蛋白质组学范文精选

1寻找差异表达的蛋白质

在疾病基因组的研究中,为了寻找差异表达的疾病相关基因或蛋白质,除了采用传统的分子生物学方法,如差减杂交[1]、抑制性差减杂交[2]、差异显示PCR法[3]及基因表达串联分析技术(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)[4]外,还可采用蛋白质组学的方法,即从蛋白质入手寻找新的或疾病相关基因或蛋白质。基因和蛋白质间并没有一一对应的关系,有mRNA,不一定能表达为有功能的蛋白质。但是,基因要表现其功能,一定要通过相应的蛋白质。所以,研究基因,特别是疾病相关基因,可从研究其表达蛋白质的结构或功能入手。常见的几种研究差异表达蛋白的蛋白质组学方法包括蛋白芯片技术、双向电泳技术、多维液相色谱技术以及它们和质谱鉴定的有机结合。

1•1蛋白质芯片技术

继基因芯片以后,蛋白质芯片技术逐渐发展起来。基因芯片又叫DNA芯片,是以DN段为材料的,而蛋白质芯片以蛋白质或多肽为材料。利用蛋白芯片技术能同时从微量的样品中检测成千上万个蛋白质或多肽,用于分析差异表达的蛋白质及药物靶标的鉴定,所以,蛋白质芯片在药物基因组学的研究中发挥着极为重要的作用。众所周知,蛋白质不如核酸稳定,在蛋白质样品的处理中将会遇到很多困难,对蛋白质芯片的操作将比对基因芯片的操作要求更为严格。从基因组测序知道,仅有约30000~35000个基因维持人体正常的生理作用[5],由于RNA编辑及翻译后修饰等因素,使得人体细胞的总蛋白质数目(蛋白质组)远远超过有活性的基因数目。因此,能同时检测成千上万蛋白质的蛋白质芯片技术,是唯一可用来有效研究人体蛋白质组的方法。目前,主要将蛋白芯片和表面增强的激光解吸离子化质谱技术(SELDI-MS)相结合寻找差异表达的蛋白质。其原理是将不同生理状态的样品(培养的细胞或组织样品)和同一蛋白芯片结合,洗去未结合的蛋白质,然后用SELDI-MS分析结合的蛋白质。一般来说,每种芯片可特异地结合某一细胞特定的蛋白质。具体的操作方法随不同厂家生产的蛋白芯片不同而异。LiX及其同事[6]将小鼠MRL的耳朵穿刺,观察耳朵上伤口愈合过程中蛋白质表达的变化情况,用蛋白芯片分析的结果表明,分子量为23•56ku的蛋白在伤口愈合过程中表达量大幅度增加,加速了伤口的愈合。尽管蛋白质芯片技术正逐渐得到广泛应用,但在应用于寻找差异表达蛋白时也有局限性:1)待检的低丰度蛋白往往被高丰度蛋白所掩盖而不能检测出来,2)蛋白质芯片系统对检测小分子量的蛋白有效,检测范围为10~30ku,但是10~30ku的蛋白只是占总蛋白的一小部分。

1•2多维分离技术对于复杂的蛋白质样品,比如特定组织或细胞中的所有蛋白质(蛋白质组),仅靠某一分离原理将它们分开是不可能的,而要利用蛋白质的不同性质将它们分离开,由此而发展起来的分离技术叫多维分离技术(multidimensionalseparation)。目前主要采用的是二维分离技术,因为对于大多数蛋白质的分离,采用蛋白质间某两个性质的不同,利用二维分离技术已足够了。其中,双向电泳技术和二维液相色谱以及它们和质谱的联用,已成为当今蛋白质组学研究的有力工具。

1•2•1双向电泳技术:双向电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)技术是80年展起来的一种有效的二维分离技术。其原理是基于不同蛋白质的等电点和分子量不同的特性,第一相是等电聚焦电泳,第二相是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。很多实验室利用不同的双向电泳技术建立了特定组织或细胞的双向电泳数据库(2DPAGE),以供不同的实验室检索和比较双向电泳图谱。SWISS-2DPAGE是一个经注释过的双向电泳公共检索数据库,其格式和SWISS-PROT蛋白序列数据库类似。在SWISS-2DPAGE数据库中包括蛋白质的双向电泳图谱(其中标明了蛋白质的具置)、建立图谱的具体方法和程序、以及相关的病理和生理数据。关于蛋白质的双向电泳数据可通过如下服务器进行检索:expasy•hcuge•ch/。在功能基因组时代,双向电泳技术除了用于分离复杂的蛋白样品,建立双向电泳数据库外,主要用于寻找不同组织或细胞中差异表达的蛋白质,以进行疾病相关蛋白或基因的研究。先用pH3-10的IPG胶条,对疾病组织和正常组织进行双向电泳分离,然后利用计算机软件对所产生的2-DE图谱进行分析,找出差异表达的蛋白。

如果想得到更为详细的2-DE图谱,可用pH4-7或pH6-9的胶条,甚至只有一个pH单位的窄pH范围的胶条,从而使分辨率大大提高。将找到的差异表达蛋白斑点从胶上切下来,经酶消化(常用胰蛋白酶),通过质谱(MS)或串联质谱(MS/MS)测定和数据库搜索,鉴定出所差异表达蛋白。然而,双向电泳技术有许多局限性,由于样品处理的差别、翻译后修饰、人为修饰等导致同一基因表达的蛋白质迁移到不同的位置;另外,不同的蛋白也会迁移到同一斑点,出现共迁移现象,从而使得用2-DE进行定性和定量分析变得相当复杂。而且,对于低丰度和低拷贝数蛋白的检测也相当困难。双向电泳要求操作者熟练掌握电泳、染色及软件分析技术,整个实验过程中要穿实验服,戴手套,尽量避免角蛋白等污染,才能得到较好的重复性。为了改进双向电泳的重复性和灵敏度,最近发展了一种荧光染料标记的双向电泳技术即凝胶内差别电泳(differentialin-gelelec-trophoresis,DIGE)[7]。

