表面的部分能承受较大弯曲载荷的毛羽，它们能够使皮肤产生一定的凹陷变形，从而刺激位于皮肤表层的痛觉感受器，当纤维作用于皮肤上的力大于0.75 mN时，且刺激源达到一定密度，分布在皮肤浅层的痛觉神经被激活，就会引起人体的刺痒感。织物表面毛羽刺扎皮肤示意见图 1。
不同形态的毛羽对人体产生的刺痒感有一定差异，毛羽的形态可分为 3 类：①端毛羽：纤维的头端突出在纱线表面。其中又包括两种情况，一种是纤维一端在纱线内部，另一端突出纱线表面的毛羽，另一种是纤维两端都突出在纱线外面，而纤维中间部分在纱线内部的毛羽；②圈毛羽：纤维两端都在纱线内部，呈圈状拱出纱线表面的毛羽；③浮游毛羽：纤维呈拱形或纤维头端附着在纱线表面，但纤维各部分都不在纱线内部。织物表面毛羽形态如图 2 所示。
2 消除苎麻织物刺痒感的方法
目前研究人员已研发出多种可以减轻乃至消除苎麻织物刺痒感的方法，这些方法大致可以分为 3 类：①减少织物表面毛羽数量和毛羽长度，如烧毛、剪毛和毛羽倒伏等；②降低织物毛羽刚度，使纤维变得柔软，可对苎麻织物进行酶洗；③钝化纤维突出端头，提高纤维表面的柔和性，此类方法可使用柔软剂或低温碱尿素法处理苎麻纤维表面。
2.1 烧毛与剪毛处理
烧毛、剪毛的出发点都是减少织物表面毛羽数量和毛羽长度，但是苎麻纤维的耐高温干热性能较差，容易导致烧毛不净，对织物主体造成损伤，使纤维脆损，手感发硬，所以在烧毛过程中应对其工艺流程进行优化，使烧毛质量得到提高。同时，此种处理方式效率低下，在减少毛羽数量时，由长毛羽变成的单根短毛羽抗弯刚度提高，刺痒感反而加剧，不能完全解决刺痒感问题。
曾庆福等从烧毛火口、冷却方式、刷毛质量、汽油汽化等 4 个方面，对苎麻织物烧毛工艺进行了探讨与优化，对LMH003-180烧毛机做了一系列改进，将苎麻织物的一次烧毛质量提高到了 4 级以上。
2.2 毛羽倒伏
毛羽倒伏法是利用粘合剂，经轧压、汽蒸交联等机械方法和物理化学方法使毛羽贴伏固定在织物表面，从而使挺直状毛羽数量减少，降低织物刺痒感。此方法存在的问题是很难实现表面毛羽倒伏的持久性，粘合剂的加入会破坏织物本身的优良性能。在实际操作过程中应注意使用的粘合剂的安全环保性，不能对人体造成危害。
2.3 柔软剂处理
把柔软剂覆盖在织物表面，形成的层能有效降低纤维之间的摩擦系数。柔软剂的使用提高了纤维的自由性，降低了表面毛羽滑移阻力，减少了对皮肤的刺扎冲击作用，从而消除苎麻织物刺痒感。张明明等利用N-甲基吗啉-N-氧化物（NMMO）处理苎麻纤维，处理后纤维的表面形态见图 3。
由图 3 可见，经NMMO 处理后的纤维表面相比原样的要光洁，这是因为纤维表面大部分残余的胶质被NMMO去除。由于NMMO分子中的强极性官能团N―O上的氧原子与纤维素大分子中的羟基之间的氢键作用，使得纤维晶区减少，无定形区增加，纤维刚度下降，织物变得柔软，刺痒感问题得到改善。
2.4 纤维素酶减量处理
苎麻纤维属于纤维素纤维，纤维素酶可以切断纤维素分子中的β-1，4糖苷键，在酶处理时，纤维素酶对结构松散的纱线，凸出在织物表面的毛羽、粗节很敏感，可使表面毛羽倒伏甚至断裂脱落，织物重量减轻，结构变得疏松柔软，刺痒感得到改善，处理后织物表面光洁，光泽度提高，抗皱性有所提高。
纤维素酶整理前后苎麻纤维纵向形态结构如图 4 所示。苎麻纤维经纤维素酶处理后，纤维表面被部分剥蚀，产生裂缝和微孔，纤维纵向裂纹加深，裂纹和孔洞的扩大导致苎麻织物拉伸断裂强力严重损失，纤维刚性下降，刺痒感也随之减轻。
王革x等用纤维素酶TZ25处理高支纯苎麻织物，并测试了一系列物理机械性能，在此处理过程中，由于纤维素酶会使纤维素降解，纤维素分子结构被破坏，会影响织物本身的优良性能，织物的断裂强力和撕破强力降低，刺痒感的改善是以损伤织物强力为代价的。
祝海霞等用活力为1 500 u/mL的纤维素酶对苎麻织物进行酶减量处理，并且分别讨论了不同染料和不同表面活性剂对纤维素酶作用的影响，实验发现反应型活性染料、阴离子型表面活性剂会抑制纤维素酶的催化作用。经过酶处理后的苎麻织物白度增加，表面毛羽有一定的减少，刺痒感改善，但撕破强力和弹性恢复性降低。