将样品和对照品分别用1-(5-羧戊基)-1′-丙基靛碳氰卤化物(Cy3)N-羟基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-propylindocarbocyaninehalinge(Cy3)N-hydroxy-succinimidylester]和1-(5-羧戊基)-1′-甲基靛碳氰卤化物(Cy5)N-羟基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindocarbocyaninehalinge(Cy5)N-hydroxy-succinimidylester]标记。在DIGE时,由于样品和对照在同一胶内分离,使用相同的内标,避免了使用不同凝胶时在操作上的偶然性和不平行性,可以准确检测出两个不同样品蛋白表达上的差别,消除胶与胶之间的差异,保证统计上的可靠性及操作上的重复性。荧光标记较其他染色方法灵敏度更高。与常规的双向电泳技术比较,DIGE更加简单,劳动强度大大降低,效率大大提高。

随着人类基因组图谱绘制的完成，生命科学进入了后基因组时代，因此，诞生了一门在蛋白质水平上的新学科“蛋白质组学”。随着蛋白质组学技术的飞速发展，以及用于蛋白质鉴定和功能推测的生物信息学的不断发展与完善，蛋白质组学已成为鉴定疾病相关标记和治疗靶点的有效工具，并对生命科学产生了深远的影响[1]。

为迎接更全面的生命科学的发展，提高生物科学专业学生适应学科发展的需要的能力，我们学院专门开设了针对生物科学专业的限选课程――蛋白质化学与蛋白质组学。本课程在介绍蛋白质化学基本内容的同时，兼顾学科发展动态，使学生掌握蛋白质组学的基本理论、基础知识、主要研究方法和生物信息学在蛋白质组学及蛋白质工程方面的应用及典型的研究实例，力求增长生物科学专业学生的专业知识与技能，为完成毕业论文设计及今后从事生命科学相关工作打下坚实基础。课程开课几年来，笔者及同教研室课题组对蛋白质化学与蛋白质组学课程的教学理念、教学内容、教学方法，教学效果评价方式进行了积极的实践与探索。

一 教师本身要努力提高教学质量

蛋白质化学与蛋白质组学的授课对象是生物科学专业本科三年级的学生。该阶段的学生面临毕业论文设计及准备考研两大难题，对此，本课程的教学目标应该是养成学生的科研思维，提高实验设计水平，培养其动手能力。这就要求教师必须更新教育理念，改变以往理论课单向授课的方式，要认识到此时的教学课程必须以学生为中心。因此，教师在精心准备教案讲义，认真制作多媒体课件的同时，应当思索如何灵活地运用各种教学方法，引导学生的兴趣，并使学生参与到教学过程中来。提高教师自身的理论水平和科研能力，改革教师课堂教学方法和教学结构，认真研究学生的认识规律和学习方式，培养学生的学习兴趣，充分调动学生的主观能动性是提高教学质量所必需的。在教学过程中，教师扎实的理论基础、丰富的科研经验、熟练的实验操作水平是引导教学成功的先决条件。

二 教学理念要转变，教学方式要灵活

“以学生为中心，以能力培养为导向”这一理念近年来备受教师关注和学生欢迎[2]。这一理念强调由教师引导，确定教学目标，学生为中心和主导，根据教学目标，主动收集整理资料，自主探究相关知识，发现问题，分析问题，解决问题，最后由教师总结，将学习的主动权真正交还给学生。这样，教师与学生在发现分析解决问题的过程中，各自完成教学任务，效率和认知度远超过以往单向的教授方式。

由于该门课程为限选课，选课学生维持在25～40人左右，因此，教师从备课开始就应以灵活的方式与学生去沟通。在课堂上，我们在进行多媒体教学的同时，增加与学生的互动，及时掌握学生的兴趣点与理解程度，可以充分调动学生的积极性。实践证明，教师更新教学理念，提高教学质量，对于端正学风，提高学生的积极性有着积极的作用。

生命科学是一门实践性很强的科学，因此理论与实践相结合是完成教学任务的必经之路。因此，笔者根据课程的教学内容和学生的理论水平及兴趣点，经常开展各种课间讨论，促进学生深刻并灵活地掌握知识。笔者常采用以下方式：首先，生命科学是一门发展迅速的科学，与医学、社会学等学科有交叉，且与我们的生活生产密切相关。因此，灵活地举例对于培养学生的学习兴趣显得十分重要。例如，北京蛋白质组学研究中心是我国蛋白质组学国家重点实验室，作为国际人类肝脏蛋白质组计划实行总部，目前该中心已成功鉴定人类肝脏蛋白质13000余种，并绘制了高可信度的肝脏蛋白质互作图谱，发现了58种潜在的肝脏疾病候选基因等。像常见的脂肪肝、肝炎病毒感染、肝癌癌变及转移等标志蛋白质陆续被发现，为今后肝脏相关疾病的预防及治疗打下了坚实的基础。通过这一举例，既能够增强学生对蛋白质组学的认可度，且因为该项目为我国自主研究项目，能够为学生提供今后科研的方向，也能增强学生的科研信心。其次，安排学生参加教学实验或科研实验，引导学生有意识地学会科研思维，激发学生学习兴趣，培养其分析问题和解决问题的能力。例如，通过让学生参与笔者主持或参与的科研课题，了解科研实验的实施过程，在此过程中理解并掌握所学知识。再次，指导学生进行实验设计和科研设计，培养其科研能力。例如，让学生根据需解决的科研问题和掌握的实验方法等，指导其通过参考文献等方法进行初步的实验设计及课题研究报告的撰写。近年来，笔者已指导学生撰写科研课题研究报告多项，并获学校及学院立项，极大地提高了学生的信心和兴趣。此外，为了提高课程的实用性，提高学生的动手能力和解决问题的能力，笔者所在学院开设了开放实验课程，我们鼓励学生主动地进行实验设计，习得相应的实验技能。

1寻找差异表达的蛋白质

在疾病基因组的研究中,为了寻找差异表达的疾病相关基因或蛋白质,除了采用传统的分子生物学方法,如差减杂交[1]、抑制性差减杂交[2]、差异显示PCR法[3]及基因表达串联分析技术(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)[4]外,还可采用蛋白质组学的方法,即从蛋白质入手寻找新的或疾病相关基因或蛋白质。基因和蛋白质间并没有一一对应的关系,有mRNA,不一定能表达为有功能的蛋白质。但是,基因要表现其功能,一定要通过相应的蛋白质。所以,研究基因,特别是疾病相关基因,可从研究其表达蛋白质的结构或功能入手。常见的几种研究差异表达蛋白的蛋白质组学方法包括蛋白芯片技术、双向电泳技术、多维液相色谱技术以及它们和质谱鉴定的有机结合。

1•1蛋白质芯片技术

继基因芯片以后,蛋白质芯片技术逐渐发展起来。基因芯片又叫DNA芯片,是以DN段为材料的,而蛋白质芯片以蛋白质或多肽为材料。利用蛋白芯片技术能同时从微量的样品中检测成千上万个蛋白质或多肽,用于分析差异表达的蛋白质及药物靶标的鉴定,所以,蛋白质芯片在药物基因组学的研究中发挥着极为重要的作用。众所周知,蛋白质不如核酸稳定,在蛋白质样品的处理中将会遇到很多困难,对蛋白质芯片的操作将比对基因芯片的操作要求更为严格。从基因组测序知道,仅有约30000~35000个基因维持人体正常的生理作用[5],由于RNA编辑及翻译后修饰等因素,使得人体细胞的总蛋白质数目(蛋白质组)远远超过有活性的基因数目。因此,能同时检测成千上万蛋白质的蛋白质芯片技术,是唯一可用来有效研究人体蛋白质组的方法。目前,主要将蛋白芯片和表面增强的激光解吸离子化质谱技术(SELDI-MS)相结合寻找差异表达的蛋白质。其原理是将不同生理状态的样品(培养的细胞或组织样品)和同一蛋白芯片结合,洗去未结合的蛋白质,然后用SELDI-MS分析结合的蛋白质。一般来说,每种芯片可特异地结合某一细胞特定的蛋白质。具体的操作方法随不同厂家生产的蛋白芯片不同而异。LiX及其同事[6]将小鼠MRL的耳朵穿刺,观察耳朵上伤口愈合过程中蛋白质表达的变化情况,用蛋白芯片分析的结果表明,分子量为23•56ku的蛋白在伤口愈合过程中表达量大幅度增加,加速了伤口的愈合。尽管蛋白质芯片技术正逐渐得到广泛应用,但在应用于寻找差异表达蛋白时也有局限性:1)待检的低丰度蛋白往往被高丰度蛋白所掩盖而不能检测出来,2)蛋白质芯片系统对检测小分子量的蛋白有效,检测范围为10~30ku,但是10~30ku的蛋白只是占总蛋白的一小部分。

1•2多维分离技术

对于复杂的蛋白质样品,比如特定组织或细胞中的所有蛋白质(蛋白质组),仅靠某一分离原理将它们分开是不可能的,而要利用蛋白质的不同性质将它们分离开,由此而发展起来的分离技术叫多维分离技术(multidimensionalseparation)。目前主要采用的是二维分离技术,因为对于大多数蛋白质的分离,采用蛋白质间某两个性质的不同,利用二维分离技术已足够了。其中,双向电泳技术和二维液相色谱以及它们和质谱的联用,已成为当今蛋白质组学研究的有力工具。

1•2•1双向电泳技术:双向电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)技术是80年展起来的一种有效的二维分离技术。其原理是基于不同蛋白质的等电点和分子量不同的特性,第一相是等电聚焦电泳,第二相是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。很多实验室利用不同的双向电泳技术建立了特定组织或细胞的双向电泳数据库(2DPAGE),以供不同的实验室检索和比较双向电泳图谱。SWISS-2DPAGE是一个经注释过的双向电泳公共检索数据库,其格式和SWISS-PROT蛋白序列数据库类似。在SWISS-2DPAGE数据库中包括蛋白质的双向电泳图谱(其中标明了蛋白质的具置)、建立图谱的具体方法和程序、以及相关的病理和生理数据。关于蛋白质的双向电泳数据可通过如下服务器进行检索:expasy•hcuge•ch/。在功能基因组时代,双向电泳技术除了用于分离复杂的蛋白样品,建立双向电泳数据库外,主要用于寻找不同组织或细胞中差异表达的蛋白质,以进行疾病相关蛋白或基因的研究。先用pH3-10的IPG胶条,对疾病组织和正常组织进行双向电泳分离,然后利用计算机软件对所产生的2-DE图谱进行分析,找出差异表达的蛋白。