2.5 酶洗和砂洗结合
酶洗是利用酶的高效催化能力，在一定条件下，纤维素酶能使纤维素纤维中的β-1，4糖苷键水解，从而使纤维素分子的结晶区尺寸减小，聚合度降低，纤维的刚度降低，使织物变得柔软。砂洗是一种物理与化学相结合的处理方式，在织物处于松弛状态下，选择合适的膨化剂，同时通过机械摩擦作用使纤维表面毛羽产生疲劳损伤，进一步降低纤维的刚度，赋予织物柔软和舒适的手感。
钟安华等利用酶洗与砂洗结合处理苎麻织物，处理后毛羽头端钝化，织物变得柔和，表面毛羽明显减少，有效地改善织物的刺痒感与手感，但在此过程中，砂洗会导致纤维断裂，织物强力会大幅降低，刺痒感的改善与织物强力的破坏一直是一对不可协调的矛盾。
2.6 包缠法
包缠法控制苎麻织物纱毛羽的原理是把苎麻纱作为芯纱，通过外包缠纱（丝）的螺旋状缠绕，将芯纱表面的纱毛羽捆扎，使其倒伏紧贴于纱体，增加包缠捻度，从而减小了外包缠纱形成的螺旋线的螺距，提高了捆扎效果，因此毛羽减少的效果显著。包缠纱结构示意图如图 5 所示。
敖利民等利用空心锭包缠纺纱技术，以不会产生刺痒感的涤纶DTY 75 D/36 f和精梳棉纱60S作为外包纱，通过外包缠纱对苎麻纱的包缠，将苎麻纱表面的毛羽捆扎覆盖，可显著减少苎麻纱毛羽，在一定范围内增加包缠捻度，毛羽被捆扎得越紧，纱毛羽减少的效果越好。实验证明，双包包缠对毛羽的控制效果优于单包包缠，但部分较长且粗硬的毛羽可能会突破捆扎的约束，仍会伸出织物表面，成为刺激源。
2.7 纤维素酶与聚氨酯联合整理
经聚氨酯整理前后的苎麻纤维形态结构如图 6 所示。可见，聚氨酯可以在纤维或纱线表面固化形成聚氨酯薄膜，薄膜可以包覆表面凸起的毛羽，钝化织物表面毛羽，减弱了刺痒感，而且在部分纤维之间也形成了聚氨酯薄膜，表面变得滑顺。纤维素酶与聚氨酯联合整理的原理是纤维表面先被纤维素酶剥蚀，增加聚氨酯的可及度，聚氨酯与纤维的结合面也随之增大，提高了聚氨酯薄膜的包覆和交联作用，刺痒感改善显著。
李甜甜等用纤维素酶、聚氨酯对苎麻织物分别进行单独整理以及联合整理，结果表明，用纤维素酶-聚氨酯联合整理（先用纤维素酶整理，再用聚氨酯整理）苎麻织物刺痒感减弱效果最佳，其他性能也得到了一定程度的改善，但织物强力有一定的损失。
2.8 低温碱尿素法
氢氧化钠/尿素微溶解体系的溶解机理是氢氧化钠破坏纤维素的分子间氢键，尿素破坏纤维素分子内氢键，二者的协同效应能有效地使纤维素溶解，同时尿素能阻止纤维素凝胶的产生。该体系溶解能力强，工艺流程简单，是一种较为经济且对环境比较友好的纤维素溶剂。对苎麻纤维表面进行微溶解处理，使苎麻纤维表面的纤维素溶解，形成纤维素凝固层，毛羽消除，为获得良好的服用性能提供了可能。
闫畅把蒸馏水洗涤过的苎麻纤维放在的NaOH（7wt%）、尿素（12wt%）、Na2B4O7・10H2O（3wt%）和柔软剂（5wt%）的预冷冻处理液中，置以不同的温度和时间，通过改变纤维的表面形貌和组成部分等微观结构以及物理机械性能，实现消除苎麻织物刺痒感，且不会再次产生刺痒感，吸湿能力和染色性能有所提高，但苎麻纤维的拉伸应力有所降低。
3 结论
苎麻织物刺痒感产生的主要原因是织物表面突出的硬挺毛羽对皮肤的机械刺扎，国内外进行了大量关于消除刺痒感的研究，各类方法都在一定程度上改善了织物刺痒感。但是，烧毛与剪毛处理、砂洗和毛羽倒伏法不能彻底解决刺痒感问题；纤维素酶减量处理会破坏纤维的晶体结构和微观结构，导致本身的优良性能被破坏；包缠法减弱刺痒感效果显著，但部分毛羽可能会变成新的刺痒感刺激源；纤维素酶与聚氨酯联合整理和低温碱尿素法虽然实现消除苎麻织物刺痒感，且不会再次出现刺痒感，但纤维的拉伸应力降低，刺痒感的改善与织物强力的破坏一直是一对不可协调的矛盾。因此，就这一领域研究和寻求消除刺痒感同时保护织物强力的方法就显得十分必要。
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