如果想得到更为详细的2-DE图谱,可用pH4-7或pH6-9的胶条,甚至只有一个pH单位的窄pH范围的胶条,从而使分辨率大大提高。将找到的差异表达蛋白斑点从胶上切下来,经酶消化(常用胰蛋白酶),通过质谱(MS)或串联质谱(MS/MS)测定和数据库搜索,鉴定出所差异表达蛋白。然而,双向电泳技术有许多局限性,由于样品处理的差别、翻译后修饰、人为修饰等导致同一基因表达的蛋白质迁移到不同的位置;另外,不同的蛋白也会迁移到同一斑点,出现共迁移现象,从而使得用2-DE进行定性和定量分析变得相当复杂。而且,对于低丰度和低拷贝数蛋白的检测也相当困难。双向电泳要求操作者熟练掌握电泳、染色及软件分析技术,整个实验过程中要穿实验服,戴手套,尽量避免角蛋白等污染,才能得到较好的重复性。为了改进双向电泳的重复性和灵敏度,最近发展了一种荧光染料标记的双向电泳技术即凝胶内差别电泳(differentialin-gelelec-trophoresis,DIGE)[7]。将样品和对照品分别用1-(5-羧戊基)-1′-丙基靛碳氰卤化物(Cy3)N-羟基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-propylindocarbocyaninehalinge(Cy3)N-hydroxy-succinimidylester]和1-(5-羧戊基)-1′-甲基靛碳氰卤化物(Cy5)N-羟基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindocarbocyaninehalinge(Cy5)N-hydroxy-succinimidylester]标记。在DIGE时,由于样品和对照在同一胶内分离,使用相同的内标,避免了使用不同凝胶时在操作上的偶然性和不平行性,可以准确检测出两个不同样品蛋白表达上的差别,消除胶与胶之间的差异,保证统计上的可靠性及操作上的重复性。荧光标记较其他染色方法灵敏度更高。与常规的双向电泳技术比较,DIGE更加简单,劳动强度大大降低,效率大大提高。

摘要：通过对中医证本质研究现状的分析，引入蛋白质组学的研究方法，认为蛋白质组学方法在证本质研究中从认知上和技术上都是可行的，有独特的优势；并提出了方证结合、以方测证、以方验证等研究思路与途径。

关键词：蛋白质组学；证本质；方证结合

中图分类号：R2－03　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2008)07－1551－03

1　证本质研究的现状

证是中医辨证论治的核心，是理法方药一脉相承的桥梁和关键，多年来一直是中医研究现代化的突破口。人们普遍认为，抓住了证的研究，就抓住了中医现代化研究的瓶颈。其中证本质的研究是近年来中医学者瞩目的专题，也一直是中医学术界研究的热点，人们试图超越疾病探求证的本质，寻求证的客观指标，认为只要发现和证实了与证有关的特异性物质成分，便揭示了证本质，便可对证进行客观的解释和度量，并可实现中、西两种医学本质上的交汇与融合。

因此自20世纪50年代，在中医界全面开展了一场轰轰烈烈的证本质研究，取得了一定的成绩，主要表现在：根据中医文献及临床资料，明确病、证、症的关系，制订某些证的诊断标准，使辨证达到规范化，并将现代医学的实验指标结合到证的研究标准之中；由传统的对临床病人的研究，发展为结合证的动物模型，通过动物模型的研究来与人的辨证研究对照。并结合临床流行病学研究，在脏腑病证的规范化、标准化方面进行了一定探讨。

虽然我国在中医证的本质研究方面取得了不少成绩，但是我们并没有揭示证的本质，主要表现在：证候实质研究的传统目标是追求研究指标的高特异性，而其研究结果的特点却恰恰是弱特异性；动物模型研究的局限性；研究思路的片面性等。

2　蛋白质组学简介

文章编号：1009-5519（2007）05-0784-02 中图分类号：R19 文献标识码：B

过去蛋白质研究的根本缺陷在于孤立地研究单个蛋白质的结构、功能、表达以及与疾病的关系。但是，人体或自然界的生物并不仅仅是各种蛋白质的混合物，而是一个统一的整体。一种蛋白质的缺陷可能导致其它相关蛋白质含量的改变，或者由其它的蛋白质加以代偿。因而从单一蛋白质出发，无论是进行疾病的论断还是生物技术，都将是不全面的。更何况许多疾病或生命现象是多基因产物的结果，单纯的遗传分析很难诊断多因素的疾病复杂的基因间相互作用，因而必须充分认识细胞内不同的蛋白质是如何相互作用、相互协调的。而这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。在此背景下，蛋白质组学(pr-oteomics)应运而生。

1 蛋白质组学的概念

蛋白质组(proteome) 一词，源于蛋白质( PROTEin) 与基因组( genOME) 两个词的结合, 最早由澳大利亚学者Wilkins和Willian等人于1994 年提出,是指基因组所表达的全部蛋白质。它与基因组相对应,也是一个整体的概念。从这个定义看，蛋白质组内蛋白质的数目应该等于基因组内编码蛋白质的基因(准确地说应为开放阅读框，ORF) 的数目，但在生物体内这样的蛋白质组是不存在的。 基因组是静态的，一个生物体的基因组在其一生中基本上是稳定不变的。但基因组内各个基因表达的条件和程序则是随时间、地点和环境条件而变的，因而它表达的产物的种类和数量随时间、地点和环境条件而变化。从基因表达的角度看，蛋白质组内蛋白质的数目总是少于基因组中ORF的数目，但从蛋白质修饰的角度看，蛋白质组的蛋白质的数目又远远大于这个数字。因为mRNA 的剪切和编辑可使一个ORF 产生数种蛋白质，蛋白质翻译后的修饰，如糖基化、磷酸化同样增加了蛋白质种类。朊病毒学说认为一级结构相同的蛋白质在一定条件下可以形成不同结构的蛋白质，从结构上进一步丰富了蛋白质种类的概念。因此，蛋白质组的概念也被定义为在一个细胞内存在的全部蛋白质。 基因组基本是固定不变的，蛋白质组却是动态的，具有时空性和可调节性，能反映出特定基因的表达时间、表达量以及蛋白质翻译后的加工修饰和亚细胞分布等。 它是在人类基因组计划研究发展的基础上形成的新兴学科。

蛋白质组学就是研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律[1～3]。与以往蛋白质化学的研究不同，蛋白质组研究的对象不是单一或少数的蛋白质，它着重的是全面性和整体性，需要获得体系内所有蛋白质组分的物理、化学及生物学参数，如分子质量、等电点、表达量等，以及细胞内蛋白质之间的相互作用。主要在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、结构及其活动规律。它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等，最终揭示蛋白质功能，是基因组DNA 序列与基因功能之间的桥梁。

2 蛋白质组学研究的重要工具

如何同时测定一个生物中大量或全部基因的表达可以通过引入cDNA和寡核苷酸微阵列得以解决。用DNA微阵列和相关方法分析基因表达依赖于两个重要工具：PCR和寡核苷酸与互补序列的杂交。但是蛋白质没有PCR等价物，且不能专一性与互补氨基酸序列杂交。另外由于翻译后修饰使得许多蛋白质以多种形式存在，检测和区分特定基因的多种蛋白质产物时蛋白质组学在分析方面更具挑战性。尽管存在上述困难，但由于几种重要工具的发展和结合使用给研究人员提供了灵敏度和专一性较高的识别和鉴定蛋白质的方法。

第一种必需工具是蛋白质的分析分离技术。蛋白质组学中蛋白质分离有两个目的。一是将蛋白质混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂蛋白质混合物。二是蛋白质的分离分析可以比较两个样品蛋白质的不同表观，研究者可以标记用于分析特定的蛋白质。双向凝胶电泳（two-dimensional electrop-

【摘要】 作为后基因组时代的一门新兴科学-蛋白质组学在生命科学研究中展示出前所未有的优势。中医证候是辨证论治的基础和核心，对证候本质的研究是中医药现代化研究的关键问题之一。将蛋白质组学引入中医证候分类及证候演变规律的研究，对从分子生物学水平探讨中医学与蛋白质组学是必须的。借助蛋白质组学研究的技术和方法，对中医"证候"进行研究，为从整体蛋白质表达的水平上阐明证候的本质及中医诊疗的分子机理，发展中医药学，走中医药现代化之路奠定了基础。

【关键词】 蛋白质组学；中医证候；中医诊疗；中医药现代化

随着人类基因组序列的完成，人类已经由基因组时代进入后基因组时代。基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性使基因组学研究成功迈入到功能基因组学研究。蛋白质组学遂成为后基因时代的研究前沿和热点领域。将蛋白质组学引入中医证候学研究，必将进一步为证候分类、辩证标准的选择和个体化等提供可靠的依据，对于发展中医药学，走中医药现代化之路具有深远的影响。本文综述了蛋白质组学研究的主要关键技术及其与中医证候学研究的相关性。

1蛋白质组及蛋白质组学

1994年澳大利亚的Wilkin和Williams等第一次提出了蛋白质组（Proteome）概念[1、2]，指由一个基因组，或一个细胞、组织所表达的全部蛋白质。蛋白质组学（Proteomics）以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质间相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律[3]。蛋白质组研究是为了识别及鉴定一个细胞或组织所表达的全部蛋白质以及它们的表达模式，是对基因组研究的重要补充，是生物体在蛋白质水平上定量、动态、整体性的研究[4]。蛋白质组研究数据与基因组数据的整合，将在后基因组研究中发挥重要作用。

2蛋白质组学研究技术

2.1双向凝胶电泳技术

1975年，意大利生化学家O’Farrell在对大肠杆菌、老鼠及几尼猪的蛋白质研究中，发明了双向电泳技术[5]（ISO-DLAT），具有高分辨率、快速、简便等优点。双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一，其原理是在相互垂直的方向上，它利用蛋白质等电点和分子量的不同运用等电聚焦和聚丙烯酰胺凝胶电泳把复杂的蛋白质混合物在二维平面上分离。

蛋白质组学(proteomics)是以全面的蛋白质性质研究(如表达水平、转录后修饰、细胞内定位、相互作用等)为基础,在蛋白质整体水平上对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学,已被认为是理解细胞功能和疾病发生过程的核心[1-3]。自1994年Wilkins和Williams首次提出了蛋白质组(proteome)概念以来,蛋白质组学技术已成为后基因组时现疾病相关蛋白、寻找早期诊断标记和揭示致病机制的有力工具[4],并取得了一系列巨大的成就。近年来蛋白质组学已在人类疾病研究中得到广泛的应用,但在动物医学中的应用较为有限,目前主要集中在疫苗和药物开发领域[4-5]。本文就当前蛋白质组学在某些动物疾病研究中的应用及现状进行综述并分析其发展趋势,以期对利用蛋白质组学工具研究动物疾病的研究者有所启发。

1蛋白质组学常用研究技术

蛋白质组学技术主要包括基于二维电泳(two-dimensionelectrophoresis,2DE)、高效液相色谱(highperfoemanceliquidchromatography,HPLC)等蛋白质分离技术;与数据库搜索相结合的同位素标记定量质谱(isotope-codedaffinitytag)、荧光差异凝胶电泳(differenceingelelectrophoresis,DIGE)表面增强激光解吸/离子化飞行时间质谱(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,SELDI-TOFMS)、电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)等蛋白质定量和鉴定技术[6]。近年来蛋白质组学技术在疾病研究方面表现出了独特的优越性并取得了显著的成绩。

2蛋白质组学在动物细菌性疾病研究中的应用

蛋白质组学在动物细菌性疾病中研究范围涉及细菌在不同环境下蛋白表达谱的变化、筛选疫苗候选蛋白以及鉴定与细菌的致病及耐药机制相关蛋白质蛋白质[7]。在完成羊种布鲁菌强毒株16M蛋白质组表达图谱的基础上,比较了牛源布鲁菌强毒株和疫苗株蛋白质组差异。结果表明,强弱毒菌株在铁代谢、糖结合、脂代谢及蛋白合成等方面有一定差异,从分子水平上解释了强弱毒菌株在代谢途径上的关键区别[8]。陈焕春等以2006年引起人发病死亡的2型猪链球菌(SS2)的四川分离株SC-21为研究对象,利用蛋白质组学技术研究了其在37℃(对照条件)和42℃(模拟发病猪的体温)培养条件下的分泌蛋白图谱的差异,并鉴定了5个差异蛋白,为揭示SS2的致病机理、筛选药物靶标以及新型疫苗的研究提供了部分依据[9]。刘国勇等[10]利用蛋白质组学技术分析柱状黄杆菌强毒株G4R3和弱毒株G18的胞外蛋白,共发现了34差异蛋白质点,鉴定出其中的7个蛋白点,分析后认为滑动蛋白K、腺酐甲硫氨酸合成酶和膜蛋白可能是柱状黄杆菌的毒力因子。TavernaF等[11]建立了奶牛炎病原金黄色葡萄球菌细胞表面可溶性蛋白2-DE参考图谱,为比较金黄色葡萄球菌不同菌株对奶牛的致病性和分析鉴定疫苗候选抗原奠定了重要基础。ZicbandtAK等[12]对两株不同的金黄色葡萄球菌RN6390和Col株研究发现发现葡萄糖激酶和脂肪酶蛋白质点存在于RN6390菌株中,而IgG结合蛋白、肠毒素、白细胞毒素D、肠毒素B等9种蛋白质点只存在于Col菌株中存在,为深入研究金黄色葡萄球菌的耐药机制和致病机制奠定了分子基础。

3蛋白质组学在动物病毒性疾病研究中的应用

蛋白质组学在动物病毒性疾病中的研究主要集中在病毒感染后诱导宿主细胞蛋白质组改变以及病毒感染的宿主血清/血浆差异蛋白质组研究等方面,如为揭示PK-15细胞感染CSFV后蛋白质组的变化,利用蛋白组学技术从感染48h的细胞中寻找并鉴定了35个差异表达蛋白质点。Westernblot分析证实了膜连蛋白2上调表达,甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH)下调表达[13]。这些差异表达的蛋白是PK-15细胞对CSFV感染的特征性反应,有助于进一步研究CSFV的感染机理。进一步对感染CSFV猪血清进行了差异蛋白质组分析,鉴定了14种差异表达蛋白,其中的急性期蛋白接联珠蛋白(haptoglo-bin)、补体成分C4a、载脂蛋白A-1(apolipoproteinA-1)已被鉴定为其他疾病如乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染或相关癌症的潜在生物标记[14]。同样,鉴定的这些蛋白具也有作为CS-FV感染生物标记的潜能。DhingraV等[15]研究发现,野生型狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)感染能诱导与离子平衡有关的蛋白H+ATP酶和Na+/K+ATP酶上调表达,而Ca2+ATP酶下调表达,这些参与突触泡与突出前膜对接或融合的相关蛋白下调表达会导致细胞内Na+和Ca2+浓度降低和感染鼠的前联会积聚大量突出泡,而弱毒RV感染没有类似现象,这可能是野生型RV致神经机能障碍的机制。另外还发现,弱毒RV感染介导凋亡相关蛋白上调表达,而野生型RV没有这种现象,这一发现解释了仅有弱毒RV感染才能诱导细胞凋亡的分子机制。王娜[16]利用蛋白质组学技术分析了猪繁殖与呼吸综合征病毒071030株和福州株接种Marc-145细胞后蛋白质组学差异,为进一步研究PRRSV毒株间的致病力差异提供了分子基础。ZhangX等[17]用蛋白质组学相关技术发现在PCV-2感染PK15细胞后α微管蛋白、β肌动蛋白、及细胞角蛋白8发生了变化,为进一步理解PCV-2与宿主的相互作用奠定了基础。

4蛋白质组学在动物寄生虫病研究中的应用

作者：王特樟 李宏吉 郭静璇 王彦波 单位：浙江工商大学食品与生物工程学院海洋资源与营养生物学研究中心

现代质谱技术作为蛋白质组学支撑技术之一，在蛋白质和肽段的鉴定、定量和结构分析方面起着非常重要的作用。质谱分析进行蛋白质鉴定和序列测定的基本原理是使用电喷雾离子化和基质辅助激光解吸离子化的软电离方法，经酶切后的蛋白质肽段或完整蛋白质带上电荷，然后根据不同离子间的质荷比的差异来分离并确定相对质量。样品分子进行上述方法电离时能保留整个分子，确保了完整性而不会形成碎片离子，称为肽质量指纹图谱（PMF）技术。PMF是一种现在运用最广的用来鉴定2-DE分离出来的蛋白质和肽的方法，伴随着现代质谱技术的不断发展，其在蛋白质组学中的应用将越来越广泛。

高效液相色谱及多维液相色谱高效液相色谱（HPLC）技术最初被用于分离蛋白质或多肽。现在，HPLC已成功应用于蛋白质组学研究中，它是基于样品分子在固定相（柱填料）和流动相（淋洗液）间的特殊相互作用而实现样品分离的。无须变性处理样品，可实现上样收集及在线分析的自动化。利用液相色谱结合电喷雾质谱（ESI-MS）而不依赖于2-DE，也可以分析磷肽或糖肽，先由特异性的胰蛋白酶消化，产生的多肽由强阳离子交换柱和反相HPLC分离后经ESI-MS/MS分析。液相色谱与MS联用，采用高速且高灵敏度的色谱分离法来代替耗时的2-DE蛋白质分离法，故其与经典的2-DE-MS法相比，具有快速、样品需要量少和多肽分离的通用性强等优点，将会在不同酪蛋白形式的分子特性描述中得到更进一步的应用。但由于层析填充物对许多蛋白质组分有吸附作用，且难以实现多组分蛋白质样品的多维层析，因此仅适用于研究单一蛋白质或简单样品蛋白质组。多维液相色谱（MLC）则是利用与串联质谱联用，可以检测低丰度肽段，是目前蛋白质组学研究最新的技术，可快速并高通量鉴定复杂蛋白质混合物。

蛋白质组学技术在畜禽动物营养学中的应用

传统肉类生产中的饲养管理、饲料结构、饲喂方式和饲养密度在基于动物营养和饲料工业的现代肉类生产的出现后，发生了本质性的改变。同时，大规模的现代肉类生产影响到了饲养动物的生理学、行为学和生物化学过程，随之导致了肉品品质的下降。同时生产者为了增大产量和减少疾病风险，在养殖过程中滥用抗生素等化学药物，加剧了肉类品质的恶化。此外，为了追求提高肉类的某些性能，忽视了饲养动物的体质健康、外部形状与内在机能的协调，生理学的平衡和整体适应性，从而导致现代肉用动物（猪和鸡）对周围环境条件的高度敏感性，最终导致了肉品的食用品质，如：色泽、风味和嫩度等下降，PSE肉的比例升高，肉中的抗生素残留现象极为突出。鉴于此，对肉品品质进行评价并对其进行可能的等级标注及对其生产过程控制，对于现代肉品生产至关重要。蛋白质是肌肉组织的重要组成成分，研究表明：肉类品质研究与功能蛋白质的结构研究间密不可分，蛋白组变化可能与肉的嫩度相关。肌纤维分红肌纤维和白肌纤维2种类型，这2种类型在代谢水平上存在着结构和功能的差异。纤维类型与肉质性状，如：性、风味和嫩度等的关系存在着很多争议，尤其是纤维类型对肉嫩度的影响仍然不清。Lametsch等首次利用蛋白质组学分析屠宰后猪肌肉的变化情况，采集了刚屠宰至屠宰后48h的肌肉蛋白质组样品，这些肌肉蛋白质相对分子质量介于5000~20万不等，pH在4~9，结果发现蛋白质组模式发生了15种显著的变化。此后的研究中Lametsch等最终确定了可作为肉品质标记的20多种蛋白质，包括结构蛋白质（肌动蛋白、肌球蛋白和肌钙蛋白）和代谢酶（肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶）。在这些标记蛋白中，人们发现肌动蛋白和肌球蛋白重链与肌肉的剪切力间存在极显著的相关，这就清楚地表明屠宰后肌动蛋白和肌球蛋白重链的降解会影响肉的质量。Remignon等直接对肌肉蛋白质片段进行分析，认为蛋白质的改变很可能是导致家禽PSE肉综合征的直接原因。Molette等研究发现火鸡屠宰后胸肌糖酵解的速度比较快（屠宰后每20minpH比正常的多下降0.5），从而使得肉品质发生改变，如：系水力下降、加工产量降低和嫩度降低等。同样报道了糖酵解快的动物肉的系水力低，并且提取到的肌浆蛋白含量低，这表明当pH下降的速率加快时蛋白质功能发生了改变。

蛋白质组学技术在水产动物营养学中的应用

蛋白质组学方法在水产动物营养特别是鱼的品质鉴定中已有应用，目前也被广泛应用到了对虾和海蜇等的品质控制中。随着对鱼类水产品的需求日益增长，保障和控制其安全生产具有重要的意义。在以数量增长为主的水产集约化养殖、运输和销售过程中，拥挤应激是常见的影响水产品食用品质的因素，解冻程序同样深刻地影响水产的品质。近年来，蛋白质组学已被广泛地应用到了水产品品质控制。Inger等利用2-DE技术研究新鲜的鳕鱼与死后鳕鱼肌肉，发现有11个蛋白质点的丰度发生了变化，其中8个蛋白质点的丰度显著增加，后续分析表明：这些蛋白质点是肌原蛋白、肌浆蛋白和肌肉纤维等肌肉组织的分解产物。由此可见，蛋白质组学技术对评价鱼肉鲜度等品质具有重要的现实意义。Kjaersgard等通过对11种不同冷冻储存条件下对鳕鱼肌肉蛋白质图谱进行研究分析，发现不同冷冻储存温度对蛋白质图谱并无显著影响，但经过不同的冷冻储存时间（3、6和12个月），肌浆球蛋白轻链、磷酸丙糖异构酶、醛缩酶A和2-α肌动蛋白片段等蛋白质的质量浓度发生了显著变化，从而导致鱼肉的质地和味道发生了变化。Martinez等通过研究人工养殖的鳕鱼与野生的鳕鱼，比较发现人工养殖的鳕鱼2-DE图上蛋白质相对分子质量在3.5万~4.5万间存在显著差异。然而目前蛋白质组学技术在水产养殖和贮藏加工过程中的研究还处于起步阶段，随着相关技术的发展，将在水产动物营养中起到更加重要的作用。

前景展望

摘要：本文主要概述了中医证候学与蛋白质组学结合的原理，回顾了近5~10年来蛋白质组学技术在中医证候学中的应用，并对未来中医证候蛋白质组学的发展进行展望。拓展了蛋白质组学在中医学方面的应用领域，从新的视角阐释中医理论的内涵。

关键词：中医证候； 蛋白质组学； 中医基础研究

Application of Proteomics in the Field of TCM Syndrome

HONG Ming-chao1,MAO Zhu-jun2

(1.Putuo District Shiquan Street Community Health Service Center,Shanghai 200061,China;2.Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200033,China)

Abstract：This paper summarized the main TCM Syndromes of combination principle and proteomics, reviewed the application of proteomics technology in the TCM syndromes in 5~10 years, and the future development of Chinese medicine syndrome proteomics prospect. Expand the application fields of proteomics in medicine, explain the meaning of the theory of traditional Chinese medicine from a new perspective.

Key words：TCM syndromes; Proteomics;Basic research of traditional Chinese Medicine

证候是中医学的重要内容，指导着中医对疾病发生、发展及其表现的认识,是认识疾病和辨证论治的主要依据。中医证候研究的关键在于从不同的疾病或同一疾病的不同病理阶段找出共同的病理环节，寻找证候的物质基础和发生机理。近年来，中医证候学的发展和蛋白质组学进行交叉，以其独特的理论与视角, 给中医理论赋予现代最前沿的科学内涵。

摘 要： 蛋白质组学是一门新兴的交叉性学科，在医学和生物学各领域都有广泛的应用。本文结合师范类院校学生的培养特点，对该课程的教学目标和教学内容进行了深入分析，并着重提出了相关的教改措施，包括以多媒体授课方式为主，强调学生动手实验操作与教师录像演示方法相结合，教学双边活动的有效组织与考试形式的改进等方面。以期学生能够从整体上掌握这门课程，熟悉相关科学前沿，拓宽视野，最终提高自己的教育教学水平，促进自身和职业的发展。

关键词： 蛋白质组学 教学改革 多媒体教学

自1995年基因组计划的大规模开展以来，我们得到了前所未有的海量遗传信息。但是，对这些遗传信息如何进行解读，包括：基因的识别，基因时间、空间表达特异性的调控，多个基因产物之间的相互关系，等等，都需要通过研究具体的生物功能的体现者和执行者――蛋白质，才能最终揭示生命活动的真谛。正因为如此，蛋白质组学（Protemics）研究成为后基因组学（post-genomics）即功能基因组学（functional genomics）中的中流砥柱。Nature和Science杂志也在2001年2月公布人类基因组草图的同时，分别发表了“And now for the proteome”与“Protemics in genomeland”的综述，将蛋白质组学的研究提到了前所未有的高度。陕西师大生命科学学院积极设立蛋白质组学这门课程，并将它设置为生物技术专业的限选课及生物科学和理科基地专业的专业任选课。

蛋白质组学（Protemics）是一门交叉型的新型学科，涉及生物化学、分子生物学、基因学、细胞学及生物信息学等多种学科的知识点。同时它又是一门理论与实践紧密结合的课程，涉及较多的新型实验原理与方法，比较抽象，相对较难理解。综合考虑之后，学院将该课程的授课时间设置为大三学年的第二学期，一方面学生已经学习了各种基础专业课程，具备了一定的知识储备，另一方面经过多种学科配备的实验课程学习，学生具备了一定的实验操作技能及科学思考方法。

师大设置该课程已经有近6年的历史了，通过这几年的课程教学，我在该课程的教改方面也进行了思索，有了一些心得体会。我在此抛砖引玉，与广大同仁共同探讨。

一、蛋白质组学的教学目标

蛋白质组学一词由澳大利亚科学家Marc Wilkins于1994年在意大利Siena的一次二维电泳会议上首次提出。1997年之后，各国科学家慢慢重视并开展了广泛研究。虽然蛋白质组学的发展历史非常短暂，但其研究内容非常前沿。

目前，国家提出高校教改应注重学生的素质教育。有学者提出，素质教育与教学过程的融合是大学教学改革的关键，而构建科学合理的培养方案是“融合”的基础；其中重要的一项措施就是“注重学科交叉”。教师要做到给学生传授整体性的知识，同时注重其他学科知识对本学科的影响，以及在本学科领域中的应用；更要在知识的精选和交叉融合上下工夫，搞好知识的整体优化。在授课过程中，切忌简单地照搬、机械地设置相关专业的课程［1］。